瘧原蟲血片制作

1、瘧原蟲血片的制作工需要材料1 .采血器材：75%酒精棉球、一次性采血針、玻片、推片、鉛筆、干凈的綢布或化纖布。2 .染色材料：姬氏原液.蒸儲水或純凈水：稀釋姬氏原液染色時沖洗染液固定劑：用甲醇或無水乙醇（乙醇含量達(dá)99.9%）,固定薄血膜用無水乙醇擦洗油鏡頭。脫油劑：無水乙醍或二甲苯：鏡檢后的血片脫鏡油。油鏡頭脫油可用無水乙醍：無水乙醇的7:3混合液擦拭。擦鏡紙。二、采血前準(zhǔn)備：1 .玻片準(zhǔn)備我們現(xiàn)在用的玻片都是除去油漬的脫脂玻片，使用前可用綢布擦去玻片上纖維和浮灰，即可使用。新的尚未脫油脂的玻片：用洗衣粉水洗凈后，一一浸泡于95%的酒精中約一周時間，然后一一取由，用軟而潔凈并沒有棉花纖維的細(xì)

2、布擦干，擦亮，收藏好。已用過的舊玻片：先消毒后用洗滌劑清洗，去除污漬，再一一浸泡于95%的酒精中約一周時間，然后一一取由，用軟而潔凈并沒有棉花纖維的細(xì)布擦干，擦亮，收藏好2 .玻片編號：在玻片的磨砂端用鉛筆進(jìn)行編號。玻片編號、檢驗報告單號和登記號應(yīng)一致，并具有唯一性。3 .采血時間：間日瘧、三日瘧原蟲患者可在發(fā)作的任何時間進(jìn)行采血，但由于患者剛發(fā)冷發(fā)熱以后，大部分是在環(huán)狀體期，故這一時期區(qū)別瘧原蟲種類是不容易的。所以在發(fā)作后的68小時內(nèi)采血為最佳，這時環(huán)狀體以滋養(yǎng)發(fā)育成晚期滋養(yǎng)體，較易識別。惡性瘧原蟲；從理論上講，因為惡性瘧原蟲的裂體生殖是在內(nèi)臟的毛細(xì)血管內(nèi)進(jìn)行的，所以在發(fā)作之前，患者的末梢血

3、液中不易查到，但實際情況不盡如此，一般在受感染者的末梢血液中，隨時能見到少量的惡性瘧原蟲的環(huán)狀滋養(yǎng)體；雖然如此,較理想的采血時間，是在發(fā)作后的20小時左右，因為這個時候，環(huán)狀體雖已發(fā)育至最高峰，但尚未回到內(nèi)臟毛細(xì)血管中去進(jìn)行裂體生殖。環(huán)狀體的數(shù)量和構(gòu)造。有助于瘧原蟲種類的鑒別，惡性瘧原蟲的配子體很容易識別，但在初發(fā)時，一般需要在發(fā)作710日后才能在末梢血液在由現(xiàn)，應(yīng)當(dāng)注意。4 .采血的部位和方法；部位：以耳垂采血為主。若由指頭取血則受檢者痛楚較大，且容易引起創(chuàng)口感染，一般不易采用。嬰兒可采集足跟或拇指。方法：讓受檢者位于我們右前方，采集右耳垂血液，這樣便于方便操作，以75%酒精棉球消毒耳垂，（

4、在消毒前擠由多余酒精）待酒精干后，左手拇指和食指緊捏耳垂，右手持一次性采血針迅速刺入，稍用力擠壓（酒精不干不能擠壓，以免血液流生不成滴狀，也不可用干棉花拭去多余酒精，因干棉花中碎纖維較多而污染血膜），采血后應(yīng)盡快制作血片，時間過長會形成纖維蛋白，由現(xiàn)凝血。5,厚、薄血膜制作，染色：厚、薄血膜的形態(tài)和位置：薄血膜：寬2cm,長2.5cm.厚血膜直徑0.81.0cm.假定將玻片劃成三等分，則厚血膜應(yīng)位于中格靠右側(cè)線處，薄血膜則從玻片中央起至左格中部止，右端空格供記錄姓名，編號或貼標(biāo)簽用。厚血膜制作：待血液滴呈綠豆大小時，血量大約45ul用推片的左端下角刮取血滴，放于載玻片的右側(cè)，自內(nèi)向外涂成0.8

5、1.0cm直徑的血膜，涂片結(jié)束前回轉(zhuǎn)一下，使厚血膜均勻。厚血膜制作完畢，用酒精棉球擦去玻片上的血跡，再用干的干凈的布拭去殘留的酒精，厚血膜的厚度以一個油鏡視野內(nèi)可見到510個白細(xì)胞為宜。薄血膜的制備：用推片中央沾取一小滴血，在玻片左側(cè)距離厚血膜約0.5cm處，與載玻片接觸，推片與玻片約成25-35夾角，當(dāng)血液沿推片的邊緣擴(kuò)展至2cm寬時向左邊勻速推成舌狀薄血膜。推成的血膜約成2cm寬X2.5cm長的薄血膜，薄血膜的用血量較少，約是厚血膜的1/10約為1.0ul1.5ul（有推薦用0.5ul1.0ul）即可。推片速度的快慢和角度均影響薄血膜的厚薄程度，最理想的薄血膜是一層血細(xì)胞，血細(xì)胞的分布排列

6、比較均勻，無裂縫、無空泡。采血完畢，用干棉花擦拭耳垂上的血液，推片上的血跡用酒精棉球擦去，再用干布擦干待用（不能使用掉纖維的布）。無論在擦拭玻片，制作血片或染色血片時，手指切勿觸及玻片之上下面以免手上油脂污及玻片面，使薄血膜涂布不均厚血膜易于脫落。另外推片手持端應(yīng)作標(biāo)記，兩端盡量不要混拿，以免人手經(jīng)常拿捏，推片受到手上的油漬污染而影響血膜質(zhì)量。血片干燥制成的血膜必須完全干燥后方可進(jìn)行固定染色，否則薄血膜中紅細(xì)胞邊緣褶皺，厚血膜染色時易脫落，而由現(xiàn)網(wǎng)狀的背景。反之，血片放置過久則有霉菌及枯草桿菌生長，血紅蛋白凝固，也不能鏡檢。薄血膜在自然情況下約需10分鐘，厚血膜需30分鐘。應(yīng)將血片用有蓋器皿罩

7、住，防灰塵落入，放37c溫箱，20分鐘可干透。放入溫箱干燥時間不能超過1周，否則染色后厚血膜背景顏色較深，影響觀察。厚血膜如不能及時染色時，先將薄血膜固定，夏天應(yīng)在48小時內(nèi)，冬天應(yīng)在72小時內(nèi)對厚血膜進(jìn)行溶血處理（不適用抗凝血），干燥后再保存。否則厚血膜會自然固定而不能溶血，影響鏡檢。注意：制成的血片切勿用火烤、日曬或放在新購置的標(biāo)本盒內(nèi)，以免血紅蛋白凝固無法脫掉。血片放置待干時不可傾斜，否則厚血膜中血細(xì)胞沉在一邊，可使厚薄不均。止匕外，還要防止蒼蠅吮吸和灰塵污染。.固定、染色（姬氏染色法）干燥后的血片用棉簽瓶取甲醇或無水乙醇在薄血膜上輕輕涂抹（最好是將甲醇倒入一個干凈的50mL小燒杯中，將

8、薄血膜浸沒其中，以減少棉簽中的灰塵和碎纖維的污染），注意不要碰到厚血膜，否則使血紅蛋白凝固，厚血膜不能鏡檢，約12分鐘血片干后，即可進(jìn)行染色。染液的稀釋：染液在臨用前要進(jìn)行稀釋，上面發(fā)放的姬氏為原液。其稀釋方法：8m水（到空染色瓶的頸部）加10滴原液，染2025min,實際工作中我們經(jīng)過比對，覺得8mL水加14滴原液能達(dá)到較為滿意的效果，并根據(jù)血片的數(shù)量，按每張血片滴加染液1.52mL的量，配制稀釋液量，稀釋后的染色液最好一次用完，放置過久影響著色效果。若厚血膜過厚，可先滴加蒸儲水?dāng)?shù)滴溶去血紅蛋白，約需2min,時間不宜過長，否則血膜易脫落，傾去蒸儲水，待血膜干后再滴加染液染色，或直接在厚血膜

9、上滴加2滴蒸儲水后，不倒去蒸儲水即刻直接滴加稀釋染液（注：這兩種方法對抗凝血不適用）使染液覆蓋整個血膜。夏天染2530min即可，冬天需4060min能達(dá)到較為滿意的效果。沖洗、干燥：血片染到時間后，用蒸儲水沖洗，沖洗時不能對準(zhǔn)血膜沖，應(yīng)在無血膜地方注加蒸儲水，使染液溢由，直到染液沖洗完，切不可先倒去染液，否則染液殘渣吸附在血膜上即便再沖洗多遍也無濟(jì)于事，或在一個盆中放入足夠多水，將血片和染液一同浸入水中漂洗并在水中擺動幾下（對于用抗凝血制成的血片，在沖洗時厚血膜極易脫落，所以只能用此種方法漂洗），對去除灰塵和染液殘渣效果比較好。沖洗好的血片放于自然環(huán)境下12h,或37c溫箱20min左右即可

10、鏡檢。染色效果判斷：著色較好的血膜，紅細(xì)胞呈淡紅色，嗜酸性粒細(xì)胞的顆粒呈桔紅色，嗜中性粒細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，中性粒細(xì)胞胞漿顆粒呈淡紅色，淋巴細(xì)胞及瘧原蟲胞漿呈藍(lán)色或淡藍(lán)色，瘧原蟲核呈紅色。除環(huán)狀體外，其他各期均可查見痕色素。影響染色效果的因素：染料和溶劑的質(zhì)量：染料、甲醇和甘油如不純，常使配成的染液偏酸或偏堿，影響染色結(jié)果。因此，必須用分析純的甲醇和中性甘油，配制時所用器具必須干凈無水。染液的新舊：新配制的染液，一般著色力較弱，常呈堿性。染液放置時間稍長，染色力逐漸增加，故應(yīng)在染色前1-2周先將染液配好。盛染液的瓶子應(yīng)密封，以免影響染液質(zhì)量染液稀釋后的使用時間：染液稀釋后，一般在半小時內(nèi)使用，時間

11、太長也會影響染色效果染液的濃度:染液濃度高，著色快，各種細(xì)胞著色深，薛氏點、茂氏點等粗大顯著；染液濃度低，著色慢，但各種細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)著色均勻、清晰，如環(huán)狀體、子抱子及痕色素等顏色分明，但薛氏點、茂氏點不夠清楚。染色時間（應(yīng)根據(jù)染液的質(zhì)量、新舊、濃度和氣溫決定）；染色時間長，染色效果好，溫度高著色快，染色用水的PH值（7.07.2）:當(dāng)染色太藍(lán)，可用PH較低的緩沖水沖洗；如染色太紅，則用PH較高的緩沖水沖洗；如染色太深，可延長沖洗時間，予以糾正。沖洗方法：染色后不能直接將染液倒掉。應(yīng)將玻片連同染液一起放入水中漂洗，或沿玻片及染色缸邊緣加水使染液表層溢生，并輕輕沖洗，以免染色顆粒沾污血膜。附：瑞氏

12、染色與姬氏染色的區(qū)別瑞氏染色姬氏染色厚血片薄血片厚血片薄血片血用N作相同相同相同相同干燥2030分鐘2030分鐘2030分鐘2030分鐘厚、薄血膜染色前的處理用蒸儲水溶去血紅蛋白至血膜呈灰白色，干燥不需要處理不需要處理（若厚血膜較厚，可先溶血）用甲醇或無水乙醇固定染色液不需要稀釋臨用前用蒸儲水稀釋染色時間原液染色1分鐘。再加蒸儲水稀釋后染78分鐘。氣溫20c以上染3040分鐘；20c以下染4060分鐘。干燥2030分鐘2030分鐘鏡檢100X（油鏡頭）姬氏染色效果穩(wěn)定，染色時間和染液濃度對結(jié)果影響較小，染色后的血膜保存時間較長，同時姬氏染劑能長期保存而不變質(zhì)，染色技術(shù)也易掌握，被推薦使用，瑞氏

13、染色法因操作簡便,常用于個別血片染色。三、鏡檢工作中所注意的事項1 .在鏡檢中顯微鏡的使用：油鏡、凹鏡、視野需按一定的順序逐個檢查。2 .瘧原蟲鏡檢工作中，凡是發(fā)熱病人。瘧疾、疑似瘧疾、及不明原因的發(fā)熱病人均需要進(jìn)行瘧原蟲鏡檢。3 .做好鏡檢登記：凡是鏡檢瘧原蟲的均需如實登記，陰陽性片保存待查，4 .如發(fā)現(xiàn)惡性瘧以最快的通信方式上報。四、實際工作中我們發(fā)現(xiàn)的幾個常見問題歸納如下1 .血片制作不規(guī)范比較常 厚血膜血量較大，薄血膜用力不均勻，薄血膜制作較厚 血膜位置不規(guī)范，厚、薄血膜安排不當(dāng)。厚、薄血膜間距離相隔過大 血膜太靠近玻片的邊緣。 厚、薄血膜位置顛倒，方向錯誤，將薄血膜沿著厚血膜方向推，厚、薄血膜易相觸2 .將姬氏染色方法與瑞氏染色方法混淆 姬氏原液不稀釋，直接滴加在血膜上，使厚、薄血膜均被固定。厚血膜一團(tuán)黑，不能鏡檢。 薄血膜未固定，直接用姬氏染色，薄血膜脫落。3 .染色時間不夠，滴加染液后很快沖洗