褪黑素對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

1、褪黑素對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響         【摘要】  觀察褪黑素(melatonin，MT)對大鼠脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后脊髓組織細(xì)胞凋亡的影響，探討其對脊髓損傷的保護(hù)作用。方法 成年Wister大鼠66只，隨機(jī)分為三組：Sham組(假手術(shù)組)、A組(單純SCI組)及B組(MT治療組)。Sham組僅切除椎板未損傷脊髓；A、B兩組采用改良Allen法制成大鼠SCI模型，術(shù)后立即分別腹腔注射等體積無水乙醇、褪黑素(100 mg/kg)；Sham組于術(shù)后48 h

2、、A和B組于術(shù)后8、24、48、72 h和7 d分別進(jìn)行神經(jīng)功能評分和測定傷段脊髓組織凋亡細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 A組凋亡細(xì)胞百分率傷后24 h開始升高，48 h達(dá)到高峰，72 h開始下降；B組凋亡細(xì)胞百分率傷后24 h、48 h及72 h與A組相比明顯減少，差異具有顯著性(P0.05或P0.01)；B組神經(jīng)功能比A組有明顯提高(P0.05)。結(jié)論 SCI后應(yīng)用MT可以抑制脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而對脊髓損傷起保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】  褪黑素 脊髓損傷 細(xì)胞凋亡   Effects of Melatonin on Rat Neurons Apoptosis After Sp

3、inal Cord Injury   Abstract：Objective  To observe the effect of melatonin(MT) on rat neural cell apoptosis after experimental spinal cord injury(SCI) in order to study the protective effect on SCI.Methods  Sixtysix Wister rats were randomly divided into 3 groups：sham group(no spi

4、nal cord injury )，group A (SCI group) and group B(MT group).Sham group only cut vertebral plate without spinal cord injury.The SCI model was induced using the modified Allen technique in group A and B.The rats were treated with MT(100 mg/kg) in group B and the dehydrated alcohol of equal volume in g

5、roup A after SCI.Apoptosis and nerves function were measured at 8 h、24 h、48 h、72 h and 7 d following SCI in group A and B，while Sham group was at 48 h.Results  Cell apoptosis rate was increased at 24 h，reached their peaks at 48 h and descended 72 h after injury in group A.The apoptosis rate in

6、group B was significantly decreased as compared with group A at three time points(P0.05 or P0.01)，and the functional recovery was better in group B than in group A.Conclusion  MT can inhabit rat neural cell apoptosis after SCI.It has protective effect on acute SCI.   Key words：melaton

7、in；spinal cord injury；apoptosis   本實驗旨在觀察褪黑素(melatonin，MT)對大鼠脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，探討其對脊髓損傷的保護(hù)作用，現(xiàn)報道如下。   1  材料與方法   1.1  動物分組  健康成年Wister大鼠(蘇州大學(xué)實驗動物中心提供)66只，體重220300 g，雌雄不限，隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(Sham組)6只，單純SCI組(A組)及MT治療組(B組)各30只。A、B兩組又按SCI后不同時

8、間點(8、24、48、72 h和7 d)各分為5個亞組，每個時間點6只。   1.2  模型制備與處理  以10水合氯醛(400 mg/kg體重)腹腔注射麻醉。嚴(yán)格無菌操作下取正中切口，切除T810椎板，暴露硬膜囊并保持其完整。Sham組僅切除椎板暴露硬膜，未損傷脊髓；A、B兩組按照改良Allen法制作中度脊髓損傷模型。B組于SCI后30 min內(nèi)腹腔注射MT溶液(100 mg/kg體重，購自晶美上海公司，瑞士Alexis公司生產(chǎn))，按照褪黑素說明書要求，用無水乙醇對褪黑素進(jìn)行稀釋；A組于同一時間內(nèi)給予等量無水乙醇。術(shù)后常規(guī)青霉素40萬U肌肉注射，1次/

9、d；人工排尿，2次/d。   1.3  檢測指標(biāo)及方法  A和B組分別于術(shù)后8、24、48、72 h和7 d隨機(jī)各取6只，用4水合氯醛麻醉，從原切口暴露脊髓，以損傷處為中心迅速取出傷段脊髓組織約25 mm，將標(biāo)本用冰生理鹽水洗凈表面血跡，濾紙吸干水分后制備成勻漿，測定凋亡細(xì)胞數(shù)。Sham組6只全部于傷后48 h取髓。細(xì)胞凋亡用Annexin VPI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測，分別于488 nm激發(fā)波長和560 nm波長以EPICSELite流式細(xì)胞儀檢測Annexin V和PI標(biāo)記的細(xì)胞，以不含Annexin V和PI的孵育緩沖液的脊髓細(xì)胞作陰性對照，計算凋亡

10、細(xì)胞百分率。            1.4  神經(jīng)功能評分  A、B及Sham組在各時間點取髓前平行觀察斜板試驗與BBB評分，兩者同時進(jìn)行。 a)斜板試驗：大鼠SCI后觀察各組脊髓功能恢復(fù)情況，大鼠肢體抓握能力與斜板角度成正比，反映其脊髓功能恢復(fù)情況。b)BBB評分：左右兩肢取平均值，作為每只大鼠每次神經(jīng)功能評定的得分，BBB評分聯(lián)合考察大鼠后肢的運(yùn)動、軀干位置及穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調(diào)性、爪的置放、足趾間隙及尾的位置。   1.5  統(tǒng)計學(xué)分析

11、60; 實驗數(shù)據(jù)用±s表示，用SPSS 11.0軟件包處理數(shù)據(jù)，采用方差分析進(jìn)行組間差異分析。   2  結(jié)   果   2.1  細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果  細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果見表1。Sham組未見凋亡細(xì)胞；A組凋亡細(xì)胞百分率傷后24 h開始升高，48 h達(dá)高峰，72 h開始下降；B組凋亡細(xì)胞百分率傷后24 h、48 h及72 h與A組相比明顯減少，差異具有顯著性(P0.05或P0.01)。   2.2  脊髓功能恢復(fù)比較  Sham組的脊髓神經(jīng)功能穩(wěn)定

12、，其斜板試驗角度和BBB評分在SCI后 24 h分別達(dá)到60°和20分左右，表現(xiàn)基本正常。和A組相比，MT治療組神經(jīng)功能恢復(fù)均有不同程度提高。其中，MT治療組斜板試驗可以觀察到運(yùn)動功能總的提高，至第3天和第7天，運(yùn)動功能提高，差異具有顯著性(P0.05或P0.01)，見表2。同時MT治療組BBB評分也有不同程度的提高，至SCI后3、7 d，兩組之間差異具有顯著性(P0.05或P0.01)，見表3。表1  MT對SCI后傷段脊髓組織細(xì)胞凋亡的影響 表2  MT對大鼠SCI后斜板試驗的影響 表3  MT對大鼠SCI后BBB評分的影響  

13、3  討   論   文獻(xiàn)報道急性脊髓損傷后細(xì)胞凋亡對神經(jīng)細(xì)胞的繼發(fā)性損害起重要作用1。褪黑素是存在人體內(nèi)的重要神經(jīng)內(nèi)分泌活性物質(zhì)，具有高度的脂溶性和水溶性，能透過細(xì)胞膜和核膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和核內(nèi)發(fā)揮作用。研究已證實褪黑素可以抑制大鼠急性脊髓損傷后脊髓組織內(nèi)丙二醛、一氧化氮合酶等自由基的產(chǎn)生，提高脊髓組織超氧化物歧化酶的含量，減少脊髓損傷后的自由基損害23，而褪黑素對SCI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響未見報道。   本實驗結(jié)果顯示，單純脊髓損傷組(A組)凋亡細(xì)胞百分率傷后24 h開始升高，48 h達(dá)高峰，72 h開始下降，表明脊髓損傷后

14、細(xì)胞凋亡活躍，參與了對脊髓組織的損害。MT治療組(B組)凋亡細(xì)胞百分率傷后24、48、72 h與A組相比明顯減少，差異具有顯著性意義(P0.05或P0.01)，表明脊髓損傷后早期應(yīng)用MT可以抑制脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡。同時神經(jīng)功能評分也觀察到MT治療明顯提高了SCI大鼠的脊髓恢復(fù)功能，直接證實其對脊髓損傷有保護(hù)作用。急性脊髓損傷后自由基積聚，清除能力下降，處在一種氧化應(yīng)激狀態(tài)，這種氧化應(yīng)激能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡4，褪黑素能直接清除自由基，減輕氧化應(yīng)激損害，從而推測褪黑素可能是通過抑制脊髓損傷后的自由基損害這一途徑來減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。   本實驗證實急性脊髓損傷后，早期應(yīng)用褪黑素可以抑制脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而對脊髓損傷起保護(hù)作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1傅強(qiáng)，侯鐵勝，魯凱伍，等.大鼠脊髓急性損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡J.中華創(chuàng)傷雜志，2001，17(4)：3133.2Erten SF，Kocak A，Ozdemir I，et al.Protective effect of melatonin on experimental spinal cord ischemiaJ.Spinal C