8.PCT主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1、降鈣素原PCT檢測試劑盒膠體金法主要生產(chǎn)工藝及反響體系的研究資料膠體金免疫檢測技術(shù)是目前臨床快速檢測的常用方法之一。 廣州鴻琪光學(xué)科技結(jié)合國內(nèi) 外對降鈣素原檢測試劑盒在臨床診斷中的應(yīng)用情況開發(fā)了降鈣素原PCT定量檢測試劑盒膠體金法 ，結(jié)合 鴻琪公司開發(fā)的免疫膠體金讀數(shù)儀 對血清、 血漿和全血標(biāo)本中的降鈣素 原 PCT 進(jìn)行定量檢測。一、 反響原理描述人降鈣素原PCT檢測試劑膠體金法是一種不需要任何儀器設(shè)備的全血/血清/血漿檢測法， 采用膠體金免疫層析技術(shù)， 試劑盒含有被預(yù)先包被在玻璃纖維上的膠體金標(biāo)記的 抗PCT單克隆抗體mAbl以及固定于膜上測試區(qū) T的抗PCT單克隆抗體mAb2和質(zhì)控區(qū)C

2、的相應(yīng)抗體。測試時(shí)，將標(biāo)本滴入試劑盒加樣孔 S內(nèi)，標(biāo)本中如含有人降鈣素原PCT，那么標(biāo)本 中的人降鈣素原PCT分別與預(yù)先包被在玻璃纖維上的抗 PCT單克隆抗體mAbl結(jié)合，結(jié)合 物在毛細(xì)效應(yīng)下向上層析，隨后會被固定在膜上相應(yīng)測試區(qū)的抗PCT單克隆抗體mAb2結(jié)合捕獲， 從而在相應(yīng)測試區(qū)出現(xiàn)紫紅色條帶。 如是陰性標(biāo)本， 那么相應(yīng)測試區(qū)內(nèi)將沒有紫紅色條 帶出現(xiàn)。無論標(biāo)本中是否存在人降鈣素原 PCT，一條紫紅色條帶都會出現(xiàn)在質(zhì)控區(qū) C 內(nèi)。質(zhì)控區(qū)C內(nèi)所顯現(xiàn)的紫紅色條帶是判定是否有足夠標(biāo)本，層析過程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)， 同時(shí)也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。通過金標(biāo)免疫分析儀檢測測試區(qū)T顯色深度，再經(jīng)過保存在卡殼上二

3、維碼上的定標(biāo)曲線計(jì)算得到檢測結(jié)果。膠體金標(biāo)記的根本原理是膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷， 可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán) 形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金標(biāo)記所用的主要原輔料有：抗 PCT單克隆抗體mAbl、氯金酸、檸檬酸三鈉，玻 璃纖維。NC膜包被的根本原理是蛋白首先通過靜電作用和硝酸素纖維膜結(jié)合，然后靠H鍵和疏水作用維持長時(shí)間結(jié)合。NC膜包被所用的主要原輔料有： 硝酸素纖維膜、抗PCT單克隆抗體mAb2和羊抗鼠IgG。、主要生產(chǎn)工藝的各主要工序流程圖藍(lán)色工序在 1 0萬級潔凈區(qū)內(nèi)進(jìn)行，其他工序在普通生產(chǎn)區(qū)。配包被用液體配包被溶液1卩包 膜三、主要工序所用主

4、要原輔料、具體步驟即每一步驟的具體實(shí)現(xiàn)方法 該產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝包括各種工作溶液的配置， 膠體金標(biāo)記物、 包被抗原或抗體等濃度確 定，膠體金標(biāo)記物制備， 檢測線及質(zhì)控線的制備等步驟， 并通過產(chǎn)品的半成品檢驗(yàn)和成品檢 驗(yàn)兩個(gè)質(zhì)控過程來保證其質(zhì)量符合產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。一各種工作溶液的配置1 配標(biāo)記用液體：膠體金制備：0.01%氯金酸 HAuCl4 ，水溶液 100ml 加熱至沸騰，參加 1%檸檬酸三鈉1ml ，混勻，煮沸 5 分鐘，待膠體金溶液顏色由藍(lán)經(jīng)紫變紅后，冷卻即可。2 配金標(biāo)記物枯燥根底液包被緩沖液為 10mM Tris-HCl ， 1.0%BSA, 0.01% NaN3 ，2%蔗糖。3 配包被用

5、液體包被緩沖液為 10mM Tris-HCl ，2%蔗糖。4 配包被溶液對照線包被羊抗鼠 IgG, 包被濃度 1.0mg/ml檢測線分別包被抗 PCT單克隆抗體mAb2，包被濃度均為1.0mg/ml噴量1.0卩l(xiāng)/cm ,電機(jī)速度511HZ。二膠體金標(biāo)記物、包被抗原或抗體等濃度確定1、膠體金標(biāo)記物：分別以20ug/ml最終濃度將抗PCT單克隆抗體mAbl參加膠體金溶液中進(jìn)行標(biāo)記。2、檢測線包被抗原濃度：用包被緩沖液稀釋抗1.0mg/ml 。3、對照線包被濃度：用包被緩沖液稀釋羊抗鼠 三膠體金標(biāo)記物的制備采用枸櫞酸三鈉復(fù)原法制備膠體金，選擇PCT單克隆抗體mAb2，終濃度均為IgG，終濃度為 1

6、.0mg/ml。30nm 膠體金顆粒用于標(biāo)記，分別以 20 g/ml最終濃度抗PCT單克隆抗體mAbl參加膠體金溶液中?？焖贁嚢?分鐘，再慢速攪拌15分鐘。分別參加 20%BSA ，攪拌 5 分鐘，離心 6 分鐘 4000 轉(zhuǎn)，吸去上清，沉淀以金標(biāo)記物枯燥根底液原膠體金溶液體積的1/10重新懸浮。置2-8 C保存，在規(guī)定的保存期內(nèi)使用。以金標(biāo)記物枯燥根底液對金標(biāo)抗PCT單克隆抗體(mAbl)進(jìn)行按一定比例稀釋，然后利用噴金儀噴到玻璃纖維上，噴量1.0卩l(xiāng)/cm，噴筆口徑為10mm將噴好的玻璃纖維放置烘房中，37 ± 2C,枯燥24小時(shí)。四檢測線及質(zhì)控線的制備取抗PCT單克隆抗體(mA

7、b2)終濃度分別為1.0mg/ml ,噴量1.0卩l(xiāng)/cm ,電機(jī)速度511 在硝酸纖維素膜上制備檢測線，室溫枯燥；取已確定使用的用包被緩沖液稀釋羊抗鼠IgG,終濃度為1.0mg/ml，用同樣方法制備控制線。檢測線與控制線在NC膜上之間的距離約3.5+0.5mm,線的寬度約 0.8-1.0mm ;前后均勻；并置溫度 1526C ；溫度w 30%枯燥24 小時(shí)以上。五半成品檢驗(yàn)按批號抽取一定數(shù)量的半成品檢測，對所抽樣的半成品做準(zhǔn)確性、最低檢出量、線性、精密性、穩(wěn)定性等性能方面的檢測，應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。六貼板、切條、裝卡在溫度1530 C；濕度w 25%條件下，將標(biāo)記好的玻璃纖維、硝酸纖維膜、聚紙板

8、、吸 水紙、樣品墊經(jīng)特殊處理，可過濾紅細(xì)胞等物組裝，要求材料附著牢固，膜條切割應(yīng)寬為4.0 ± 1.0mm然后裝塑料殼。七定標(biāo)利用公司內(nèi)部校準(zhǔn)品對試劑進(jìn)行定標(biāo)，定標(biāo)曲線保存到二維碼中。(八)組裝1把二維碼貼到試劑卡殼上，并將枯燥劑、吸管等裝入鋁箔袋，封口。2裝盒。九成品檢驗(yàn)成品做準(zhǔn)確性、最低檢出量、線性、精密性、穩(wěn)定性等性能方面的檢測，應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。四、主要工藝確實(shí)定1. 檢測線包被濃度試驗(yàn)設(shè)計(jì)：固定加液量噴量1.0卩l(xiāng)/cm ,電機(jī)速度511HZ，用包被緩沖液調(diào)整抗 PCT 單克隆抗體(mAb2)的包被濃度分別為 0.3 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ ml、2.

9、0 mg/ ml，分別 進(jìn)行包被，晾干后按正常生產(chǎn)工藝組裝試劑條，分別以降鈣素原最低檢出量參考品0.1 ng/ml和零濃度參考品加樣測試，每個(gè)濃度參考品平行測試 20次。計(jì)算零濃度參考品測試的吸光值平均數(shù)分別為 M0及計(jì)算它們的標(biāo)準(zhǔn)差 SD，計(jì)算0.1 ng/ml參考品的測試平均值為M1,假設(shè)M1>M0+2SD，說明最低檢測限w 0.1 ng/ml?95%置信區(qū)間。試驗(yàn)結(jié)果：包被濃度M0+2SDM10.3mg/ml0.5mg/ml1.0mg/ml2.0mg/ml2.5mg/ml結(jié)論：當(dāng)包被濃度分別到達(dá)1.0mg/ml ,最低檢測限w 0.1 ng/ml，而進(jìn)一步提高包被濃度，這個(gè)工程的靈

10、敏度沒有明顯的改變。最終確定這個(gè)工程檢測線包被濃度均為1.0 mg/ml。2. 對照線包被濃度試驗(yàn)設(shè)計(jì)：固定加液量 噴量1.0卩l(xiāng)/cm ,電機(jī)速度511HZ，用包被緩沖液調(diào)整羊抗鼠 IgG 抗體濃度為 0.4 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml、1.4 mg/ml、1.8mg/ml，分別進(jìn)行包被， 晾干后按正常生產(chǎn)工藝組裝試劑條，以陰性標(biāo)本加樣比較不同包被濃度對照線顯色時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果:羊抗鼠IgG對照線顯色時(shí)間0.5mg/ml超過4 min0.8mg/ml超過4 min1.0mg/ml2min1.5mg/ml2min2.0mg/ml2min結(jié)論：包被濃度到達(dá)1.0mg/ml，

11、對照線即在2 min內(nèi)清晰可辯，符合設(shè)計(jì)要求。最終確 定對照線包被濃度 1.0mg/ml。3. 膠體金標(biāo)記抗PCT單克隆抗體mAb1的制備3.1膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比確實(shí)定試驗(yàn)設(shè)計(jì)：將膠體金分裝15管，每管1ml,每個(gè)工程5管。將抗PCT單克隆抗體mAb1 分別以5 g/ml、10 g/ml、20 g/ml、30g/ml、40 g/ml濃度參加上列膠體金溶液中，快速攪 拌1分鐘，再慢速攪拌15分鐘。加20%BSA，攪拌5分鐘，離心6分鐘10000轉(zhuǎn)，吸 去上清，沉淀以金標(biāo)記物枯燥根底液重新懸浮。以金標(biāo)記物枯燥根底液對金標(biāo)抗PCT單克隆抗體mAbl進(jìn)行按一定比例稀釋，然后利用噴金儀噴到玻璃纖維

12、上，噴量1.0卩l(xiāng)/cm，噴筆口徑為10mm將噴好的玻璃纖維放置烘房中，37 ± 2C,枯燥24小時(shí)。按正常生產(chǎn)工藝組裝試劑條。分別進(jìn)行包被，晾干后按正常生產(chǎn)工藝組裝試劑條，分別以降鈣素原最低檢出量參考品0.1 ng/ml和零濃度參考品加樣測試，每個(gè)濃度參考品平行測試 20次。計(jì)算零濃度參考品測試的吸光值平均數(shù)分別為M0及計(jì)算它們的標(biāo)準(zhǔn)差 SD,計(jì)算0.1 ng/ml參考品的測試平均M1,假設(shè)M1>M0+2SD，說明最低檢測限w 0.1 ng/ml?95%置信區(qū)間。比較不同標(biāo)記蛋白用 量的靈敏度上下。包被濃度M0+2SDM10.3mg/ml0.5mg/ml1.0mg/ml2.0

13、mg/ml2.5mg/ml結(jié)論：當(dāng)標(biāo)記濃度分別到達(dá) 20呃/ml,試劑盒能滿足最低檢出量參考品0.1 ng/ml檢出要求，而進(jìn)一步提高包被濃度，這三個(gè)工程的檢測線顯色程度沒有明顯的改變。最終確定標(biāo) 記濃度均為20 ig/ml。3.2金標(biāo)抗PCT單克隆抗體mAb1稀釋濃度確實(shí)定試驗(yàn)設(shè)計(jì)：將抗 PCT單克隆抗體mAb1用金標(biāo)記物枯燥根底液按1:1、1: 2、1： 3比例進(jìn)行稀釋，稀釋好后按固定噴金參數(shù)，將金標(biāo)抗PCT單克隆抗體mAb1噴在玻璃纖維上，枯燥，按正常生產(chǎn)工藝組裝試劑條，分別以降鈣素原最低檢出量參考品0.1 ng/ml和零濃度參考品加樣測試，每個(gè)濃度參考品平行測試20次。計(jì)算零濃度參考品

14、測試的吸光值平均數(shù)分別為M0及計(jì)算它們的標(biāo)準(zhǔn)差SD，計(jì)算0.1 ng/ml參考品的測試平均 M1,假設(shè)M1>M0+2SD，說明最低檢測限w 0.1 ng/mlO 95%置信區(qū)間。比較不同標(biāo)記蛋白用量的靈敏度上下。稀釋濃度M0+2SDM11:11:21:3結(jié)論：只有當(dāng)稀釋度到達(dá)1:1時(shí)，最低檢測限W 0.1 ng/ml，符合設(shè)計(jì)要求。最終確定金標(biāo)單抗稀釋度為1:1。4. 設(shè)計(jì)定型通過以上實(shí)驗(yàn)，我們確定采用的生產(chǎn)工藝為：1 NC膜包被：檢測線：用包被緩沖液稀釋抗PCT單克隆抗體mAb2到終濃度為1.0mg/ml。對照線：用包被緩沖液稀釋羊抗鼠IgG，終濃度為1.0mg/ml。包膜參數(shù)：噴量1

15、.0卩l(xiāng)/cm ,電機(jī)速度511HZ。將包被好的NC膜放置烘房中，37±2C,枯燥24小時(shí)。2膠體金標(biāo)記：以20 g/ml最終濃度將抗PCT單克隆抗體mAb1參加膠體金中。快速攪拌1分鐘，再慢 速攪拌15分鐘。加20%BSA，攪拌5分鐘，離心6分鐘4000轉(zhuǎn)，吸去上清，沉淀以金 標(biāo)記物枯燥根底液重新懸浮。然后用金標(biāo)記物枯燥根底液分別按1： 1進(jìn)行稀釋，然后利用噴金儀噴到玻璃纖維上， 噴量1.0卩l(xiāng)/cm，噴筆口徑為10mm將噴好的玻璃纖維放置烘房中， 37± 2C,枯燥24小時(shí)。按正常生產(chǎn)工藝組裝試劑條。成品檢驗(yàn)：組裝成的試劑條是否在15分鐘內(nèi)檢出降鈣素原最低檢出量參考品0

16、.1 ng/ml。成品檢驗(yàn)結(jié)果：組裝成的試劑條能在 15分鐘內(nèi)檢出降鈣素原最低檢出量參考品0.1 ng/ml。結(jié)論：該生產(chǎn)工藝生產(chǎn)出來的試劑條符合我們的產(chǎn)品要求，確認(rèn)為以后采用的生產(chǎn)工藝。五、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)及內(nèi)部質(zhì)控品確實(shí)立1.企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定的緣由由于目前人降鈣素原的檢測尚無一個(gè)統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)或國際標(biāo)準(zhǔn)， 我們參考已上市的人 降鈣素原檢測試劑盒產(chǎn)品的性能指標(biāo)， 設(shè)計(jì)了本品的企業(yè)內(nèi)部 標(biāo)準(zhǔn)，制定了內(nèi)部校準(zhǔn)品和質(zhì) 控品。2. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) 2.1準(zhǔn)確性標(biāo)準(zhǔn):取 PCT 零濃度參考品，作為根底樣本，將其等體積分為4 份，在任意 3 份中添加 PCT純分析物，使參加濃度分別為 5ng/ml 、 15ng/ml

17、、40ng/ml ，制成 3 份回收樣本，分別計(jì)算 其回收率，然后計(jì)算平均回收率，平均回收率應(yīng)?95%2.2 最低檢測限標(biāo)準(zhǔn)分別以降鈣素原最低檢出量參考品 0.1ng/ml 和零濃度參考品加樣測試，每個(gè)濃度參考 品平行測試 20 次。計(jì)算零濃度參考品測試的吸光值平均數(shù)分別為 M0 及計(jì)算它們的標(biāo)準(zhǔn)差 SD，計(jì)算0.1 ng/ml參考品的測試平均 M1,假設(shè)M1>M0+2SD，說明最低檢測限w 0.1 ng/ml ?95%置信區(qū)間。最低檢測限必須w 0.1 ng/ml。2.3 線性標(biāo)準(zhǔn)用 50ng/ml 的高濃度參考品和 0.1ng/ml 的低濃度參考品，混合成 8 個(gè)稀釋濃度 Xi， 每

18、個(gè)濃度測定3次，分別求出檢測結(jié)果均值即為實(shí)測值 Yi。以稀釋濃度Xi丨為自變量， 以檢測結(jié)果實(shí)測值Yi為因變量求出線性回歸方程。計(jì)算線性回歸的相關(guān)系數(shù)門及線性相對偏差，要求線性相關(guān)系數(shù) r > 0.975，線性相對偏差不超過土 15%2.4 精密性標(biāo)準(zhǔn)批內(nèi)：用同一批次試劑盒分別對企業(yè)內(nèi)部 1ng/ml 和 40ng/ml PCT 參考品進(jìn)行檢測，各 平行測定 10 次，批內(nèi)變異系數(shù) CVw 15%。批間：取三個(gè)不同批次的產(chǎn)品，分別測定企業(yè)內(nèi)部1ng/ml和40ng/ml PCT參考品，每個(gè)批號重復(fù)檢測 10次，批間變異系數(shù) CVw20%。3. 內(nèi)部質(zhì)控品的制備3.1 最低檢出量質(zhì)控品的制備和驗(yàn)證3.1.1 降鈣素原零濃度質(zhì)控品的制備和驗(yàn)證制備方法：10份經(jīng)確認(rèn)PCT為陰性、無肉眼可見的溶血、黃疸、乳糜顆粒，HIV抗體、HBV抗原、HCV抗體檢測均為陰性的血清標(biāo)本，進(jìn)行