實(shí)驗(yàn)一--大腸桿菌基因組提取

1、在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，首先對(duì)實(shí)驗(yàn)的一些必須步驟（注：在幾乎每一次小實(shí)驗(yàn)都會(huì)使用到的試驗(yàn)方法）做一定的解釋。避免在寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的過(guò)程中太過(guò)混亂！并且這些過(guò)程并不是每一位同學(xué)都參與了的，故在本實(shí)驗(yàn)報(bào)告的開(kāi)篇寫(xiě)出。（一）制備1%的瓊脂糖凝膠稱(chēng)取1g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入100mL的1kAE緩沖液，在微波爐中加熱。完全融化后，取出搖勻。（二）膠板的制備1. 用橡皮膏將膠板的兩端邊緣封閉好。2. 將膠板放在水平處，放好樣品梳子。3. 將冷卻到60C左右的瓊脂糖凝膠緩慢倒入膠板中，注意不要產(chǎn)生氣泡。膠的厚度在3-5mm之間。4. 待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放入電泳槽內(nèi)（注意：梳子的方向靠近負(fù)極）。5. 向

2、電泳槽中加入1TAE緩沖液，緩沖液要浸沒(méi)凝膠。（三）加樣1. 在樣品中加入適量的10及樣緩沖液，使緩沖液的終濃度為1X用微量移液器將已加入緩沖液的樣品加入上樣孔中。記錄加樣的順序和加樣量。（注意：加樣的過(guò)程中不要讓樣品溢出上樣孔）（四）電泳接通電泳槽與電泳儀的電源（注意DNA片段是從負(fù)極向正極移動(dòng)）。DNA的遷移速度與電壓成正比。最高電壓不超過(guò)5V/cmo1. 當(dāng)漠酚藍(lán)染料移動(dòng)到凝膠的2/3處時(shí)，停止電泳。（五）染色將電泳后的凝膠浸入漠化乙錠染色液中（帶手套操作）。（六）觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果在紫外燈（360nm或254nm）下觀察染色后的凝膠，DNA處顯出橘紅色的火光條用。實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌基因組提取【實(shí)

3、驗(yàn)?zāi)康摹?. 學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌基因組的提取方法【實(shí)驗(yàn)原理】DN此一個(gè)環(huán)形的大分子DNA真核生物的DNA以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)。不同種屆的生物，以及不同形式的細(xì)胞（如菌類(lèi)、培養(yǎng)細(xì)胞、植物組織，動(dòng)物組織）基因組提取的方法是不同的，但其基本原則是類(lèi)似的，即既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和糖類(lèi)等分離，乂要保持DN的子的完整。提取DNA勺一般過(guò)程是將分散好的組織細(xì)胞在含十二烷基硫酸鈉（SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的DNA容液經(jīng)乙醇沉淀使DNM溶液中析出。SDS的作用機(jī)理是由于其能結(jié)合蛋白，中和蛋白的電性，使蛋白質(zhì)的非共價(jià)鍵受到破壞，失去二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而變

4、形失活，蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在的情況下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA勺反應(yīng)體系中，SDS通過(guò)失活蛋白破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白與DN離；而蛋白酶K可將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA子完整地分離出來(lái)。CTAB什六烷基三乙基漠化鉉）是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3mol/LNaCl）時(shí)，從溶液中沉淀，通過(guò)離心就可將CTAB核酸的復(fù)合物與蛋白，多糖類(lèi)物質(zhì)分開(kāi)。最后通過(guò)乙醇或異丙醇沉淀DNA而CTAB容于乙醇或異丙醇而除去?！緦?shí)驗(yàn)材料】大腸桿菌DH

5、成菌液【實(shí)驗(yàn)試劑】LB液體培養(yǎng)基,TE溶液，10%SDS蛋白酶K,5mol/LNaCl,CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/異戊醇，異丙醇，70%L醇【實(shí)驗(yàn)儀器與用具】微量移液器，低溫離心機(jī)，水浴鍋，eppendorf管，恒溫?fù)u床【實(shí)驗(yàn)步驟】（1）將2mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的大腸桿菌DH&菌液5000rpm冷凍離心10min棄上活;(2) 加190pLTE懸浮沉淀，并加10pL10%SDS1pL20mg/mL白酶K,混勻，37C保溫1h;(3) 加30卜L5mol/LNaCl,混勻；(4) 加30pLCTAB/NaCl溶液，混勻，65C保溫20min；(5) 加入300卜L酚/氯仿/異戊醇(25:24

6、:1)抽提，5000rpm離心10min,將上活液移至干凈離心管;(6) 加入300L氯仿/異戊醇(24:1)抽提，取上活液移至干凈管中；(7) 加300L異丙醇，顛倒混合，室溫下靜止10min,沉淀DNA(8) 5000rpm離心10min,沉淀DNA加入500L70(醇，5000rpm離心10min,棄乙醇，吸干；(9) 溶解丁20HLTE,取3L用丁瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，其余-20C保存。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】109876M如圖所示，8號(hào)為本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)比maker,第一條帶為正常大腸桿菌基因組，中間可以看見(jiàn)模糊的兩條帶，可能為斷裂的基因組片段，下面最亮的為RNA出現(xiàn)斷裂的基因組可能是由丁操

7、作過(guò)丁劇烈。本組電泳帶還比較活晰整齊，其他組不整齊的帶可能是電泳技術(shù)問(wèn)題。RNAt量很大，所以出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)二大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及驗(yàn)證【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化的原理2. 學(xué)習(xí)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法3. 為重組子的轉(zhuǎn)化做準(zhǔn)備【實(shí)驗(yàn)原理】本實(shí)驗(yàn)采用CaCb制備大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞。所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）最易接受外源DNM段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時(shí)也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。Cf也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)

8、，可加入占總體積15%勺無(wú)菌甘油或-70C保存。在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DN觸以其為載體構(gòu)建的重組DN隔入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法（如：電擊法，CaC2等化學(xué)試劑法）處理后，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DN冶子通過(guò)的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的DN的子通過(guò)復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化常用化學(xué)法（CaCl2法）。其原理是細(xì)菌處于0C,CaCl2的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DN郁成抗DNase（DNASB）的羥基-鈣磷

9、酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42C短時(shí)間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸收DNA合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值。被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子中基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子?！緦?shí)驗(yàn)材料】大腸桿菌DH成【實(shí)驗(yàn)試劑】LB液體培養(yǎng)基，0.1mol/Lcacl2溶液【實(shí)驗(yàn)器材】恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，高壓滅菌鍋，低溫離心機(jī)，微量移液器【實(shí)驗(yàn)步驟】一、感受態(tài)細(xì)胞的制備1. 將凍存的菌種1:100接種于3ml的LB液體培養(yǎng)基中，37C搖床過(guò)夜震蕩培養(yǎng)。2. 取1ml活化菌種接種于100mlLB培養(yǎng)基中，37C搖床培養(yǎng)1.5-2h。3. 將菌種在冰上放置10min。4C、400

10、0rpm下離心10min收集菌體。4. 棄上活，用事先冰浴的0.1mol/Lcacl2重新懸浮細(xì)胞，冰浴30min。5. 收集菌體，條件同上。6. 棄上活，在冰浴條件下加入0.1mol/Lcacl2溶液。7. 分裝保存（40冊(cè)油與感受態(tài)細(xì)胞1:1混合，使甘油的終濃度為20%。二、驗(yàn)證（一）制備含Amp勺藍(lán)白斑篩選瓊脂平板1. LB固體培養(yǎng)基融化后，待冷卻到60C左右，加入氨節(jié)宵霉素（工作濃度為100四/mL）,混勻，倒入培養(yǎng)也中。2. 培養(yǎng)基凝固后，在瓊脂平板上加入40L的20mg/mL的X-Gal和4L的200mg/mLIPTG容液，用涂布器涂勻。避光保存3h,以利于IPTG和X-Gal的吸

11、收。（二）重組子的轉(zhuǎn)化取200L甘油保存的感受態(tài)細(xì)胞，低溫融化后，加入1L的重組質(zhì)粒（DNA50ng），混勻，冰上放置30min。同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照：（1）陰性對(duì)照：200受態(tài)細(xì)胞，不加任何質(zhì)粒DNA（2）陽(yáng)性對(duì)照：200受態(tài)細(xì)胞，加入不帶外源DNA勺空載體。1. 將轉(zhuǎn)化的混合物立即放入42C循環(huán)水浴中90sec（注意：不要晃動(dòng)）。2. 然后冰浴2min。3. 在轉(zhuǎn)化子中加入600不含Amp勺LB液體培養(yǎng)基，37C搖床培養(yǎng)1h（慢搖）。4. 4000rpm離心5min,沉淀細(xì)菌細(xì)胞。5. 用微量移液器去除上活溶液600L。將沉淀與剩余的上活混勻，涂在制備好的含Amp的瓊脂平板上。陰性對(duì)照的轉(zhuǎn)化混合

12、物，一部分涂于含Am州瓊脂平板，一部分涂于不含Amp勺瓊脂平板上，以檢測(cè)感受態(tài)細(xì)胞是否污染。6. 待菌液完全被吸收后，37C倒置培養(yǎng)12-16h?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】實(shí)驗(yàn)結(jié)果：感受態(tài)細(xì)胞制備成功，而且轉(zhuǎn)化效率比較高。陰性對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)菌落，結(jié)果正常。分析以及討論：感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響因素(1) 細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度最好從-70C或-20C甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4C的培養(yǎng)菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5X107個(gè)左右為佳。即應(yīng)用對(duì)數(shù)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期的細(xì)菌，可通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的OD00控制。對(duì)TG1菌株，OD00為0.5時(shí)，細(xì)胞

13、密度在5X107個(gè)/ml左右。(應(yīng)注意ODb。值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同)。密度過(guò)高或不足均會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。此外，受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性?xún)?nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。(2) 質(zhì)粒DNA勺質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNAS主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA勺濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA勺量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。一般地，DNA容液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5%1ng的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。對(duì)于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實(shí)驗(yàn)證明，大于

14、30kb的重組質(zhì)粒將很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此外，重組DN的子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10-100倍，因此重組DNM都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。(3) 試劑的質(zhì)量所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4C。(4) 防止雜菌和雜DNA勺污染整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，所用器也，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DN服或雜DN所污染，否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA勺轉(zhuǎn)入。(5) 整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開(kāi)冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會(huì)降低。實(shí)驗(yàn)三重組子的制備和轉(zhuǎn)化

15、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握PCR回收與連接的原理2. 掌握重組質(zhì)粒制備的方法【實(shí)驗(yàn)原理】(一)PCR原理聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR是一種體外DNAT增技術(shù)。該技術(shù)能在幾小時(shí)的實(shí)驗(yàn)操作中，將人為選定的一段DNAT增幾白萬(wàn)倍，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便和應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)。PCR勺工作原理類(lèi)似于DNA勺體內(nèi)復(fù)制過(guò)程，是將待擴(kuò)增的DNAt斷和與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苜酸鏈引物經(jīng)變性、退火及延伸三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使特定的DNM斷在數(shù)量上呈指數(shù)增加。PCFT增首先需要一對(duì)引物，根據(jù)待擴(kuò)增區(qū)域兩側(cè)的已知序列合成兩個(gè)與棋板DNM補(bǔ)的寡核苜酸作為引物，引物序列將決定擴(kuò)增片段

16、的特異性和片段長(zhǎng)度。反應(yīng)體系由棋板DNA一對(duì)引物、dNTR耐高溫的DN麻合酶、酶反應(yīng)緩沖體系及必須的離子等所組成。PCRS應(yīng)循環(huán)的第一步為加熱變性，使雙鏈棋板DNA變性為單鏈；第二步為復(fù)性，每個(gè)引物將與互補(bǔ)的DNAff列雜交；第三步為延伸，在耐高溫的DN麻合酶作用下，以變性的單鏈DNA為棋板，從引物3,端開(kāi)始按5，t3,方向合成DN筋。這樣經(jīng)過(guò)一個(gè)周期的變性一一復(fù)性一一延伸等三步反應(yīng)就可以產(chǎn)生倍增的DNA假設(shè)PCR勺效率為100%,反復(fù)n周期后，理論上就能擴(kuò)增2n倍。PCFK應(yīng)一般30-40次循環(huán)，DNAt段可放大數(shù)白萬(wàn)倍。常規(guī)PCR反應(yīng)用于已知DNA序列的擴(kuò)增，變性溫度為95C,復(fù)性溫度為3

17、7C55C,延伸合成溫度為72C,DN麻合酶為T(mén)aq酶(可耐受95C左右的局溫而不失活），反應(yīng)循環(huán)數(shù)為30如圖:123高溫空性依溫退火適溫延伸-.A22/子最延伸/QNA加倍DM西單埔與引牧黛性-匚山兀雙媛旋（二）DNA重組技術(shù)重組DNA（RecombinantDNA）技術(shù)是遺傳工程的核心技術(shù)，也是人類(lèi)在基因和DNA分子水平進(jìn)行操作的技術(shù)。它包括以下幾個(gè)步驟:1）重組DNA分子的構(gòu)建：即將目的基因（DNA或cDNA片段）與載體DNA重組，應(yīng)用TA克隆方法，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物快速克隆至質(zhì)粒載體中。該方法利用了PCR過(guò)程中使用的熱穩(wěn)定聚合酶（Taq酶）在所復(fù)制的雙鏈分子末端加上單一脫氧腺苜酸（A）,

18、從而產(chǎn)生一A-粘性末端的性質(zhì)，設(shè)計(jì)一種線性載體，使之含有一T-粘性末端，可直接插入PCR產(chǎn)物,在DNA連接酶作用下，目的DNA和載體DNA連接形成重組DNA分子?！緦?shí)驗(yàn)器材】PCFT增儀，臺(tái)式高速離心機(jī)，移液器，經(jīng)高壓滅菌后的Eppendorf管，電泳儀，回收試劑盒。【實(shí)驗(yàn)試劑】（1）模板DNA（0.1g/曰）用牙簽挑取單菌落懸:浮到50H1的裂解液中（裂解液1%TritonX-100,20mmol/lTris-HClPH8.2,2mmol/lEDTA）,95C溫浴10分鐘，10000rpm離心5分鐘，取21上活液用丁總體積50心的PCR5應(yīng)。(3) （2）TaqDN唾合酶（5U/pl）,10

19、X擴(kuò)增緩沖液,dNTP（1mmol/L）:購(gòu)買(mǎi)引物(100pmol/L):設(shè)計(jì)并合成與目的DNAW側(cè)互補(bǔ)的引物內(nèi)。(6) 回收試劑T4DNA接酶10X連接反應(yīng)緩沖液50%PEG4000【實(shí)驗(yàn)步驟】-、PC滋術(shù)體外擴(kuò)增DNAt段1. 在已滅菌的0.5mL的離心管中配制PC版應(yīng)的25應(yīng)應(yīng)體系。依次加入卜列試劑：Premix溶液12.5aL引物11aL引物21aL棋板DNA1uL雙蒸水9.5jiL2. PCR反應(yīng)條件94C1mint94C30sect50C1mint72C3mint72C5mint4C保存，從第二步至第四步30個(gè)循環(huán)。3. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和分析PCR吉果。二、DNAt段的回收

20、在本實(shí)驗(yàn)中，目的DN隔段的回收采用的是北京鼎國(guó)生物DN收/純化試劑盒溶液A100mL6mol/LNaClO4,0.03mol/LNaAc(pH5.2),少量酚紅溶液B1.5mL3mol/LNaAc溶液C60mL用時(shí)需要加入70mL無(wú)水乙醇，充分混勻溶液D6mLTE緩沖液DNAt段回收方法切取含DNM段的瓊脂糖(100mg-300mg，以1:3(切取重量與溶液的A體積比)加入溶液A;50-65C水浴5-10min,待凝膠全部溶化，其間振蕩助溶2-3次，加入15L溶液B,充分混勻；(1) 將溶液置于離心柱中，靜止2min,10000rpm離心30s；若一次加不完，可分兩次離心；(2) 倒掉液體，加

21、500L溶液C于離心柱中，10000rpm離離心30s,棄液體。(3) 重復(fù)步驟(4)一次；(4) 12000rpm離心1min,甩十剩余液體，除去殘余的灑精；(5) 將離心柱放置于新的離心管中，室溫敞開(kāi)離心管蓋，放置10min,使乙醇揮發(fā)殆盡；(6) 加入20L溶液D(50C水浴)，靜止2min；(7) 15000rpm離心1min,管底溶液即為所需的DNA(8) 將DN砒存于貯存于-20C冰箱中。三、DNA勺重組在0.5mL的已滅菌的離心管中依次加入下列溶液T4DN陋接酶1L10X連接反應(yīng)緩沖液2PUCm-Tl體9L純化后的PCB物8L16C連接過(guò)夜。上面載體及目的片段量是根據(jù)本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果

22、確定的，在實(shí)際操作中要根據(jù)具體情況而定，若體系不足20則用無(wú)菌水補(bǔ)足至10(?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】PCF收結(jié)果109876M543218號(hào)泳道為本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，相對(duì)丁PCRg果來(lái)講，回收效率不是很高，可能原因分析如下：1. 切膠時(shí)膠塊體積太大，溶膠效果不好2. DNA吸附后洗脫不完全操作過(guò)程中的損失實(shí)驗(yàn)四重組子轉(zhuǎn)化及篩選【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆誅NA重組技術(shù)的基本原理和基本方法【實(shí)驗(yàn)原理】1、將重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。2、克隆選擇增殖：將轉(zhuǎn)化后的液體涂布丁瓊脂培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基中含有宿主菌敏感的抗生素，重組DNA（TA克隆載體分子）含有相應(yīng)抗生素的抗性基因，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成集落。挑取菌落，置液

23、體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到大量含重組DNA的細(xì)菌。4）收獲擴(kuò)增后的培養(yǎng)細(xì)胞，提取重組DNA分子（質(zhì)粒），并純化，獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝。3、藍(lán)白斑篩選：IPTG可誘導(dǎo)lacZ形成a肽鏈，該產(chǎn)物能與有缺陷的宿主細(xì)胞所編碼的N-末端發(fā)生基因內(nèi)互補(bǔ)，形成有活性的6-半乳糖苜酶，分解底物X-gal使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。當(dāng)外源基因DNA片段插入多克隆位點(diǎn)后，使其編碼的a肽鏈?zhǔn)セ钚?，使其不能形成a-互補(bǔ)，因此帶有外源基因重組子的細(xì)菌形成白色菌落?！緦?shí)驗(yàn)步驟】(1) 取200L甘油保存的感受態(tài)細(xì)胞，低溫融化后，加入重組質(zhì)粒，混勻，冰上放置30min；(2) 將轉(zhuǎn)化的混合物立即放入42C循環(huán)水浴中90sec

24、(注意：不要晃動(dòng))；(3) 然后冰浴2min；(4) 在轉(zhuǎn)化子中加入600此不含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37C搖床培養(yǎng)1h(慢搖)；(5) 4000rpm離心5min,沉淀細(xì)菌細(xì)胞；(6) 用微量移液器去除上活溶液600L;(7) 將沉淀與剩余的上活混勻，涂在制備好的瓊脂平板上；(8) 待菌液完全被吸收后，37C倒置培養(yǎng)?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果及分析】用所制備的感受態(tài)，對(duì)連接所制備的重組子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果，結(jié)果正確。其中，陽(yáng)性菌落即白色菌落。原因是根據(jù)藍(lán)白斑篩選的原理，當(dāng)外源基因DNA片段插入多克隆位點(diǎn)后，使其編碼的a肽鏈?zhǔn)セ钚?，使其不能形成a-互補(bǔ)，因此帶有外源基因重組子的細(xì)菌形成白色菌落。而我

25、們所構(gòu)建的重組子即由我們的目的片段插入到載體的多克隆位點(diǎn)，使不能形成a-互補(bǔ)，則使菌落呈白色。實(shí)驗(yàn)五困種保存及質(zhì)粒dnA勺小量提取酶切驗(yàn)證【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握菌種保存的方法2. 掌握質(zhì)粒DNA、量提取的原理及方法3. 酶切驗(yàn)證重組子的轉(zhuǎn)化是否正確【實(shí)驗(yàn)原理】實(shí)驗(yàn)米用-70C保存菌種，使菌種的代謝處于最低狀態(tài)。堿裂解法提取質(zhì)粒的原理是在EDTAff在的條件下，用溶菌酶破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，同時(shí)經(jīng)過(guò)NaO用陰離子去污劑SDS&理，使細(xì)胞膜崩解，從而達(dá)到菌體充分的裂解。此時(shí)，細(xì)菌染色體DNA繞附著在細(xì)胞膜碎片上，離心時(shí)易被沉淀出來(lái)。而質(zhì)粒DN頑U留在上活液內(nèi)，其中還含有可溶性蛋白質(zhì)、核糖核蛋白和少量染色

26、體DNA實(shí)驗(yàn)中加入蛋白質(zhì)水解酶和核糖核酸酶，可以使它們分解，通過(guò)堿性酚（pH8.0）和氯仿一異戊醇混合液的抽提可以除去蛋白質(zhì)等等。異戊醇的作用是降低表面張力，可以減少抽提過(guò)程中產(chǎn)生的泡沫，并能使離心后水層、變性蛋白層和有機(jī)層維持穩(wěn)定。含有質(zhì)粒DNA勺上活液用乙醇或異丙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA小提質(zhì)粒所用溶液配方：溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-HCl（三羥甲基氨基甲烷）pH8.010mmol/LEDTA（乙二胺四乙酸）pH8.0溶液U0.4mol/LNaOH2%SDS用前等體積混合溶液m5mol/L乙酸鉀60mL冰乙酸11.5mL水28.5mL【實(shí)驗(yàn)材料】大腸桿菌DH成菌液，RNA#【實(shí)驗(yàn)試劑】LB液體、固體培養(yǎng)基，40冊(cè)油，小提質(zhì)粒裂解液I、U、m,酚氯仿，無(wú)水乙醇，70%J亨【實(shí)驗(yàn)儀器與用具】微量移液器，培養(yǎng)血，試管，