植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、院（系、部）化學(xué)與生物工程學(xué)院專業(yè)生物技術(shù)（師范）年級(jí)13級(jí)學(xué)號(hào)17130208姓名組別第二組課程名稱植物細(xì)胞工程學(xué)實(shí)驗(yàn)日期2016.3-6指導(dǎo)老師實(shí)驗(yàn)名稱植物組織培養(yǎng)綜合實(shí)驗(yàn)1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .熟悉MSW養(yǎng)基的組成，掌握貯備液的配制方法2 .學(xué)習(xí)、掌握植物組織固體培養(yǎng)基的配制和滅菌方法；3 .掌握超凈工作臺(tái)上的接種方法與注意事項(xiàng)，了解接種室的滅菌方法；4 .了解組織培養(yǎng)的基本程序；5 .掌握接種的方法和材料的培養(yǎng)過(guò)程；6 .掌握無(wú)菌操作技術(shù)，包括外植體除菌和接種技術(shù)；7 .觀察外植體的生長(zhǎng)狀況、染菌狀況，剔除染菌外植體；8 .了解MSW養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基的區(qū)別2、 實(shí)驗(yàn)原理1 .植物細(xì)胞

2、的全能性一切植物都由細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞是構(gòu)成植物體的基本結(jié)構(gòu)與功能單位。植物細(xì)胞含有全套遺傳信息，具有形成完整植物的潛能。2 .植物細(xì)胞表現(xiàn)出全能性的條件1 .離體狀態(tài)；2 .有一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，激素和其他外界條件（無(wú)菌、溫度、pH）;3 .選擇性能優(yōu)良、細(xì)胞全能性表達(dá)充分的基因型3 .無(wú)菌條件把植物的組織、器官等，使其在人工控制的無(wú)菌條件下，使植物在人工培養(yǎng)基上繁殖。用于進(jìn)行組織培養(yǎng)的組織、器官和細(xì)胞稱為外植體。在組培中外植體都死帶菌的，在接種前必須進(jìn)行表面消毒，這時(shí)取得培養(yǎng)成功的最基本和重要的前體。組織培養(yǎng)的主要過(guò)程都是在無(wú)菌條件下進(jìn)行的，所以所有的器材、植物體、接種室都應(yīng)是無(wú)菌的。4 .脫分化

3、與愈傷組織已有特定結(jié)構(gòu)與功能的植物組織，在一定條件下，其細(xì)胞被誘導(dǎo)改變?cè)瓉?lái)的發(fā)育途徑，逐步逆轉(zhuǎn)其原有的分化形態(tài)，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹稚芰Φ呐呒?xì)胞的過(guò)程稱為脫分化。脫分化所用的化學(xué)物質(zhì)與MS培養(yǎng)基的區(qū)別是需要激素誘導(dǎo)。所以脫分化培養(yǎng)需在MS培上添加激素進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。5 .培養(yǎng)基植物組織培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基為MSW養(yǎng)基。常用的凝固劑是瓊脂，它的主要作用是使液體培養(yǎng)基凝固，瓊脂本身并不提供任何營(yíng)養(yǎng)，它只是一種高分予的碳水物從海藻中提取出來(lái)，僅溶解于熱水，成為溶膠，冷卻后（40C以下）即凝固為固體狀凝膠。瓊脂的用量一般在4-10克/升之間。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式等有關(guān)外，還與高壓滅菌時(shí)的溫度

4、、時(shí)間、pH值等因素有關(guān)，長(zhǎng)時(shí)間的高溫會(huì)使凝固能力下降，過(guò)酸過(guò)堿加之高溫會(huì)使瓊脂發(fā)生水解而喪失凝固能力，存放時(shí)間過(guò)久，瓊脂變褐，也會(huì)逐失去凝固能力。MSW養(yǎng)基屬于富鹽平衡培養(yǎng)基，特點(diǎn)是：無(wú)機(jī)鹽濃度較高，元素間的比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖性，因而在培養(yǎng)的過(guò)程中可維持較好的穩(wěn)定性；營(yíng)養(yǎng)豐富，在一般培養(yǎng)中無(wú)須額外加入復(fù)雜的有機(jī)成分；微量元素種類全，濃度高。這類培養(yǎng)基是目前使用最廣泛的培養(yǎng)基。6 .生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)包括天然植物激素額人工激素類似物。植物激素是一類植物自身合成、同時(shí)對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用的有機(jī)化合物。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)于離題培養(yǎng)中的細(xì)胞分裂分化、器官形成和個(gè)體再生等均起著重要而

5、明顯的調(diào)節(jié)作用。一般來(lái)說(shuō)，基本培養(yǎng)基只能保證培養(yǎng)物的生存，維持其最低的生理活動(dòng)，而只有植物激素的配合使用，才能完成離體培養(yǎng)物中按照需要設(shè)計(jì)的各個(gè)調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)。常用的植物組培激素種類主要有生長(zhǎng)素類、細(xì)胞分裂素類、赤霉素。1）生長(zhǎng)素的生理作用主要是促進(jìn)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，有利于外植體脫分化并啟動(dòng)細(xì)胞分裂，有利于形成愈傷組織。同時(shí)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的協(xié)調(diào)作用，對(duì)于培養(yǎng)物的形態(tài)建立十分必要。在離體培養(yǎng)的分化調(diào)節(jié)中，生長(zhǎng)素促進(jìn)不定根的形成而抑制不定芽的發(fā)生。在液體培養(yǎng)中，生長(zhǎng)素還有利于體細(xì)胞胚胎發(fā)生。常用的生長(zhǎng)素有口引噪乙酸（IAA）、奈乙酸（NAA、二氯苯氧乙酸（2,4-D）和口引噪丁酸（舊A）等。在使用2,

6、4-D時(shí)，必須嚴(yán)格控制使用濃度和培養(yǎng)時(shí)期，因?yàn)楦邼舛鹊?, 4-D常常抑制器官的發(fā)生，在分化培養(yǎng)時(shí)不能使用2,4-D代替其他生長(zhǎng)素。2）細(xì)胞分裂素的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂，調(diào)節(jié)器官分化，延遲組織衰老，增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成等。此外，它還能顯著改善其他激素。離體培養(yǎng)中，細(xì)胞分裂素能夠促進(jìn)不定芽的發(fā)生，與生長(zhǎng)素協(xié)調(diào)使用能有效調(diào)控培養(yǎng)物的生長(zhǎng)與分化。常用的細(xì)胞分裂素包括6-卞基喋吟（6-BA）、激動(dòng)素（KT）、異戊烯氨基喋吟（2ip）、玉米素（ZT）等。3）赤霉素（GA是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的激素，目前已發(fā)現(xiàn)的天然赤霉素有20多種。自然界植物體內(nèi)的赤霉素具有促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)、誘導(dǎo)花芽形成、打破種子休眠及

7、誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)等生理功能。在離體培養(yǎng)條件下，赤霉素的主要作用時(shí)促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，與生長(zhǎng)素協(xié)同作用對(duì)形成層的分化具有一定影響，同時(shí)還能刺激體細(xì)胞胚進(jìn)一步發(fā)育成植株。3、 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器設(shè)備1 .植物材料：馬齒覓、番茄種子誘導(dǎo)的無(wú)菌苗、外植體（盤龍參、波斯菊、金葉女貞、黃花苜蓿、菊花、香樟、杜鵑、月季）2 .實(shí)驗(yàn)藥品（試劑）：甲醛、MS培養(yǎng)基母液（見表1）、蔗糖、瓊脂、1%干汞、酒精（75噴口90%、NaOHHCl、6-BA、NNA無(wú)菌水；3 .儀器設(shè)備和實(shí)驗(yàn)用具：高壓滅菌鍋、天平、pH計(jì)、超凈工作臺(tái)、電爐、酒精燈、鑲子、解剖刀、剪刀、燒杯、培養(yǎng)瓶、量筒、燒杯、玻璃棒、廣口試劑瓶、牛皮紙、濾紙

8、、培養(yǎng)皿、藥勺、支架、打火機(jī)等。4、 實(shí)驗(yàn)步驟（一）培養(yǎng)基母液的配制（2016/3/4）1. MSW養(yǎng)基貯備液配制貯備液I(g)(20X)貯備液III(mg)(100X)MgSO-7H2O3.70500mLFeSO-7HO278100mLNH4NO16.50NaEDTA2HO373CaCl22H2O4.40生長(zhǎng)調(diào)小劑KNO19.006-BA50mg50mLKHPO1.70NAA50mg貯備液II(mg)(100X)貯備液IV(mg)(100X)KI8.3100mL肌醇1000100mLHBO62煙酸5MnSO-4H2O223鹽酸硫胺素1ZnSO7H2O86鹽酸此哆醇5NaMoO-2HO2.5甘

9、氨酸20CuSO-5H2O0.25稱量溶解混合定容CoCb6H2O0.25表11）每種母液中的幾種成分稱量完畢后，分別用少量的蒸儲(chǔ)水徹底溶解，然后再將它們混溶，定容。2）貯備液III需加熱溶解?；旌虾笳{(diào)至pH5.5,定容，保存在棕色玻璃瓶?jī)?nèi)。3） 6-BA:1mg/mL（溶于少量1N鹽酸后以蒸儲(chǔ)水定容）。NAA1mg/mL（先用少量95叱醇溶解后以蒸儲(chǔ)水定容）。4）各種母液配制完成后，分別用玻璃瓶貯存，貼上標(biāo)簽，注明母液號(hào)、配制倍數(shù)、日期等，放入冰箱冷藏室保存。一般無(wú)機(jī)物質(zhì)的母液在冰箱中可保存半年以上，有機(jī)物質(zhì)的母液保存時(shí)間在半年以內(nèi)，但若發(fā)現(xiàn)有沉淀或霉變，應(yīng)立即需重新配制。2.其他試劑的配置

10、1） 1mol/L的NaOH1瓶2） 1mol/LHCL:1瓶3） 0.1%的升汞或2溫氯酸鈉：每個(gè)超凈工作臺(tái)一瓶（用時(shí)處理5-30min）4） 7075海精：每個(gè)超凈工作臺(tái)一瓶5） 95%酉精：每個(gè)超凈工作臺(tái)一瓶6） 75%酉精棉球：每個(gè)超凈工作臺(tái)一瓶（二）培養(yǎng)基的配制與滅菌1 .培養(yǎng)基配制1）配制培養(yǎng)液（MSW養(yǎng)液）：按每次配制500mL培養(yǎng)基計(jì)，用量筒或者移液管從各種母液中分別取出貯備液I25mL、貯備液II、田、IV各5mL;2）溶化瓊脂：用粗天平分別稱取5g瓊脂、15g蔗糖放入500mL搪瓷缸中，加入蒸儲(chǔ)水400mL,用用電爐加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀。然后再將配

11、好的混合培養(yǎng)液加入到煮沸的瓊脂中，最后加蒸儲(chǔ)水定容至500mL,攪拌均勻。3）調(diào)pH:用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1mol/L的NaOH容液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用精密的pH試紙（5.47.0）測(cè)培養(yǎng)基的pH,一直到培養(yǎng)基的pH為5.8為止（培養(yǎng)基的pH必須嚴(yán)格控制在5.8）。4）培養(yǎng)基的分裝溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。分裝時(shí)，先將培養(yǎng)基倒入燒杯中，然后將燒杯中的培養(yǎng)基倒入組培瓶（50mL或100mL）中。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。組培瓶中培養(yǎng)基的量約50mL。每500mL培養(yǎng)基，可分裝1015瓶。5）培養(yǎng)基分裝完畢后，應(yīng)及時(shí)封蓋瓶口。最后在組培瓶外壁貼上標(biāo)簽。2 .培

12、養(yǎng)基滅菌（高壓滅菌）1）放培養(yǎng)瓶。將裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶直立于金屬小筐中，再放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)。如果沒有金屬小筐，可以在兩層錐形瓶之間放一塊玻璃板隔開。2）放置其他需要滅菌的物品。將其他需要滅菌的物品也放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)，如裝有蒸儲(chǔ)水的錐形瓶、帶螺口蓋的玻璃瓶、燒杯、廣口瓶（以上物品都要用牛皮紙封口），用牛皮紙包裹的培養(yǎng)皿、剪刀、解剖刀、鑲子、濾紙、鉛筆等。3）待需要滅菌的物品碼放完畢，蓋上鍋蓋。在98kPa、121.3°C下,滅菌20min。滅菌后取出培養(yǎng)瓶，讓其中的培養(yǎng)基自然冷卻凝固。最好放置1d后再使用。3 .其他滅菌1）不耐熱的物質(zhì)將采用過(guò)濾滅菌如赤霉素、玉米素、脫落酸、尿

13、素和某些維生素等。過(guò)濾滅菌的原理：溶液通過(guò)濾膜后，細(xì)菌的細(xì)胞和胞子等因大于濾膜孔徑而被阻。2）玻璃器皿及耐熱用具等可采用干熱滅菌即利用烘箱加熱到160-180C的溫度來(lái)殺滅微生物3）用于無(wú)菌操作的器械采用灼燒滅菌（三）接種室和超凈工作臺(tái)的滅菌處理1.接種室熏蒸滅菌長(zhǎng)期不用的培養(yǎng)室或接種室要進(jìn)行熏蒸。方法：甲醛、高鎰酸鉀重塞。八、八、2甲醛的用量通常按每立方米空間2-6毫升計(jì)算，高鎰酸鉀的用量是甲醛的一半。室內(nèi)準(zhǔn)備妥當(dāng)后，把稱好的高鎰酸鉀放在瓷碗或燒杯內(nèi)（最好在碗或杯下面鋪一張報(bào)紙，以利清洗），然后將甲醛也倒入碗或杯內(nèi)，立即出屋關(guān)門。幾秒鐘后，甲醛溶液即沸騰揮發(fā)。高鎰酸鉀是一種氧化劑，當(dāng)它與一部

14、分甲醛作用時(shí)，由氧化反應(yīng)產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛揮發(fā)為氣體。甲醛熏蒸接種室應(yīng)至少在使用前24小時(shí)進(jìn)行，熏蒸后密閉保持4小時(shí)以上再進(jìn)入室內(nèi)工作。甲醛對(duì)人的眼、鼻有強(qiáng)烈刺激作用。因此，可在使用前用氨進(jìn)行中和。取與甲醛等量的氨水，倒在另一個(gè)燒杯里，迅速放入熏蒸室內(nèi)，使甲醛和氨水發(fā)生中和反應(yīng)，以消除甲醛味，減少對(duì)人體的刺激作用。使用氨水應(yīng)在工作前2小時(shí)進(jìn)行。對(duì)有材料的培養(yǎng)室，也可以采用乙二醇加熱熏蒸2 .準(zhǔn)備組培室將組培室打掃干凈，調(diào)至適宜溫度3 .超凈工作臺(tái)處理1）材料準(zhǔn)備用75%酉精擦拭，準(zhǔn)備好超凈工作臺(tái)內(nèi)物品，包括酒精棉球、75國(guó)口90%酉精、廢液缸、打火機(jī)、酒精燈、支架、鑲子、解剖刀、解剖剪等2

15、）滅菌處理實(shí)驗(yàn)開始前先用75%酉精擦拭工作臺(tái)面，然后開啟紫外燈，紫外照射20min-30min。關(guān)閉紫外燈，開啟風(fēng)機(jī)10min后打開日光燈。用7075%的酒精拭擦臺(tái)面并消毒雙手。試驗(yàn)用具也應(yīng)該用酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。注意：所有操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過(guò)灼燒進(jìn)行。金屬器械不能過(guò)度灼燒，以防退火。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過(guò)火焰不能時(shí)間太長(zhǎng)。（四）無(wú)菌苗的培養(yǎng)（2016/3/11）1 .培養(yǎng)基配制（方法同（二）培養(yǎng)基的配制與滅菌）種子的萌發(fā)采用1/2MS培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基貯備液I貯備液n貯備液田貯備液IV蔗糖瓊脂12.5mL2.5mL2.5mL

16、2.5mL15g5g2.馬齒覓（番茄）種子處理1）洗去浮塵和上漂的種子，挑選飽滿種子，置于培養(yǎng)瓶中流水沖洗30min后倒掉水備用；2）將種子置于培養(yǎng)瓶中，用75%酉精消毒滅菌3060s,用無(wú)菌水沖洗干凈；3）用1%升汞處理810min,然后用無(wú)菌水沖洗34次，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無(wú)菌接種器械進(jìn)行分離接種。3 .接種及培養(yǎng)1）用酒精擦洗工作臺(tái)和手，對(duì)接種器具進(jìn)行灼燒滅菌；2）打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑲子（90%酉精浸泡并灼燒）將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。3）培養(yǎng)瓶貼上標(biāo)簽，做好標(biāo)記，然后放到光照培養(yǎng)箱中或培養(yǎng)室培養(yǎng)架上進(jìn)行培養(yǎng)，條件為2000-30

17、00LX,26±1,培養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：所有馬齒免無(wú)菌苗均染菌（未拍照）實(shí)驗(yàn)分析：馬齒免種子消毒、滅菌時(shí)間不足接種室和培養(yǎng)實(shí)滅菌不徹底，環(huán)境較臟實(shí)驗(yàn)操作不正確超凈工作臺(tái)不干凈（五）愈傷組織誘導(dǎo)（2016/3/25）1.培養(yǎng)基的配制（方法同（二）培養(yǎng)基的配制與滅菌）愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基組別6-BANNA貯備液I貯備液n貯備液田貯備液IV蔗糖瓊脂一0.5%0.5%25mL5mL5mL5mL15g5g二0.5%1%三0.5%0.5%四1%1%2.無(wú)菌苗和外植體的處理1）無(wú)菌苗處理從培養(yǎng)瓶中取出無(wú)菌苗，用無(wú)菌水洗凈培養(yǎng)基，切成0.5cm大小，葉片較大的進(jìn)行裁剪，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿備用；2）外植體處

18、理a將野外植物洗干凈塵土并用洗衣粉刷干凈；b將洗凈植物切去葉柄，將葉片從葉脈處剪開，再切成34mm的小塊；嫩莖需切取兩個(gè)節(jié)之間的節(jié)間部分，長(zhǎng)約1cm,流水沖洗30min;c將外植體置于培養(yǎng)瓶中，用75%酉精持續(xù)消毒滅菌18s,然后用無(wú)菌水沖洗d用1歷汞處理1215min,然后用無(wú)菌水沖洗34次，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無(wú)菌解剖刀切去兩端后進(jìn)行接種。3 .接種及培養(yǎng)（同無(wú)菌苗的建立）4 .剔除長(zhǎng)菌嚴(yán)重的培養(yǎng)瓶，其余繼續(xù)培養(yǎng)5 .觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)結(jié)果:組別材料染菌率枯死率存活率二馬齒覓100%所有葉柄基部沒有散開，盤龍參根00100%盤龍參-葉綠0100%T?精75%酉精15s升汞

19、：15min色盤龍參-葉基部050%(1)50%(1)苜蓿(花+葉)0花-0葉-50%花：100%葉：50%波斯菊葉00100%第一周(2016/4/8)材馬齒覓盤龍參根料結(jié)果材盤龍參葉盤龍參葉基部料結(jié)果材苜?；?葉波斯菊葉料結(jié)果第二周(2016/4/15)材苜蓿花+葉波斯菊葉開始愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)良好長(zhǎng)愈傷組織化實(shí)驗(yàn)分析：1、僅有無(wú)菌苗染菌：無(wú)菌苗本身染菌，但未被發(fā)現(xiàn)；實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基凝固不徹底，粘到瓶子壁上；培養(yǎng)基pH未調(diào)好；操作時(shí)，動(dòng)作不正確無(wú)菌苗僅用無(wú)菌水洗滌，未用酒精和升汞2、外植體有部分枯死：滅菌過(guò)度，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)3、盤龍參組織無(wú)變化：可能由于培養(yǎng)基中植物激素不適宜，培養(yǎng)室溫度、光照等不恰當(dāng)4、波

20、斯菊長(zhǎng)愈傷組織明顯，此培養(yǎng)基較適宜波斯菊5、不同植物對(duì)植物激素的要求不同，所以在同一濃度下出現(xiàn)不同的結(jié)果（六）生根實(shí)驗(yàn)（類似桿插）（2016/4/15）1.生根培養(yǎng)基配制（方法同（二）培養(yǎng)基的配制與滅菌）生根培養(yǎng)基（1/2MS）組別6-BANNA貯備液I貯備液n貯備液m貯備液IV蔗糖瓊脂二00.2%12.5mL2.5mL2.5mL2.5mL15g5g三0.4%四0.6%2.無(wú)菌苗和外植體的處理1）無(wú)菌苗處理從培養(yǎng)瓶中取出無(wú)菌苗，用無(wú)菌水洗凈培養(yǎng)基，保留部分幼嫩葉片，切成0.5cm大?。ú牧媳M量幼嫩），置于無(wú)菌培養(yǎng)皿備用；2）外植體處理a將野外植物洗干凈塵土并用洗衣粉刷干凈；b將洗凈植物切去老葉

21、，保留頂端嫩葉、嫩莖，切成長(zhǎng)約2cm莖段，流水沖洗30min;c將外植體置于培養(yǎng)瓶中，用75%酉精持續(xù)消毒滅菌18s,然后用無(wú)菌水沖洗d用1歷汞處理13min,然后用無(wú)菌水沖洗34次，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無(wú)菌解剖刀切去兩端后（約1.5cm）進(jìn)行接種3 .接種及培養(yǎng)（同無(wú)菌苗的建立）一瓶接種23個(gè)莖段，直接插入培養(yǎng)基中，形態(tài)學(xué)上端朝上;4 .剔除長(zhǎng)菌嚴(yán)重的培養(yǎng)瓶，其余繼續(xù)培養(yǎng)5 .觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)結(jié)果:組別材料染菌率枯死率存活率二菊花莖（1）0100%075%酉精15s升汞：15min月季莖（2）100%(2)月季花（2）第一周50%(1)第二周100%(2)女貞莖（4）01

22、00%（1長(zhǎng)愈傷組織、3無(wú)變化）香樟（1）100%（有愈傷）杜鵑（1）100%波斯菊莖（1）100%略長(zhǎng)根,第二周長(zhǎng)菌）第一周(206/4/29)材料月季花月季莖結(jié)果綻開，無(wú)根花苞長(zhǎng)真菌，無(wú)根長(zhǎng)真菌，無(wú)根葉稍長(zhǎng)，無(wú)根，未染菌材料菊花莖香樟結(jié)果t,褐化，無(wú)根無(wú)根有白色菌點(diǎn)？or愈傷組織？材料杜鵑波斯菊莖結(jié)果無(wú)根，幾乎無(wú)變化長(zhǎng)勢(shì)旺盛，略微生根材料女貞莖結(jié)果無(wú)變化，無(wú)根第二周(2016/5/6)其余材料均無(wú)明顯變化波斯菊月季花料波斯菊開始長(zhǎng)菌，黃色細(xì)菌，菌落光滑稍長(zhǎng)根，但不明顯結(jié)開始枯萎，無(wú)根果綜合對(duì)比不同濃度NAM波斯菊生根的影（2016/5/6）NAA濃度低>局實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：較高濃度NAA

23、誘導(dǎo)長(zhǎng)根效果更好。如圖所示，隨NAA濃度的增加，波斯菊生根越多，長(zhǎng)勢(shì)越好（七）生芽實(shí)驗(yàn)（2016/5/6）1 .生芽培養(yǎng)基配制（方法同（二）培養(yǎng)基的配制與滅菌）生牙培養(yǎng)基（MS組別6-BANNA貯備液I貯備液n貯備液m貯備液IV蔗糖瓊脂一5%0.4%12.5mL2.5mL2.5mL2.5mL15g5g二5%0.2%三4%0.4%四4%0.2%2.無(wú)菌苗和外植體的處理（同上）1）無(wú)菌苗處理從培養(yǎng)瓶中取出無(wú)菌苗，用無(wú)菌水洗凈培養(yǎng)基，切成0.5cm大小,葉片較大的進(jìn)行裁剪，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿備用；2）外植體處理a將野外植物洗干凈塵土并用洗衣粉刷干凈；b將洗凈植物除葉留芽，切成長(zhǎng)約2cm,流水沖洗30mi

24、n;c將外植體置于培養(yǎng)瓶中，用75%酉精持續(xù)消毒滅菌18s,然后用無(wú)菌水沖洗d用1歷汞處理1215min,然后用無(wú)菌水沖洗34次，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無(wú)菌解剖刀切去兩端后進(jìn)行接種。3 .接種及培養(yǎng)（同無(wú)菌苗的建立）4 .剔除長(zhǎng)菌嚴(yán)重的培養(yǎng)瓶，其余繼續(xù)培養(yǎng)5 .觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)結(jié)果:組別材料染菌率枯死率存活率長(zhǎng)芽舉二波斯菊第三周有染菌12.5%87.5%100%75%酒精15s升汞：15min番茄100%第一周(2016/5/20)材波斯菊料結(jié)有部分果死亡，未死亡的均已生芽，長(zhǎng)勢(shì)好該培亦基適宜用于誘導(dǎo)波斯菊生芽材番茄料結(jié)無(wú)生芽果趨勢(shì)，但是可能要長(zhǎng)愈傷組該培養(yǎng)基濃度不適宜誘導(dǎo)番茄生芽第二周(2016/5/27)材波斯菊莖段生果芽長(zhǎng)勢(shì)良好，開始形成愈傷組織番茄番茄長(zhǎng)果勢(shì)較波斯菊緩慢，第二周生芽（腋芽較多），也形成愈傷組織第三周（2016/6/3）材波斯菊料結(jié)果材料結(jié)果五、部分長(zhǎng)勢(shì)良好，愈傷組織和芽軍生長(zhǎng)旺盛；波斯菊部分死亡,部分開始長(zhǎng)菌，多數(shù)為真菌：1、可能是植物本身含有的菌，培養(yǎng)一段時(shí)間后開始生長(zhǎng)；2、培養(yǎng)瓶蓋子上部的通氣孔有破損3、培養(yǎng)室內(nèi)不干凈番茄番茄是無(wú)菌苗，未出現(xiàn)染