酵母單雜交實(shí)驗(yàn)步驟總結(jié)材料

1、1 pBait-AbAi載體的構(gòu)建(酵母報(bào)道子的構(gòu)建)注：酵母報(bào)道子(pBait-AbAi )包含目的順式作用元件的一個(gè)或多個(gè)拷貝， 且插入到pAbAi載體AbAir報(bào)告基因的上游。大量研究表明最有效的構(gòu)建應(yīng)包含 目的DNA三個(gè)以上的首尾連接的拷貝。首尾連接的拷貝產(chǎn)生方式很多，但對(duì)于長(zhǎng) 度小于20 bp的調(diào)控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途徑。(1) 設(shè)計(jì)并合成包含目的序列的兩條反向平行的寡核苷酸序列，且兩端加上與 pAbAi載體酶切產(chǎn)物一致的粘性末端(建議合成一個(gè)目的序列的突變序列 作為對(duì)照，以排除可能的假陽性)。(2) 用TE buffer溶解寡核苷酸至終濃度100mol/L。(3)

2、 將正向鏈和反向鏈按照1:1的比例混合(退火后的雙鏈寡核苷酸最大濃度 為 50mol/L)。(4) 95 C保溫30 s，去除二級(jí)結(jié)構(gòu)。(5) 72 C保溫 2 min，37 C保溫 2 min，25 C 保溫 2min。 注：緩慢退火，有助于雙鏈寡核苷酸的形成。(6) 冰上放置。退火后的產(chǎn)物可貯存在-20 C冰箱備用。(7) 酶切1 JL pAbAi載體，用凝膠回收純化或柱純化的方式純化酶切產(chǎn)物。注：回收前，可用瓊脂糖凝膠檢測(cè)是否酶切完全。(8) 將退火后的寡核苷酸稀釋100倍至終濃度為0.5 5ol/L(9) 在連接反應(yīng)管中加入如下成分:pAbAi 載體(50 ng/ JL)ann eal

3、ed oligo nu cleotide10X T4 DNA ligase bufferBSA( 10 mg/mL)Nuclease-free H OT4 DNA ligase (400 U/ JL)1.0JL(0.5 Jmol/L )1.0JL1.5JL0.5JL10.5JL0.5JL總體積15JL注：如果有必要，可用1 JL nuclease-free H 2O代替寡核苷酸作為陰性 對(duì)照。(10) 將反應(yīng)體系室溫放置連接3 h，轉(zhuǎn)化E coli，采用常規(guī)方法檢測(cè)陽性克隆。注：可用酶切或測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)。2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，生成 Bait-Reporter 酵母菌株(圖)Linearize pB

4、ait-AbAi and integrate into the ura3-52 locus of YlH GoldAbAUMJ圖3 Bait-Reporter 酵母菌株生成原理示意圖(1) 用 BstB I 或者 Bbs I 酶切 2 JL pBait-AbAi ，pMutant-AbAi，p53-AbAi 質(zhì)粒，使其在URA3基因處斷開，純化酶切產(chǎn)物。(2) 按 Matchmaker Yeast Transformation System 2的步驟用 1 Jl 酶切后的 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y1HGold酵母。(3) 稀釋每個(gè)轉(zhuǎn)化體系至1/10、1/100、1/1000,分別取每個(gè)稀釋物均勻涂于SD/-

5、Ura瓊脂平板上。3 d后挑取5個(gè)單克隆，用Matchmaker Insert Check PCR Mix1進(jìn)行PCF檢測(cè)陽性克隆，用 Y1HGold的單克隆做陰性對(duì)照。(4) 在 PCRt中力卩 25 T PCR-grade H 2Q(5) 用干凈的槍頭輕輕接觸酵母單克隆，以獲得非常少量的酵母細(xì)胞。將槍頭 伸進(jìn)PCR-grade H2O中攪拌，使酵母細(xì)胞散開。注：切忌挑取整個(gè)酵母單克隆，因?yàn)榧?xì)胞過多會(huì)阻止PCF反應(yīng)的進(jìn)行。如 果加入細(xì)胞后水變渾濁，證明加入了過多的酵母細(xì)胞。(6) 向每個(gè)管中加入25川Matchmaker Insert Check PCR Mix，混勻，離心。每個(gè)PCR管中現(xiàn)

6、已含有如下反應(yīng)物：Matchmaker In sert Check PCR Mix25川2550H20/yeast總體積(7) 按下述程序進(jìn)行PCF反應(yīng);95C1 min98P10 s)55 P 30 s 30 cycles68乜2 minJ(8) 取5PCR產(chǎn)物，用1%勺瓊脂糖凝膠電泳分析。注：引物與AbA基因以及URA3F游的YIHGold基因組結(jié)合，擴(kuò)增片段長(zhǎng)約1.4 kb。圖4 PCR檢測(cè)pBait-AbAi的插入情況正確的PCRi測(cè)結(jié)果應(yīng)是:陽性對(duì)照：1.4 kb陰性對(duì)照：無條帶誘餌菌株：1.35 kb+in sert size(9) 分別挑取PCR檢測(cè)呈陽性的誘餌克隆和 p53-A

7、bAi對(duì)照克隆，在SD/-Ura 平板上劃線培養(yǎng)。30 C孵育3 d后，將平板置于4 C保存，即為新構(gòu)建 的 Y1HGoldBait/AbAi菌株和p53/AbAi對(duì)照菌株。(10) 經(jīng)過長(zhǎng)期放置后，挑取單克隆在YPDA液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，離心收集 菌體，用1 mL預(yù)冷培養(yǎng)基(100 ml滅菌的YPDA與50 ml滅菌的75%甘 油混合)重懸菌體，速凍后與-70 C保存。3檢測(cè)誘餌菌株AbA基因的表達(dá)在不存在捕獲物的情況下，由于克隆到pAbAi載體中的誘餌序列不同，誘餌 菌株報(bào)告基因的本底表達(dá)水平也不相同。例如：p53-AbAi對(duì)照的最低 aureobasidin A 抑制濃度為 100 n

8、g/ml。注：酵母單雜交實(shí)驗(yàn)成功的前提是沒有內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子能夠與目的序列結(jié)合或者結(jié)合能力非常弱。因此在進(jìn)行文庫篩選之前，檢測(cè)所構(gòu)建的誘餌菌株AbA基因的表達(dá)情況十分重要。所以需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定進(jìn)行文庫篩選時(shí)抑制誘餌菌株 報(bào)告基因本底表達(dá)所需的AbA濃度。(1) 分別挑取誘餌克隆和對(duì)照克隆，用0.9% NaCl重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)A600到0.002(大約2000個(gè)細(xì)胞/100屮)。(2) 在下述培養(yǎng)基上分別涂布100 T重懸后的菌液，30 C培養(yǎng)2-3 d。SD/-UraSD/-Ura with AbA ( 100 ng/mL)SD/-Ura with AbA ( 150 ng/mL)SD/-Ura

9、with AbA( 200 ng/mL)預(yù)期結(jié)果如下所示：表1 AbA基因預(yù)期本底表達(dá)結(jié)果AbA/ (n g/mL)Y1HGoldp53-AbAi克隆數(shù)Y1HGoldpBait-AbAi克隆數(shù)0約 2000約 20001000Bait depe ndent1500Bait depe ndent2000Bait depe ndent(3) 在進(jìn)行文庫篩選時(shí)，使用AbA的濃度應(yīng)為最低抑制濃度，或使用比最低抑 制濃度稍高的AbA濃度(高約50-100 ng/mL)，以徹底抑制誘餌菌株的生 長(zhǎng)。注：如果200 ng/mL AbA不能抑制本底表達(dá)，可以嘗試提高 AbA濃度至500-1000 ng/mL。

10、然而，在不存在捕獲物的情況下，如果1000 ng/mL的AbA濃度仍無法抑制AbA基因的表達(dá)，那么很可能存在能夠識(shí)別并與目的序列結(jié)合的 內(nèi)源調(diào)控因子，因而該目的序列無法用來進(jìn)行酵母單雜交篩選。4文庫cDNA的合成提取試材總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA合成的cDNA末端具有與pGADT7-Rec 相同的酶切位點(diǎn)。（1）cDNA第 一鏈的合成 準(zhǔn)備高質(zhì)量的poly A 和/或總RNA用human placenta poly A+RNA 作為陽性 對(duì)照。注：RNA勺質(zhì)量決定文庫的質(zhì)量，RNA應(yīng)為所要研究的特定時(shí)期和特定組織的RNA 在微量離心管中加入如下反應(yīng)物：RNA 模板(0.025-1.0 旳

11、poly A和/ 或 0.10-2.0 旳 總 RNA 1-2CDS III (oligo-dT ) or CDSII/6(random)引物1.0Deioni zedHO （使總體積達(dá)到4.0 T ）1-2總體積4.0Jl在另外一支管中加入對(duì)照cDNA反應(yīng)物，即RNA使用1 Jl （1 Jg） control polyA+RNA 72 C孵育2 min。 冰上放置2 min，輕輕混勻，立即加入步驟中的試劑。 每一個(gè)反應(yīng)加入如下試劑，輕輕混勻離心。5 x first-strand buffer2.0JlDTT( 100 mmol/L)1.0dNTP mixture ( 10 mmol/L)1.

12、0SMART M-MLV RT1.0總體積5.0注：步驟中的試劑可在步驟之前加好置于冰上。此步是cDNA合成的起始關(guān)鍵步驟，變性后的 RNA引物mix冰上放置的時(shí)間不應(yīng)超過2 min。 如果用的是CDSHI/6 隨機(jī)引物，25-30 C保溫10 min。如果用的是CDSIII 引物，省略此步，進(jìn)行步驟。 42 C保溫10 min。 加入1 T SMART III oligo，充分混合，42 C保溫1 h 75 C保溫10 min終止第一鏈的合成。 降至室溫，加入1 Jl RNase H （2 U）11 37 C保溫 20 min。12 cDNA第一鏈合成產(chǎn)物應(yīng)于-20 C保存，可用3個(gè)月（2）

13、long distanee PCR （ LD-PCR 合成 cDNA第二鏈根據(jù)合成cDNA第一鏈時(shí)使用的RNA量，下表給出了進(jìn)行LD-PCR時(shí)最佳的熱 循環(huán)數(shù)。使用的熱循環(huán)數(shù)越少，非特異性PCR產(chǎn)物越少。表2 RNA量與最佳熱循環(huán)數(shù)總RNA/gPoly A+RNA/g循環(huán)數(shù)20-221.0-2.00.5-1.015-200.25-0.50.125-0.2522-240.05-0.250.025-0.12524-26LD-PCR反應(yīng)混合物中加入如下物質(zhì)（每個(gè)樣品做 2個(gè)100出體系，對(duì)照做1個(gè)100屮體系）：First-stra nd cDNA( from protocol A)2 Dei on

14、 ized H 2O7010X adva ntage 2 PCR buffer10出50 x dNTP mix25' RAC引物23' RAC引物2Melt ing soluti on10出50 x adva ntage 2 polymerase mix2出總體積100I按照以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng):1個(gè)循環(huán)95C 30 sX個(gè)循環(huán)95C 10 s68C 6 min1個(gè)循環(huán)68C 5 min取7 T PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)使用 1 kb DNA ladder（2）使用 CHROMA SPIN+TE-40柱純化 ds cDNA為每一個(gè)要純化的 cDNA樣品準(zhǔn)備

15、一個(gè) CHROMA SPIN+TE-40柱。將純化柱翻轉(zhuǎn)幾次，充分懸浮 gel matrix 。移去柱的頂蓋和底蓋，將柱放入 2 ml收集管中。將柱放入離心機(jī)，700 g離心5 min以消除平衡緩沖液，棄掉收集管中的液體。將柱放入新的收集管中，把cDNA加到gel matrix的中央，切勿使樣品沿柱的 內(nèi)壁流下。注：加到邊上易使樣品沿柱內(nèi)壁流下，易混有小片段cDNA700 g離心5 min，純化的cDNA攵集到管中。將兩個(gè)純化的cDNA樣品合并到一管，測(cè)量體積。加入1/10體積3 mol/L醋酸鈉(pH5.3),混勻。加入2.5倍體積無水乙醇。-20 C冰凍1 h。(11) 室溫，14000

16、r/min 離心 20 min。(12) 小心棄去上清液，切勿碰到沉淀。(13) 14000 r/min瞬時(shí)離心，去除殘留上清液。(14) 沉淀于空氣中干燥10 min。注：一般干燥至無乙醇味，不可過度干燥，否則很難溶解。(15) 用20 Jl滅菌去離子水溶解沉淀，此 cDNA可用來進(jìn)行同源重組構(gòu)建文庫。純 化后的cDNA用 1%勺瓊脂糖電泳檢測(cè)。5構(gòu)建并篩選酵母單雜交文庫（cDNA融合表達(dá)文庫的構(gòu)建及篩選）（1） 構(gòu)建并在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上檢測(cè) Y1HGoldBait/AbAi菌株。注：AbA的濃度根據(jù)構(gòu)建誘餌載體時(shí)轉(zhuǎn)入酵母抑制本底表達(dá)時(shí)的濃度而定。（2） 按SMART tech

17、nology步驟合成ds cDNA,其濃度為2-5 弋/20 兒。（3） 用Yeast Transformation System 2的方法轉(zhuǎn)化酵母，在轉(zhuǎn)化體系中加入 如下物質(zhì)： cDNA文庫轉(zhuǎn)化 Y1HGoldBait/AbAi菌株20 屮 SMART-amplified ds cDNA （ 2-5 弋）6 屮 pGADT7-Rec， （ Sma I-linearized ）（ 3 .二g） Y1HGold 53/AbAi的轉(zhuǎn)化5 屮 p53 fragment （ 125 Jg）2 T pGADT7-Rec,（ SmaI-linearized ）（ 1g）將轉(zhuǎn)化體系分別稀釋至 1/10、1/

18、100、1/1000、1/10000后，各取100川 涂100 mm平板。文庫轉(zhuǎn)化涂 SD/-Leu和SD/-Leu/AbA平板，對(duì)照 p53轉(zhuǎn)化涂SD/-Leu和 SD/-Leu/AbA200 平板。（4）將剩余的所有文庫轉(zhuǎn)化混合物（約 15 ml ）涂在150 mm SD/-Leu/AbA平 板上，每板涂150 Jl。（5）倒置培養(yǎng)3-5 d。（6） 3-5 d后，通過統(tǒng)計(jì)SD/-Leu 100 mm平板上的克隆數(shù)目來計(jì)算篩選的克 隆數(shù)。注：所篩選的克隆數(shù)至少應(yīng)該達(dá)到1百萬，否則會(huì)降低篩選到目的產(chǎn)物的可 能性。篩選的克隆數(shù)=cfu/ml on SD/-Leu x dilution fact

19、or x resuspension volume（15ml）例如：resuspension volume=15 mlPlati ng volume=100Jl250 colo nies grew on the 1/100 dilution on SD/-Leu platesX 100 X 15 ml=3.75The nu mber of clones scree ned=250 cfu/0.1 ml millio n(7)預(yù)期結(jié)果陽性對(duì)照試驗(yàn)：SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200培養(yǎng)基上的克隆數(shù)相近。文庫篩選試驗(yàn)：根據(jù)SD/-Leu平板上的克隆數(shù)計(jì)算所篩選的克隆數(shù)， 其結(jié)果 應(yīng)大于1百

20、萬且SD/-Leu/AbA平板上的克隆數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于1百萬，陽性克隆數(shù)目取 決于誘餌序列。6陽性克隆的鑒定及cDNA質(zhì)粒的分離(1) 陽性克隆重新劃線培養(yǎng)，進(jìn)行表型確認(rèn) 將陽性克隆在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上重新劃線，產(chǎn)生新的單克隆。 2-4 d后，選擇能夠正常生長(zhǎng)的克隆進(jìn)行后續(xù)分析。(2) 酵母克隆PCF消除重復(fù)克隆 用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 2(Cat.No.630497 )進(jìn)行 PCR 對(duì)插入到pGADT7載體中的cDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR管中加入以下反應(yīng)物：Matchmaker In sert Check PCR Mix25JlH 20/Ye

21、ast25屮總體積50Jl 按下述程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：94 C 1 min98 C 10s68 C 3 min PCF產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。產(chǎn)物不是單一的條帶很正常，這 表明在同一酵母細(xì)胞不存在一種捕獲載體注：為了確認(rèn)大小相近的條帶是否是同一種插入片段，用 Alu I或Hae III 或者其它常用的限制性內(nèi)切酶消化 PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳 分析。 如果大量的克隆含有同一插入片段，則另取50個(gè)克隆進(jìn)行PCR分析。 為了快速驗(yàn)證克隆，PCR產(chǎn)物可經(jīng)過純化后用T7引物測(cè)序。（3）陽性cDNA質(zhì)粒的分離獲取 酵母中文庫質(zhì)粒的分開。與轉(zhuǎn)化的大腸桿菌不同，轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞可以含多種相關(guān)質(zhì)粒，這就意味著 陽性克隆里不只含有能激活 AbA報(bào)告基因的質(zhì)粒，還可能含有一種或多種不表 達(dá)相互作用蛋白的cDNA質(zhì)粒。如果不事先將非互作質(zhì)粒分開出去而直接通過轉(zhuǎn) 化大腸桿菌獲取質(zhì)粒，那么很有可能獲取到非相互作用的質(zhì)粒。為了增加獲取陽 性克隆捕獲質(zhì)粒的幾率，可以將陽性克隆在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上重復(fù)涂布2-3 次，每次都挑取單一的克隆進(jìn)行下一步涂布。 從酵母中獲取陽性cDNA質(zhì)粒為了鑒定陽性互作相關(guān)的基因，用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit（Cat.No.630467 ）從酵母中獲取陽性質(zhì)粒。 轉(zhuǎn)化E coli并分離陽性cDNA質(zhì)粒用