高效液相色譜法知識匯總大全集最值得收藏的資料整理

1、高效液相色譜法知識匯總大全集HPLC應用一、樣品測定1流動相比例調整：由于我國藥品標準中沒有規(guī)定柱的長度及填料的粒度，因此每次新開檢新品種時幾乎都須調整流動相（按經(jīng)驗，主峰一般應調至保留時間為615分鐘為宜）。所以建議第一次檢驗時請少配流動相，以免浪費。弱電解質的流動相其重現(xiàn)性更不容易達到，請注意充分平衡柱。2樣品配制：溶劑；容器：塑料容器常含有高沸點的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時應將玻璃容器進行硅烷化處理。3記錄時間：第一次測定時，應先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液

2、各進一針，并盡量收集較長時間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數(shù)及是否還有雜質峰在較長時間內才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定。4進樣量：藥品標準中常標明注入10ml，而目前多數(shù)HPLC系統(tǒng)采用定量環(huán)（10ml、20ml和50ml），因此應注意進樣量是否一致。（可改變樣液濃度）5計算：由于有些對照品標示含量的方式與樣品標示量不同，有些是復合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標示，檢驗時請注意。6儀器的使用：流動相濾過后，注意觀察有無肉眼能看到的微粒、纖維。有請重新濾過。柱在線時，增加流速應以0.1ml/min的增量逐步進行，一般不超

3、過1ml/min，反之亦然。否則會使柱床下塌，叉峰。柱不線時，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率遞增上去（或下來），勿急升（降），以免泵損壞。安裝柱時，請注意流向，接口處不要留有空隙。樣品液請注意濾過（注射液可不需濾過）后進樣，注意樣品溶劑的揮發(fā)性。測定完畢請用水沖柱1小時，甲醇30分鐘。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.10.3ml/min）沖洗過夜（注意水要夠量），不須沖洗甲醇。另外需要特別注意的是：對于含碳量高、封尾充分的柱，應先用含510%甲醇的水沖洗，再用甲醇沖洗。沖水的同時請用水充分沖洗柱頭（如有自動清洗裝置系統(tǒng)，則應更換水）。二、方法研究1波長選擇：首先在可見紫外分

4、光光度計上測量樣品液的吸收光譜，以選擇合適的測量波長，如最靈敏的測量波長并避開其它物質的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應值，如吸收度小于0.5時，HPLC測定的面積將會很小。2流動相選擇：盡量采用不是弱電解質的甲醇-水流動相。附件：高效液相色譜法（HPLC）復核細則一、對起草單位的要求：1HPLC法用于藥品的有關物質檢查或含量測定時，需提供建立HPLC法的依據(jù)及參考文獻。2應對建立的方法進行論證，按照中國藥典2000年版二部凡例與附錄收載的藥品質量標準分析方法驗證項下所列的要求進行試驗。3建立方法時，應考慮下列事項：首選填料為十八烷基鍵合硅膠，并至少對兩根不同品牌的色譜柱進行比

5、較試驗，其中一根為國產柱。流動相首選甲醇-水系統(tǒng)，應盡可能少用含有緩沖液的流動相，如為堿性藥物，流動相的pH值應為78；如為酸性藥物，流動相的pH值應為34。盡可能選用流動相作為溶劑，如未能選用，應說明原因。內標物應首選易得到的純度較高的化學試劑或對照品，應與待測物質化學結構相似，理化性質接近，峰的響應值相當，以及分離度應大于1.5，另應考慮對照品的來源問題。檢測器首選UV檢測器。4采用HPLC法進行有關物質檢查時，如雜質峰的響應值與主成分峰的響應值相差太大，應首選自身對照法，而不宜選用面積歸一化法。5HPLC法用于原料藥的含量測定。如以內標法測定含量，應考慮內標物是否含有干擾供試品的雜質；如

6、以外標法測定含量，對照品與供試品應各取樣2份，對照晶溶液各進樣3次，供試品溶液各進樣2次，計算相對標準差（RSD應不得大于l.5）。1按照起草單位提供的色譜條件與方法進行復核。2當HPLC法用于有關物質的檢查時，應進行最低撿出量試驗。3應考慮對同一樣品分析結果的重現(xiàn)程度、方法的可行性，并作出評價。 4、流動相使用前為什么要脫氣？ 流動相使用前必須進行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過程中當流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用

7、FLD，可能會造成熒光猝滅。常用的脫氣方法比較： 氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。加熱回流法：效果較好，但操作復雜，且有毒性揮發(fā)污染。抽真空脫氣法：易抽走有機相。超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果最差。在線真空脫氣法：Agilent1100LC真空脫機利用膜滲透技術， 在線脫氣，智能控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。1、為什么溶劑和樣品要過濾? 溶劑和樣品過濾非常重要，它會對色譜柱、儀器起到保護作用，消除由于污染對分析結果的影響。色譜柱：由于填料顆粒很細，色譜柱內

8、腔很小，溶劑和樣品中的細小顆粒會使色譜柱和毛細管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內的藍寶石活塞桿和活塞的磨損。樣品過濾頭的類型：30mm內徑：適用于大進樣量的過濾，由0.2m和0.45m兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50l。13mm內徑：適用于范圍廣的過濾，由0.2m和0.45m兩種規(guī)格,材料為纖維素。3mm內徑：適用于小進樣量的過濾，由0.2m和0.45m兩種規(guī)格。處理樣品體積為7l。濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白

9、質和其相關樣品。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液，可用于強酸，70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機溶劑。2、為什么HPLC用緩沖鹽時要加在線Seal-wash選項？ HPLC用緩沖鹽時,由于泵頭內的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現(xiàn)象,析出的細小鹽粒非常堅硬,它附著在藍寶石活塞桿上,隨著藍寶石活塞桿的往復運動,容易產生劃痕,并磨損密封墊,造成漏液等故障現(xiàn)象。在線Seal-wash選項能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結晶。緩沖鹽的濃度在0.1mol或大于0.1mol時,必須使用該在線沖洗選項. 清洗液配制: 90%水+10%異丙醇.該

10、混合液可抑制菌類生長和減小水的表面張力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。高效液相色譜級乙腈的質量評價信息來源：液色迷人 摘要: 高效液相色譜（HPLC）分析中，流動相溶劑的純度和質量對分析結果和儀器本身都有重要影響。溶劑中的各種痕量雜質不僅會造成較高的基線和鬼峰，進而影響定性定量分析結果，而且可能會污染分離柱和堵塞系統(tǒng)，造成儀器出現(xiàn)故障。了解HPLC溶劑規(guī)格和相關的測試方法，可以幫助HPLC 用戶評價和篩選HPLC溶劑，減少溶劑雜質對應用造成的負面影響。本文介紹了基于紫外（UV）吸收和HPLC梯度確定HPLC級乙腈純度和質量的兩種規(guī)范方法及其對HPLC分析的意義，并探討了這兩種方法

11、的實際應用。 乙腈區(qū)別于其他HPLC溶劑的獨特性質（中等洗脫能力、強溶解能力、能夠得到明確的色譜峰、低粘度、相對于醇類和酯類有較低的UV吸收）1，使其成為 最常用的有機流動相組分。乙腈一般是（由氨和丙烯）大規(guī)模生產丙烯腈的副產物。其中可能含有多種很少量的雜質，例如丙烯腈、()-甲基丙烯腈、順/反 式丁烯腈、乙醛、丙酮、甲醇、乙基氰化物、丙烯醛、烯丙醇、丙烯酸、惡唑和乙酸2-4。經(jīng)過復雜的純化過程，痕量的上述雜質可能仍然存在于HPLC級 乙腈中。其中一些雜質不僅會造成較高的基線和鬼峰，進而影響定性定量分析，而且會污染分析柱、堵塞系統(tǒng)，導致儀器出現(xiàn)故障。 作為美國分析試劑標準測試方法的權威，美國化

12、學學會（ACS）分析試劑委員會在試劑化學品（第9版）中明確定義了HPLC級乙腈的技術說明，包括通用 的說明和HPLC的適用說明。通用的說明包括氣相色譜（GC）純度、水、滴定酸或堿、以及揮發(fā)殘留物。HPLC的適用說明包括UV吸收和HPLC空白梯度 洗脫基線5。 本文詳細介紹了乙腈的兩種適用于HPLC的規(guī)范方法及其對HPLC應用的意義，并通過詳盡的實驗數(shù)據(jù)討論了操作中的注意事項以及影響測試結果的因素。 1 實驗 1.1 儀器 本文中使用了兩種HPLC系統(tǒng)，其特定條件介紹如下：Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)由脫氣機（G1379A）、四元泵（G1311A）、自動進樣器（G1315A）和二極管陣

13、列檢測器（DAD）（G1315B） （Agilent Technologies, Wilmington, DE）組成，并用該系統(tǒng)獲得圖1和圖2的結果。其他色譜圖由Alliance 2695 HPLC系統(tǒng)和2996 光電二極管陣列（PDA）檢測器(Waters, Milford, MA)獲得。ZORBAX C18柱由Agilent提供；B&J C8柱從Honeywell Burdick & Jackson獲得。 UV光譜使用Cary 4000 UV-VIS 分光光度計（Varian, Palo Alto, CA）。參比池為1 cm石英池，樣品池為1 cm或5 cm石英池。 1.2

14、 藥品和試劑 HPLC級乙腈來自Honeywell Burdick & Jackson 及其他HPLC溶劑供應商。高純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore, Bedford, MA）和Honeywell Burdick & Jackson供應。乙酸（AR）由Sigma（St. Louis, MO）提供。 2 結果和討論 2.1 HPLC級乙腈UV吸收規(guī)范的意義 UV吸收背景對HPLC乙腈的關鍵性源于兩個原因。首先，大部分有機雜質都會產生UV吸收。乙腈的UV吸收越小意味著其中雜質含量越少。第二，HPLC儀器最常用的檢測模式就是UV檢測。因此乙腈的UV吸收越小，色譜的基

15、線背景越低；從而靈敏度越高，檢測限越低。 圖3是來自不同供應商的HPLC級乙腈的UV光譜，尤其是在短波長范圍（300190 nm）并不相同。這可能是由于乙腈中難以去除的雜質因各溶劑供應商使用的純化技術不同而不同。鑒于使用UV檢測器的HPLC分析中大部分分析物在300 nm以下檢測，因此大部分溶劑供應商在上述波長范圍內設立UV吸收規(guī)范。 2.2 影響UV吸收測量值的因素 在測試實驗中，很多因素會影響UV吸收的測量值： （1）光路距離（比色皿長）。在0.20.8 AU范圍內，吸光率（A）的測量值誤差最小，否則吸光率的測量誤差會相對大些。如使用1 cm比色皿，即使在250210 nm的短波長范圍內，

16、乙腈的吸光率也遠小于0.2 AU，因此可能產生很大的誤差。根據(jù)比爾定律，溶劑的吸光率和樣品的光路距離成正比，因此增加樣品池長度會使溶劑吸光率增加，使其值進入0.20.8 AU范圍內，從而減小測量誤差。使用5 cm比色皿，在400190 nm掃描范圍內得到不同乙腈樣品的UV光譜（如圖4所示）。從圖4中曲線可以發(fā)現(xiàn)，使用5 cm比色皿可使乙腈在低波長的大部分UV吸光率進入0.20.8 AU范圍，從而顯示出數(shù)據(jù)的準確度更高。而且，不同乙腈樣品的UV吸光率的差別與使用1 cm比色皿時相比更明顯。鑒于這一點，Honeywell Burdick & Jackson等一些生產商使用1 cm和5 cm

17、兩種比色皿建立UV吸收規(guī)范。 （2）儀器參數(shù)。由于乙腈的吸光率非常低，儀器參數(shù)的設定要保證最佳的靈敏度和準確度。雙光路模式可以克服單光路模式中光源能量隨時間變化的缺點，并且可以更方便地掃描UV全波長范圍。使用分光光度計的基線校正功能，可以去除由光源、檢測器和樣品池等引入的儀器變化6。由于儀器噪聲隨著掃描速度的提高 而增大，因此推薦使用最大掃描速度的一半。（3）參比物。用于溶劑UV吸收測定的參比物有兩種可能。試劑化學品（第9版）使用水作為參比；而中國藥典使用空氣作為參比。使用空氣作為參比時測定的乙腈UV吸收值低于使用水作為參比時測定的值，而且在400250 nm波長的范圍內通常為負值。這是由于空

18、氣中氧和二氧化碳的貢獻使其UV吸收強于水。如圖5中所示，由于參比不同造成的UV吸收有顯著不同，高達 0.03 AU，所以當我們閱讀供應商提供的分析報告證書時需要了解究竟是使用水還是使用空氣作為參比。 推薦使用新鮮的HPLC級瓶裝水或者實驗室超純水系統(tǒng)制得的超純水作為參比物。值得注意的是，實驗室超純水系統(tǒng)制得的新鮮水常常含有大量的氣泡，這些氣泡需要在實驗前去除，否則會影響數(shù)據(jù)的準確度。 （4）氮氣噴霧。為了延長溶劑的保存時間，一些HPLC溶劑供應商將惰性氮氣充入溶劑。作者研究了氮氣對乙腈UV吸收的影響（圖6）。結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氮氣噴 霧，乙腈在250200 nm范圍內的UV吸收顯著降低。200 nm

19、處的吸光率為0.012，是氮氣噴射前的四分之一。其原因可能是氮氣在乙腈中的溶解度遠小于氧氣和二氧化碳。氮氣噴霧減少了氧氣和二氧化碳對乙腈UV 吸收的貢獻。（注意：也可能是由于氧氣和溶劑形成了電荷傳遞復合物導致了UV吸收。） （5）溶劑的揮發(fā)性。由于乙腈是一種揮發(fā)性溶劑，如果樣品池和參比池在測試過程中是敞開的，那么樣品池中的乙腈蒸汽可能會進入樣品室或參比池，結果造成吸光率讀數(shù)偏低。因此，推薦在實驗中用聚四氟乙烯（PTFE）蓋子將這兩個池都蓋住。 2.3 HPLC級乙腈空白梯度洗脫規(guī)范的意義 如果溶劑中的雜質水平低于1 ppm，簡單的UV光譜通常檢測不到其存在1。然而，這些痕量雜質可能在有機相和水

20、相比例較低時在柱上富集并保留，然后當梯度過程中流動相洗脫能力增強時被洗脫下來，從而形成鬼峰7。因此，HPLC空白梯度洗脫基線上的鬼峰高低，是評價HPLC級乙腈質量的關鍵規(guī)范方法。它清楚地表明了乙腈中是否 含有影響梯度洗脫模式下HPLC分析的痕量的雜質。 試劑化學品（第9版）明確規(guī)定214 nm處HPLC空白梯度洗脫基線的最大峰高應低于5 mAU。具體的測定方法如下：C18柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 m）；梯度：0 min，80% 水（溶劑A），20% 乙腈（溶劑B），保持30 min；在50 min時達到 100% B，保持10 min；流速2 mL/min。樣品運

21、行3次，并去掉第1次運行的結果5。圖7比較了B&J ACS/HPLC和幾種國內色譜級乙腈樣品的ACS空白梯度洗脫基線。結果表明，一些本地產色譜級乙腈樣品在254 nm時會產生高達20 mAU的鬼峰。這說明即使在254 nm處，這些國產試劑也可能在HPLC常規(guī)分析中產生干擾。 在HPLC的一些實際應用中，往往需要在更低波長處使用梯度洗脫模式以實現(xiàn)高靈敏度的HPLC分析，因此對乙腈的HPLC空白梯度洗脫規(guī)范提出了更高的要 求。為了滿足高靈敏HPLC應用的要求，一些溶劑供應商也生產梯度級HPLC乙腈。這種乙腈不同于用于等度洗脫HPLC分析的乙腈，它們可以滿足更嚴格的 梯度洗脫規(guī)范。例如，Ho

22、neywell Burdick & Jackson的空白梯度洗脫基線規(guī)格為：254 nm時低于1 mAU，215 nm時低于5 mAU。圖1中，在215 nm下，不同供應商的梯度級乙腈的梯度洗脫基線不同，說明它們用于低波長梯度洗脫模式痕量HPLC分析的質量不同。 2.4 影響空白梯度洗脫基線測定的因素 由于操作和HPLC系統(tǒng)本身的復雜性，系統(tǒng)中的任何部分都可能成為梯度洗脫基線鬼峰的來源，因此在實驗過程中應十分注意降低HPLC系統(tǒng)和水相的干擾。 （1）HPLC系統(tǒng)污染和流動相添加劑的影響。梯度洗脫過程中，任何有UV吸收的雜質都可能產生鬼峰。除了HPLC進樣系統(tǒng)和色譜柱的污染，樣品溶劑和流

23、 動相的不匹配也會產生鬼峰。圖8為當100%乙腈樣品進入系統(tǒng)中，乙腈和水梯度運行色譜圖中開始處可能產生正或負的鬼峰。因此進行空白梯度洗脫基線測定 時，為了去除可能來自進樣系統(tǒng)的干擾而不予以進樣。測試前色譜柱應徹底洗凈，或者使用一根專門用來做這個實驗的色譜柱來避免來源于色譜柱的交叉污染。 HPLC分析的實際應用中，常向流動相中加入一些添加劑來改善分離和峰形。然而，這些添加劑也可能成為梯度洗脫基線鬼峰的來源。圖9中可見，水相中加入乙酸會導致梯度洗脫基線中有鬼峰。因此，乙腈空白梯度洗脫基線測定操作中，只用水和乙腈作為流動相而不加添加劑。 （2）HPLC系統(tǒng)中氣泡的影響。溶劑中的氣泡經(jīng)過HPLC系統(tǒng)也

24、可能產生鬼峰（圖10）。這種鬼峰和典型的雜質峰不同，它們是魚翅形：其前邊緣很銳，然 后幾乎線性下降至基線。在線壓力監(jiān)測系統(tǒng)顯示，鬼峰形成時有很快的系統(tǒng)壓力降（圖11），更進一步證明這些鬼峰的形成是由于系統(tǒng)壓力的瞬間快速降低而不是 由于雜質的存在。參考文獻7和8詳細解釋了氣泡如何導致了這種鬼峰的生成。 因此，當進行空白梯度洗脫測試時，需要確保HPLC系統(tǒng)中的氣泡完全除凈、脫氣機正常工作并且流動相充分脫氣，從而保證系統(tǒng)中沒有氣泡。 （3）流動相中水的影響。水相也是空白梯度洗脫基線中鬼峰的一個重要來源。實際上，空白基線洗脫基線中的大部分鬼峰來源于水相9。在消費者處進行的一 次HPLC梯度洗脫基線操作

25、中發(fā)現(xiàn)使用不同品牌的乙腈時，17.5 min處都有一個很高的鬼峰，說明這是由消費者的水凈化系統(tǒng)引起的（圖2）。許多分析實驗室常使用商品化飲用水或蒸餾水作為HPLC分析的流動相。實際 上，水的塑料容器常會促進細菌的生長，容器中的添加劑也可能會溶入水中，從而導致梯度洗脫模式中出現(xiàn)鬼峰。因此，推薦使用由HPLC溶劑供應商提供的商品 化瓶裝HPLC級水，或超純水系統(tǒng)制備的用于HPLC的水。圖12表明新鮮的B&J ACS/HPLC水和來自Milli-Q系統(tǒng)的超純水都能滿足高靈敏度HPLC梯度洗脫測試規(guī)格。 但應該注意的是，空氣中的污染物也可能進入到瓶裝HPLC水中，一旦蓋子打開一段時間后可能會長

26、菌。圖12顯示，開瓶一周的棕色瓶裝HPLC水的梯度洗脫 基線嚴重漂移，并且相比于新鮮HPLC水，其峰的數(shù)量和峰高都顯著增加。因此，瓶裝HPLC級水一旦打開，最好在兩天內使用。至于Milli-Q超純水， 應注意的是超純水系統(tǒng)中的柱子和UV燈是消耗品，當?shù)竭_使用壽命時需要更換;否則水中的總有機碳（TOC）可能顯著增加，從而在梯度洗脫測試中產生干擾 9。 為避免柱內的流動相“疏水性塌陷”，梯度洗脫中初始流動相組成不使用100%水，而使用較低的有機相/水相比例（根據(jù)不同的HPLC溶劑供應商，通常為 10%30%乙腈）。如果鬼峰是由流動相造成的，峰高會隨著初始有機相/水相比例的持續(xù)時間而變大。為了進一步

27、確定鬼峰是來自乙腈或水，可以改變初始有機相的比例。如果鬼峰隨著初始有機相比例增大而增大，那么其來源應為乙腈；反之則來源于水。圖13中，鬼峰高隨著平衡時間增加，所以這些鬼峰全部來自于流動相。如果考察不同初始有機相比例的兩個梯度洗脫基線，當初始有機相比例從20%增至30%時，4852 min范圍內的鬼峰增多，4046 min范圍內的鬼峰消失。這說明前一個來源是乙腈而后一個是水。 （4）過濾造成的流動相污染。為了避免流動相中可能存在的顆粒造成HPLC系統(tǒng)堵塞，HPLC儀器供應商通常推薦對流動相進行微過濾。然而，操作不小心或者微過濾裝置本身都可能會向流動相中引入雜質。一方面，商品化過濾膜的質量差別很大

28、，并且（尤其是用尼龍或高密度聚乙烯制作的）過濾膜本身可能引入更多顆 ?；蚝锌杀灰译孑腿〉奈镔|；另一方面，一般的實驗室條件下，很難保證過濾過程中過濾裝置的玻璃器皿部分完全沒有顆粒。使用0.45 m尼龍支撐的的疏水PTFE膜過濾乙腈，空白梯度洗脫基線中45 min處會出現(xiàn)高達50 mAU的鬼峰（圖14）。盡管污染的來源還需要進一步確認，這仍可說明實驗室中微過濾操作引起污染的風險很高。因此，推薦在HPLC梯度洗脫評價測試中直 接使用由生產商提供的原裝瓶里的乙腈，而不增加其他處理操作。 3 結論 UV吸收和HPLC空白梯度洗脫基線是HPLC級乙腈的兩個關鍵規(guī)格。由于UV區(qū)域內乙腈的吸收很低，推薦使用

29、雙光路模式、基線校正和適當增加比色皿長度來獲得更加準確的結果。另外，參比物質、溶劑是否經(jīng)過氮氣噴射以及溶劑本身的揮發(fā)性也可能影響測試結果。相比于UV吸收，HPLC空白梯度洗脫基線評價可 以為應用于HPLC梯度的乙腈質量提供更加精確和實用的評價。測試中需要考慮多種實際方面來確保獲得準確可靠的測試結果；來自于HPLC系統(tǒng)、流動相添加 劑和水相的污染，以及附加的過濾操作都需要避免；系統(tǒng)中的氣泡也要除凈。 操作心得操作過程： 1、 開機操作：（1）、打開電源 （2）、自上而下打開個組件電源，Bootp Server里顯示有信號時，打開工作站，先打開在線工作站；打開離線狀態(tài)的工作站可以離線處理圖譜與出報

30、告 （3）、打開沖洗泵頭的10異丙醇溶液的開關（需用針捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量為準；提到異丙醇溶液，我還學到一點就是，在用完反相后要換成正相時，我們需要用異丙醇過度30分鐘左右，然后在換上正相柱（4）、注意各流動相所剩溶液的容積設定，若設定的容積低于最低限會自動停泵，注意洗泵溶液的體積，及時加液； （5）、使用過程中要經(jīng)常觀察儀器工作狀態(tài)，及時正確處理各種突發(fā)事件。 2、 先以所用流動相沖洗系統(tǒng)一定時間，如所用流動相為含鹽流動相，必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動相，正式進樣分析前30min 左右開啟D燈或W燈，以延長燈的使用壽命； 3、 建立色譜操作方法，注意保存為自己

31、清楚的方法名，勿覆蓋或刪除他人的方法及實驗結果； 4、 使用手動進樣器進樣時，在進樣前和進樣后都需用洗針液洗凈進樣針筒，洗針液一般選擇與樣品液一致的溶劑，進樣前必須用樣品液清洗進樣針筒3遍以上，并排除針筒中的氣泡； 5、 溶劑瓶中的沙芯過濾頭容易破碎，在更換流動相時注意保護，當發(fā)現(xiàn)過濾頭變臟或長菌時，不可用超聲洗滌，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌； 6、 實驗結束后，如果有鹽一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個管路30分鐘以上，再用甲醇沖洗。如果是一般的溶劑系統(tǒng)就直接用甲醇沖洗，沖洗過程中關閉D燈、W燈；以延長燈的壽命 7、 關機時，先關閉泵、檢測器等，再關閉工作站，然后關機，最后自下而上關閉

32、色譜儀各組件，關閉洗泵溶液的開關； 8、 使用者須認真履行儀器使用登記制度，出現(xiàn)問題及時向老師報告，不要擅自拆卸儀器。未經(jīng)操作培訓，不得擅自使用儀器。流動相： 1、 流動相應選用色譜純試劑、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液需經(jīng)過濾后使用，過濾時注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍； 2、 水相流動相需經(jīng)常更換（一般不超過2天），防止長菌變質； 3、 使用雙泵時，最好不要有機相與水相直接調用，這樣可能造成管路氣泡，最好我們根據(jù)自己的需要配制一定濃度的有機相與水相的混合溶液，再與水相混合調用4、換流動相后，要purge樣品：1、 采用過濾或離心方法處理樣品，確保樣品中不含固體顆粒； 2、 用流動相或比流

33、動相弱的溶劑制備樣品溶液，若為反相柱，則極性比流動相大；若為正相柱，則極性比流動相小，盡量用流動相制備樣品液； 手動進樣時，進樣量盡量小，使用定量管定量時，進樣體積應為定量管的35倍；色譜柱： 1、 使用前仔細閱讀色譜柱附帶的說明書，注意適用范圍，如pH值范圍、流動相類型等；2、 使用符合要求的流動相； 3、 使用保護柱； 4、 如所用流動相為含鹽流動相，反相色譜柱使用后，先用水或低濃度甲醇水（如5甲醇水溶液），再用甲醇沖洗。 5、 色譜柱在不使用時，應用甲醇或乙氰沖洗，取下后緊密封閉兩端保存； 6、 不要高壓沖洗柱子； 7、 不要在高溫下長時間使用硅膠鍵合相色譜柱，使用硅膠柱時還要特別小心流

34、動相的PH范圍在28之間；使用過程中注意輕拿輕放。8、上柱時我們要注意柱子的方向，千萬不要裝反了高效液相色譜法的分類及其分離原理高效液相色譜法分為：液-固色譜法、液-液色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜法。1.液-固色譜法（液-固吸附色譜法）固定相是固體吸附劑，它是根據(jù)物質在固定相上的吸附作用不同來進行分配的。液-固色譜法的作用機制吸附劑：一些多孔的固體顆粒物質，其表面常存在分散的吸附中心點。流動相中的溶質分子X（液相）被流動相S帶入色譜柱后，在隨載液流動的過程中，發(fā)生如下交換反應：X（液相）+nS（吸附）<=>X（吸附）+nS（液相）其作用機制是溶質分子X（液相）和溶劑分子S（液相

35、）對吸附劑活性表面的競爭吸附。吸附反應的平衡常數(shù)K為：K值較?。喝軇┓肿游搅軓?，被吸附的溶質分子很少，先流出色譜柱。K值較大：表示該組分分子的吸附能力較強，后流出色譜柱。發(fā)生在吸附劑表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色譜分離的基礎。 液-固色譜法的吸附劑和流動相常用的液-固色譜吸附劑：薄膜型硅膠、全多孔型硅膠、薄膜型氧化鋁、全多孔型氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。一般規(guī)律：對于固定相而言，非極性分子與極性吸附劑（如硅膠、氧化銅）之間的作用力很弱，分配比k較小，保留時間較短；但極性分子與極性吸附劑之間的作用力很強，分配比k大，保留時間長。對流動相的基本要求：試樣要能夠溶于流動相中流動相粘度較小流動

36、相不能影響試樣的檢測常用的流動相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。液-固色譜法的應用常用于分離極性不同的化合物、含有不同類型或不；數(shù)量官能團的有機化合物，以及有機化合物的不同的異構體；但液-固色譜法不宜用于分離同系物，因為液-固色譜對不同相對分子質量的同系物選擇性不高。2.液-液色譜法（液-液分配色譜法）將液體固定液涂漬在擔體上作為固定相。液-液色譜法的作用機制溶質在兩相間進行分配時，在固定液中溶解度較小的組分較難進入固定液，在色譜柱中向前遷移速度較快；在固定液中溶解度較大的組分容易進入固定液，在色譜柱中向前遷移速度較慢，從而達到分離的目的。液-液色譜法與液-液萃取法的基本原理相同，均

37、服從分配定律：K=C固/C液K值大的組分，保留時間長，后流出色譜柱。正相色譜和反相色譜正相分配色譜用極性物質作固定相，非極性溶劑（如苯、正己烷等）作流動相。反相分配色譜用非極性物質作固定相，極性溶劑（如水、甲醇、己腈等）作流動相。一般地，正相色譜是固定液的極性大于流動相的極性，而反相色譜是固定相的極性小于流動相的極性。正相色譜適宜于分離極性化合物，反相色譜則適宜于分離非極性或弱極性化合物。液-液色譜法的固定相常用的固定液為有機液體，如極性的，氧二丙腈（ODPN），非極性的十八烷（ODS）和異二十烷（SQ）等。缺點：涂漬固定液容易被流動相沖掉。采用化學鍵合固定相則可以避免上述缺點。使固定濃與擔體

38、之間形成化學鍵，例如在硅膠表面利用硅烷化反應：形成Si-O-Si-C型鍵，把固定液的分子結合到擔體表面上。 優(yōu)點：化學鍵合固定相無液坑，液層薄，傳質速度快，無固定液的流失。固定液上可以結合不同的官能團，改善分離效能。固定液不會溶于流動相，有利于進行梯度洗提。液-液色譜法的應用液-液色譜法既能分離極性化合物，又能分離非極性化合物，如烷烴、烯烴、芳烴、稠環(huán)、染料、留族等化合物。化合物中取代基的數(shù)目或性質不同，或化合物的相對分子質量不同，均可以用液-液色譜進行分離。3.離子交換色譜法原理：離子交換色譜法是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的被測離子進行可逆交換，由于被測離子在交換劑

39、上具有不同的親和力（作用力）而被分離。離子交換色譜法的作用機制聚合物的分子骨架上連接著活性基團，如：-SO3-，-N（CH3）3+等。為了保持離子交換樹脂的電中性，活性基團上帶有電荷數(shù)相同但正、負號相反的離子X，稱為反離子?；钚曰鶊F上的反離子可以與流動相中具有相同電荷的被測離子發(fā)生交換： 離子交換色譜的分配過程是交換與洗脫過程。交換達到平衡時： K值越大，保留時間越長。溶劑和固定相兩種類型：多孔性樹脂與薄殼型樹脂。多孔性樹脂：極小的球型離子交換樹脂，能分離復雜樣品，進樣量較大；缺點是機械強度不高，不能耐受壓力。薄殼型離子交換樹脂：在玻璃微球上涂以薄層的離子交換樹脂，這種樹脂柱效高，當流動相成分

40、發(fā)生變化時，不會膨脹或壓縮；缺點是但柱子容量小，進樣量不宜太多。離子交換色譜法的應用主要用來分離離子或可離解的化合物，凡是在流動相中能夠電離的物質都可以用離子交換色譜法進行分離。廣泛地應用于：無機離子、有機化合物和生物物質(如氨基酸、核酸、蛋白質等)的分離。4.凝膚色譜法（空間排阻色譜法）凝膠是一種多孔性的高分子聚合體，表面布滿孔隙，能被流動相浸潤，吸附性很小。凝膠色譜法的分離機制是根據(jù)分子的體積大小和形狀不同而達到分離目的。凝膠色譜法的作用機制體積大于凝膠孔隙的分子，由于不能進入孔隙而被排阻，直接從表面流過，先流出色譜柱；小分子可以滲入大大小小的凝膠孔隙中而完全不受排阻，然后又從孔隙中出來隨

41、載液流動，后流出色譜柱；中等體積的分子可以滲入較大的孔隙中，但受到較小孔隙的排阻，介乎上述兩種情況之間。凝膠色譜法是一種按分子尺寸大小的順序進行分離的一種色譜分析方法。凝膠色譜法的固定相軟質凝膠、半硬質凝膠和硬質凝膠三種。凝膠色譜法的應用特點保留時間是分子尺寸的函數(shù)，適宜于分離相對分子質量大的化合物，相對分子質量在4008×105的任何類型的化合物。保留時間短，色譜峰窄，容易檢測。固定相與溶質分子間的作用力極弱，趁于零，柱的壽命長。不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上時才能得到分離高效液相色譜的類型（一）吸附色譜在吸附色譜中，樣品的極性官能團牢固地保留在填料的吸附活

42、性中心上，非極性烴基幾乎不予保留。所以，要清楚地辨別極性功能團的種類、數(shù)量和位置。通常，樣品能用吸附色譜分離的應是能溶解于有機溶劑并是非離子型的，強離子樣品是不適宜的。吸附色譜所使用的流動相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作為基礎，按照樣品的極性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的濃度為或更少一些。如有可能，可進一步減小百分數(shù)。因為高濃度的醇會減少填料的吸附活性，減弱吸附能力，并使重現(xiàn)困難。（二）分配色譜. 正相分配色譜正相分配色譜適用于不溶于水而溶于有機溶劑且?guī)в袠O性基團的樣品，但正相分配色譜不適合于離子型物質。.反相分配色譜這種方法目前應用非常廣泛，應用的范圍也很廣，在反相分配色譜中，樣品的非極

43、性部分起保留作用。通過使用的流動相是水甲醇和水乙腈，通過加入甲醇或乙腈的量的不同來調節(jié)分離，但如果樣品帶有離子型基團，需要在流動相中加入鹽或調節(jié)流動相的值，例如，如果樣品有一個 基團，使流動相的值是偏向酸性的，由于抑制了基團的電離而加強了保留。這個方法叫離子抑止法，如果樣品有強離子基，有時候采用在流動相中加入適當抗衡離子以形成離子對的離子對法。在調節(jié)值中，保持值在填料說明書手冊中所規(guī)定的范圍內，大多數(shù)化學鍵式的二氧化硅使用在-，然而，當加入鹽以后，最好使其.-或更小的，多孔聚合物填料能應用非常廣泛的值。（三）離子交換色譜這個方法是用填料的固定相的離子交換基團和樣品的離子基團之間的離子交換來分離

44、樣品組分的，按照所交換的離子分成陽離子交換和陰離子交換。離子交換色譜使用于能溶于水的離子型物質。在離子交換色譜中，流動相的鹽的濃度、及鹽的種類等都對保留值有很大的影響。在高效液相色譜的離子交換中所用的鹽有磷酸鹽、醋酸鹽和硼酸鹽。因為氯化物會腐蝕不銹鋼儀器，在高效液相色譜中不能使用或其他的氯化物鹽類。根據(jù)測量波長有些鹽也不能使用，例如，醋酸吸收大約在，當檢測處在短波端的時候，用醋酸作流動相是不合適的。（四）凝膠色譜凝膠色譜不同于以上三種分離方法。凝膠色譜是根據(jù)分子大小用分子篩效應來分離樣品組分的。這個方法也叫排阻色譜或粒度排阻色譜。具有一定孔徑的多孔性合成聚合物經(jīng)常用作填料。因為在樣品中，小尺寸

45、的分子深深地滲透到微孔中，所以遲流出，而大尺寸的分子沒有滲透到微孔中，就很快流出。通常合成樹脂的分離使用有機溶劑作流動相，叫做凝膠滲透色譜。凝膠色譜依樣品的性質又可分為凝膠滲透和凝膠過濾。.凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜（），簡稱。此一類的色譜，使用于有機性溶媒的樣品中，如，等等，而所用的洗脫液有，等等。.凝膠過濾色譜凝膠過濾色譜（），簡稱。此一種類的層析法，使用于水溶媒的試劑中，如蛋白質、淀粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、緩沖液等等。凝膠的種類很多，按其原料來源可分為有機膠和無機膠。按其制備的方法又可分為均勻、半均勻和非均勻三種凝膠。而根據(jù)凝膠的強度又可分為軟膠、半硬膠和硬膠三大類。根據(jù)

46、它對溶劑的適用范圍又可分為親水性、親油性和兩性凝膠等等。編輯本段高效液相色譜法在分析檢測上的應用食品中山梨酸、苯甲酸的測定. 原理樣品加溫除去二氧化碳和乙醇，調至近中性，過濾后進高效液相色譜儀，經(jīng)反相色譜分離后，根據(jù)保留時間和峰面積進行定性和定量。.試劑和溶液方法中所用試劑，除另有規(guī)定外，均為分析試劑，水為蒸餾水或同等純度的水，溶液為水溶液。（）甲醇：優(yōu)級純，如果是分析純，需重蒸。（）稀氨水：+ 溶液，氨水加水等體積混勻。（）.乙酸鉸溶液：稱取.乙酸按，加水至，溶解，經(jīng)濾膜（.）過濾。（）碳酸氫鈉溶液：稱取碳酸氫鈉（優(yōu)級純）加水至，振搖溶解。（）苯甲酸標準儲備液：準確稱取. 苯甲酸，加碳酸氫鈉

47、溶液，加熱溶解，移入 容量瓶中，加水定客至，搖勻，此溶液苯甲酸含量為，作為儲備液。（）山梨酸標準儲備液：準確稱取.山梨酸，加碳酸氫鈉溶液（），加熱溶解，移入 容量瓶中，加水定容至，山梨酸含量為，作為儲備溶液。（）苯甲酸、山梨酸標準混合使用溶液：取苯甲酸、山梨酸標準儲備溶液.，放入容量瓶中，加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸各.。經(jīng)濾膜（.）過濾（ 同時測定糖精鈉時，可加入糖精鈉標準儲備液）。.儀器高效液相色譜儀（帶紫外檢測器）。.測定方法（）樣品處理.汽水、飲料、果汁類：（ 汽水需微溫攪拌除去二氧化碳）吸取. 樣品，加入已裝有中性氧化鋁（*.）的小柱中，過濾，棄去初濾液，然后用流動相洗脫苯甲酸

48、，接收于帶塞量簡中，洗脫至刻度，搖勻。此液通過微孔濾膜后進樣。.配制酒類：稱取. 樣品，放入小燒杯中，水浴加熱除去乙醇，用氨水（+）調節(jié)約，加水定容至適當體積，經(jīng)濾膜（.）過濾。（）高效液相色譜參考條件.色譜柱：-.*，或其他型號柱。.流動相：甲醇+乙酸鉸溶液（.）（+）。.流速：.。.進樣量：。.檢測器紫外檢測器，波長，靈敏度.。根據(jù)保留時間定性、外標峰面積法定量。高壓液相色譜HPLC培訓教程(二) II基本概念和理論一、基本概念和術語1色譜圖和峰參數(shù)色譜圖(chromatogram)-樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)?；€(

49、base line)-經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。噪音(noise)-基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。漂移(drift)-基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產生漂移。色譜峰(peak)-組分流經(jīng)檢測器時響應的連續(xù)信號產生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak

50、)。前者少見。拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)。中國藥典規(guī)定T應為0.951.05。T0.95為前延峰，T1.05為拖尾峰。峰底-基線上峰的起點至終點的距離。峰高(peak height，h)-峰的最高點至峰底的距離。峰寬（peak width，W)-峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W4半峰寬（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半處的峰寬。Wh/22.355標準偏差（standard deviation，)-

51、正態(tài)分布曲線x±1時（拐點）的峰寬之半。正常峰的拐點在峰高的0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。峰面積(peak area，A)-峰與峰底所包圍的面積。2定性參數(shù)（保留值）死時間(dead time，t0)-不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。死體積(dead volume，V0)-由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內固定相顆粒間隙（被流動相占據(jù)，Vm）、柱出口管路

52、體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應盡量減小。V0F×t0（F為流速）保留時間(retention time，tR)-從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。保留體積(retention volume，VR)-從進樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VRF×tR調整保留時間(adjusted retention time，t'R)-扣除死時間后的保留時間。也稱折合保留時間(reduced retention time)。在實驗條件（溫度、固定相等）一定時，t

53、'R只決定于組分的性質，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'RtRt0調整保留體積(adjusted retention volume，V'R)-扣除死體積后的保留體積。 3柱效參數(shù)理論塔板數(shù)(theoretical plate number，N)-用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。N取決于固定相的種類、性質（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質的性質。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。用半峰寬計算理論塔數(shù)比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更易準確測定，尤

54、其是對稍有拖尾的峰。N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應注明柱長，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用調整保留時間(t'R)計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)。理論塔板高度(theoretical plate height，H)-每單位柱長的方差。實際應用時往往用柱長L和理論塔板數(shù)計算。4相平衡參數(shù)分配系數(shù)(distribution coefficient，K)-在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。 分配系數(shù)與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關，也與溫度、壓力

55、有關。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù))，凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。 在條件(流動相、固定相、溫度和壓力等)一定，樣品濃度很低時(Cs、Cm很小)時，K只取決于組分的性質，而與濃度無關。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。 在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。 在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。容量因子(capa