脂質(zhì)體制備試驗

1、實驗十脂質(zhì)體的制備及包封率的測定一、實驗?zāi)康? .掌握薄膜分散法制備脂質(zhì)體的工藝。2 .掌握用陽離子交換樹脂法測定脂質(zhì)體包封率的方法。3 .熟悉脂質(zhì)體形成原理，作用特點。4 .了解“主動載藥”與“被動載藥”的概念。二、實驗指導(dǎo)脂質(zhì)體是由磷脂與（或不）與附加劑為骨架膜材制成的具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊狀體。常見的磷脂分子結(jié)構(gòu)中有兩條較長的疏水煌鏈和一個親水基團，將適量的磷脂加至水或緩沖溶液中，磷脂分子定向排列，其親水基團面向兩側(cè)的水相，疏水的煌鏈彼此相對締和為雙分子層，構(gòu)成脂質(zhì)體。用于制備脂質(zhì)體的磷脂有天然磷脂，如豆磷脂、卵磷脂等；合成磷脂，如二棕桐酰磷脂酰膽堿，二硬脂酰磷脂酰膽堿等。常用的附加劑

2、為膽固醇。膽固醇也是兩親性物質(zhì)，與磷脂混合使用，可制得穩(wěn)定的脂質(zhì)體，其作用是調(diào)節(jié)雙分子層的流動性，減低脂質(zhì)體膜的通透性。其他附加劑有十八胺、磷脂酸等，這兩種附加劑能改變脂質(zhì)體表面的電荷性質(zhì)，從而改變脂質(zhì)體的包封率、體內(nèi)外其他參數(shù)。脂質(zhì)體可分為三類：小單室（層）脂質(zhì)體，粒徑為2050nm,經(jīng)超聲波處理的脂質(zhì)體，絕大部分為小單室脂質(zhì)體；多室（層）脂質(zhì)體，粒徑約為4003500nm,顯微鏡下可觀察到尤如洋蔥斷面或人手指紋的多層結(jié)構(gòu)；大單室脂質(zhì)體，粒徑約為2001000nm,用乙醛注入法制備的脂質(zhì)體多為這一類。脂質(zhì)體的制法有多種，根據(jù)藥物的性質(zhì)或需要進行選擇。（1）薄膜分散法：這是一種經(jīng)典的制備方法，

3、它可形成多室脂質(zhì)體，經(jīng)超聲處理后得到小單室脂質(zhì)體。此法優(yōu)點是操作簡便，脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)典型，但包封率較低。（2）注入法：有乙醛注入法和乙醇注入法等?！耙胰┳⑷敕ā笔菍⒘字饶げ牧先苡谝胰┲?，在攪拌下慢慢滴于5565c含藥或不含藥的水性介質(zhì)中，蒸去乙醛，繼續(xù)攪拌12h,即可形成脂質(zhì)體。（3）逆相蒸發(fā)法：系將磷脂等脂溶性成分溶于有機溶劑，如氯仿中，再按一定比例與含藥的緩沖液混合、乳化，然后減壓蒸去有機溶劑即可形成脂質(zhì)體。該法適合于水溶性藥物、大分子活性物質(zhì)，如胰島素等的脂質(zhì)體制備，可提高包封率。（4）冷凍干燥法：適于在水中不穩(wěn)定藥物脂質(zhì)體的制備。（5）熔融法：采用此法制備的多相脂質(zhì)體，其物理穩(wěn)定性好，可

4、加熱滅菌。在制備含藥脂質(zhì)體時，根據(jù)藥物裝載的機理不同，可分為“主動載藥”與“被動載藥”兩大類。所謂“主動載藥”，即通過內(nèi)外水相的不同離子或化合物梯度進行載藥，主要有K+-Na+梯度和H+梯度（即pH梯度）等。傳統(tǒng)上，人們采用最多的方法是“被動載藥”法。所謂“被動載藥”，即首先將藥物溶于水相或有機相（脂溶性藥物）中，然后按所選擇的脂質(zhì)體制備方法制備含藥脂質(zhì)體，其共同特點是：在裝載過程中脂質(zhì)體的內(nèi)外水相或雙分子層膜上的藥物濃度基本一致，決定其包封率的因素為藥物與磷脂膜的作用力、膜材的組成、脂質(zhì)體的內(nèi)水相體積、脂質(zhì)體數(shù)目及藥脂比（藥物與磷脂膜材比）等。對于脂溶性的、與磷脂膜親和力高的藥物，“被動載藥

5、”法較為適用。而對于兩親性藥物，其油水分配系數(shù)受介質(zhì)的pH值和離子強度的影響較大，包封條件的較小變化，就有可能使包封率有較大的變化。評價脂質(zhì)體質(zhì)量的指標(biāo)有粒徑、粒徑分布和包封率等。其中脂質(zhì)體的包封率是衡量脂質(zhì)體內(nèi)在質(zhì)量的一個重要指標(biāo)。常見的包封率測定方法有分子篩法、超速離心法、超濾法等。本文采用陽離子交換樹脂法測定包封率?！瓣栯x子交換樹脂法”是利用離子交換作用，將荷正電的未包進脂質(zhì)體中的藥物（即游離藥物），如本實驗中的游離的小萊堿，被陽離子交換樹脂吸附除去。而包封于脂質(zhì)體中的藥物（如小萊堿），由于脂質(zhì)體荷負(fù)電荷，不能被陽離子交換樹脂吸附，從而達(dá)到分離目的，用以測定包封率。三、實驗內(nèi)容和操作（一

6、）空白脂質(zhì)體的制備1 .處方注射用豆磷脂0.9g膽固醇0.3g無水乙醇12ml磷酸鹽緩沖液適量制成30ml脂質(zhì)體2 .操作（1）磷酸鹽緩沖液（PBS的配制：稱取磷酸氫二鈉（NaHPO-12噸0）0.37g與磷酸二氫鈉（NaH2P02H2O）2.0g,加蒸儲水適量，溶解并稀釋至1000ml（pPH約為5.7）。(2)稱取處方量磷脂、膽固醇于50ml小燒杯中，加無水乙醇12ml,置于6570c水浴中，攪拌使溶解，旋轉(zhuǎn)該小燒杯使磷脂的乙醇液在杯壁上成膜，用吸耳球輕吹風(fēng)，將乙醇揮去。(3)另取磷酸鹽緩沖液30ml于小燒杯中，同置于6570c水浴中，保溫，待用。(4)取預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液30ml,加至含

7、有磷脂和膽固醇脂質(zhì)膜的小燒杯中，6570c水浴中攪拌水化10min。隨后將小燒杯置于磁力攪拌器上，室溫，攪拌3060min,如果溶液體積減少，可補加水至30ml,混勻，即得。(5)取樣，在油鏡下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)，畫出所見脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，記錄最多和最大的脂質(zhì)體的粒徑；隨后將所得脂質(zhì)體溶液通過0.8匹微孔濾膜兩遍，進行整粒，再于油鏡下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)，畫出所見脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，記錄最多和最大的脂質(zhì)體的粒徑。3 .操作注意(1)在整個實驗過程中禁止用火。(2)磷脂和膽固醇的乙醇溶液應(yīng)澄清，不能在水浴中放置過長時間。(3)磷脂、膽固醇形成的薄膜應(yīng)盡量薄。(4)6065c水浴中攪拌水化10min時，一定要充分保證

8、所有脂質(zhì)水化，不得存在脂質(zhì)塊。(二)被動載藥法制備鹽酸小集堿脂質(zhì)體1 .處方注射用豆磷脂0.6g2ml膽固醇0.2g無水乙醇1鹽酸小萊堿溶液(1mg/ml)30ml制成30ml脂質(zhì)體2 .操作(1)鹽酸小萊堿溶液的配制：稱取適量的鹽酸小萊堿溶液，用磷酸鹽緩沖液配成1mg/ml和3mg/ml的兩種濃度的溶液。(2)鹽酸小萊堿脂質(zhì)體的制備按處方量稱取豆磷脂、膽固醇置50ml的小燒杯中，加無水乙醇12ml,余下操作除將磷酸鹽緩沖液換成鹽酸小萊堿溶液外，同"空白脂質(zhì)體制備"，即為"被動載藥"法制備的小萊堿脂質(zhì)體。3 .操作注意：同前。(三)主動載藥法制備鹽酸小集

9、堿脂質(zhì)體1 .檸檬酸緩沖液：稱取檸檬酸10.5g和檸檬酸鈉7g置于1000ml量瓶中，加水溶解并稀釋至1000ml,混勻，即得。2 .NaHCO溶液：稱取NaHCO50g,置于1000ml量瓶中，加水溶解并稀釋至1000ml,混勻，即得。3 .空白脂質(zhì)體制備：稱取磷脂0.9g和膽固醇0.3g,置于50ml或100ml燒杯中，加2ml無水乙醇，于6570c水浴中溶解并揮散乙醇，于燒杯上成膜后，加入同溫的檸檬酸緩沖液30ml,6570c水浴中攪拌水化10分鐘，隨后將燒杯取出，置于電磁攪拌器上，在室溫下攪拌3060分鐘，充分水化，補加蒸儲水至30ml,所得脂質(zhì)體溶液通過0.8g微孔濾膜兩遍，進行整粒

10、。4 .主動載藥：準(zhǔn)確量取空白脂質(zhì)體2ml、藥液(3mg/ml)1ml、NaHCO容?夜0.5ml,在振搖下依次加于10ml西林瓶中，混勻，70c水浴中保溫20分鐘，隨后立即用冷水降溫，即得。5 .操作注意：(1)"主動載藥"過程中，加藥順序一定不能顛倒，加三種液體時，隨加隨搖，確?；旌暇鶆?，保證體系中各部位的梯度一致。(2)水浴保溫時，也應(yīng)注意隨時輕搖，只需保證體系均勻即可，無需劇烈搖。(3)用冷水冷卻過程中，也應(yīng)輕搖。(四)鹽酸小集堿脂質(zhì)體包封率的測定1 .陽離子交換樹脂分離柱的制備：稱取已處理好的陽離子交換樹脂適量，裝于底部已墊有少量玻璃棉的5ml注射器筒中，加入PB

11、S水化陽離子交換樹脂，自然滴盡PBS即得。2 .柱分離度的考察：(1)鹽酸小萊堿與空白脂質(zhì)體混合液的制備：精密量取3mg/ml鹽酸小萊堿溶液0.1ml,置小試管中，加入0.2ml空白脂質(zhì)體，混勻，即得。(2)對照品溶液的制備：取(1)中制得的混合液0.1ml置10ml量瓶中，加入95叱酉I6ml,振搖使之溶解，再加PBS至刻度，搖勻，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液4ml于10ml量瓶中，力口PBS至亥I度，搖勻，得對照品溶液。（3）樣品溶液的制備：?。?）中制得的混合液0.1ml至分離柱頂部，待柱頂部的液體消失后，放置5分鐘，仔細(xì)加入PBS（注意不能將柱頂部離子交換樹脂沖散）進行洗脫（約需23ml

12、PBS）,同時收集洗脫液于10ml量瓶中，加入95叱酉I6ml,振搖使之溶解，再加PBS至刻度，搖勻，過濾，棄取初濾液，取續(xù)濾液為樣品溶液。（4）空白溶媒的配制：取乙醇（95%30ml,置50ml量瓶中，力口PBS至亥U度，搖勻，即得。（5）吸收度的測定：以空白溶媒為對照，在345nm波長處分別測定樣品溶液與對照品溶液的吸收度，計算柱分離度。分離度要求大于0.95A柱分離度=1_樣A對X25式中A樣-樣品溶液的吸收度，A-對照品溶液白吸收度，2.5-對照品溶液的稀釋倍數(shù)。3 .包封率的測定精密量取鹽酸小萊堿脂質(zhì)體0.1ml兩份，一份置10ml量瓶中，按柱分離度考察項下（2）進行操作，另一份置于分離柱頂部，按"柱分離度考察"項下（3）進行操包封率作，所得溶液于345nm波長處測定吸收度，按下式計算包封率。100%式中A-通過分離柱后收集脂質(zhì)體中鹽酸小萊堿的吸收度，At-鹽酸小萊堿脂質(zhì)體中總的藥物吸收度。四、實驗結(jié)果與結(jié)論1 .繪制顯微鏡下脂質(zhì)體的形態(tài)圖，從形態(tài)上看，"脂質(zhì)體"、"乳劑"及"微囊"有何差別。2 .記錄顯微鏡下可測定的脂質(zhì)體的粒徑。最大粒徑（而最多粒徑（而3 .計算柱分離度與包封率。4 .以包封率為指標(biāo)，對&qu