分子生物學(xué)相關(guān)軟件操作與說明

1、分子生物學(xué)相關(guān)軟件操作與說明第一頁，共49頁。相關(guān)軟件相關(guān)軟件DNAstarPrimer primier 5.0Plasmid Toolkit 1.4s綜合性序列工具軟件，功能很廣，囊括分子生物學(xué)領(lǐng)域大多數(shù)內(nèi)容:查找ORF、序列較對、DNA序列翻譯、查找重復(fù)序列、RNA折疊、酶切位點(diǎn)分析、雙序列或多序列比較、遺傳進(jìn)化分析、引物設(shè)計(jì)、蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測、序列修整EditseqGenequestmapdrowMegalignProteanPrimerselectseqManGeneTank(序列編輯)Primer (引物設(shè)計(jì))Align (序列比較)Enzyme (酶切分析)Motif (模體分析)質(zhì)粒

2、繪圖工具，操作簡單。第二頁，共49頁。http:/ DNAstar是一多功能軟件包。目前應(yīng)用最廣的生物軟件之一。第三頁，共49頁。EditSeq是能夠輸入，并且可以修改DNA或蛋白質(zhì)序列的一種工具包。每個(gè)EditSeq文件都可以分為三個(gè)可編輯的部分：上邊的一部分為序列文件，中間的一部分是評論，底部是序列的注釋。 查找查找ORF 序列信息查看序列信息查看序列翻譯序列較對序列翻譯序列較對 從從Editseq開始開始 Editseq第四頁，共49頁。 Editseq打開已有序列打開已有序列從文件菜單，選擇從文件菜單，選擇Open。打開文件夾打開文件夾“Demo Sequences”單擊選定序列單擊選

3、定序列“TETHIS21”。單擊單擊Set Ends按鈕。按鈕。Set Ends被打開（如右）。被打開（如右）。 5框和框和3框中鍵入框中鍵入50和和850， 點(diǎn)擊點(diǎn)擊OK。單擊。單擊Open。 第五頁，共49頁。尋找開放讀框?qū)ふ议_放讀框 在這里，我們將確定序列中最大的在這里，我們將確定序列中最大的ORF，并翻譯它。并翻譯它。search 菜單的“查找ORF”，點(diǎn)擊，會(huì)出現(xiàn)右邊的對話框。 單擊單擊Find NextFind Next，尋找第一個(gè)尋找第一個(gè)ORFORF位置。位置。繼續(xù)點(diǎn)擊繼續(xù)點(diǎn)擊Find Next Find Next ，183-455183-455 bp的最大的最大ORFORF

4、Editseq第六頁，共49頁。DNA序列翻譯序列翻譯 選定選定ORFORF，從，從GoodiesGoodies菜單中選擇菜單中選擇“Translate” Translate” 翻譯的蛋白質(zhì)將出現(xiàn)在一新的末命名窗口。如右所示。下半部是一些蛋白質(zhì)的序列信息 Editseq第七頁，共49頁。序列信息查看序列信息查看 現(xiàn)在我們要使用現(xiàn)在我們要使用EditSeq菜單指令查看有關(guān)菜單指令查看有關(guān)打開的打開的TETHIS21序列的信息序列的信息 選定目的序列，點(diǎn)擊選定目的序列，點(diǎn)擊GOODIES 菜單中的菜單中的DNA Statistics。將。將出現(xiàn)左面的新窗口。出現(xiàn)左面的新窗口。 Editseq第八頁

5、，共49頁。序列校對序列校對 在完成對序列的編輯后，可通過EditSeq的校讀功能 ，進(jìn)行序列較對。單擊校對發(fā)音圖標(biāo)（序列窗口底部張開的嘴），或者從SPEECH 菜單，選Proof-Read Sequence。 Editseq第九頁，共49頁。GeneQuest可以幫助你發(fā)現(xiàn)和注釋可以幫助你發(fā)現(xiàn)和注釋DNA序序列的列的feature：包括：包括ORFS、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、位點(diǎn)、重復(fù)序列重復(fù)序列、RNA折疊折疊、限制性內(nèi)切、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)等。酶位點(diǎn)等。 在這一節(jié)中，我們將對已有的在這一節(jié)中，我們將對已有的GeneQuest文件文件“Nematode R01H10”進(jìn)行操作。進(jìn)行操

6、作。 從從GeneQuestGeneQuest開始開始 GeneQuest第十頁，共49頁。查找重復(fù)序列查找重復(fù)序列Inverted Repeats尋尋找反向重復(fù)序列。找反向重復(fù)序列。Dyad Repeats尋找尋找palindromes回文。回文。Direct Repeats尋尋找正向重復(fù)序列。找正向重復(fù)序列。 GeneQuest第十一頁，共49頁。RNA折疊折疊GeneQuest可以以RNA折疊形式查看序列特征。Analysis菜單中的“fold as RNA”選項(xiàng)。 GeneQuest第十二頁，共49頁。GeneQuest的其他特點(diǎn)的其他特點(diǎn) 序列酶切，模仿序列酶切，模仿agarose凝

7、膠電泳判定大凝膠電泳判定大小；??；打開方法簾（打開方法簾（method curtain）。）。從從More Methods中選擇中選擇Enzymes - Restriction Map 加入方法簾。加入方法簾。 GeneQuest第十三頁，共49頁。從從MapDraw開始開始 MapDraw工具可幫助你查找工具可幫助你查找DNA序列中的酶切位點(diǎn)，序列中的酶切位點(diǎn)，以便于下步克隆實(shí)驗(yàn)操作。以便于下步克隆實(shí)驗(yàn)操作。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示需要的不同，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示需要的不同，MapDraw可以制作可以制作6種類的酶切圖。從簡單的線種類的酶切圖。從簡單的線性圖到有注釋的環(huán)形

8、圖，性圖到有注釋的環(huán)形圖，在展示限制性酶切位點(diǎn)的同時(shí)，還可在展示限制性酶切位點(diǎn)的同時(shí)，還可以同時(shí)展示序列讀框及其翻譯結(jié)果。以同時(shí)展示序列讀框及其翻譯結(jié)果。 MapDraw第十四頁，共49頁。新酶切圖制作新酶切圖制作 以組氨酸以組氨酸DNA序列序列 “tethis21.seq” 為例。為例。首先我們尋找能夠首先我們尋找能夠切割組氨酸切割組氨酸DNA序序列的酶切位點(diǎn)。列的酶切位點(diǎn)。 從文件菜單選擇從文件菜單選擇 “open”,打開如右所打開如右所示窗口（點(diǎn)線圖）示窗口（點(diǎn)線圖） MapDraw第十五頁，共49頁。其它酶切圖表示方法其它酶切圖表示方法 如右所示，是一種酶如右所示，是一種酶切結(jié)果的環(huán)形

9、展示圖。切結(jié)果的環(huán)形展示圖。另有：另有：工作表形式工作表形式線性小地圖線性小地圖 線性圖線性圖 ORF Map MapDraw第十六頁，共49頁。MapDraw的延伸功能的延伸功能酶切位點(diǎn)按位置排序酶切位點(diǎn)按位置排序按酶的降序排序按酶的降序排序按酶切頻率排序按酶切頻率排序缺失酶切位點(diǎn)缺失酶切位點(diǎn)單一酶切位點(diǎn)單一酶切位點(diǎn) MapDraw第十七頁，共49頁。從從MegAlign開始開始 MegAlign可進(jìn)行可進(jìn)行DNA和蛋白質(zhì)序列的雙和蛋白質(zhì)序列的雙序列比較和多序列比較序列比較和多序列比較(multiple aligment)。根據(jù)多序列比較根據(jù)多序列比較(multiple aligment)的

10、隊(duì)的隊(duì)列列(aligment)結(jié)果，可制作進(jìn)化樹結(jié)果，可制作進(jìn)化樹（Phylogenetic trees）。）。有關(guān)序列距離的數(shù)據(jù)和殘基替代情況，有關(guān)序列距離的數(shù)據(jù)和殘基替代情況，可以容易地作成表格?？梢匀菀椎刈鞒杀砀?。 MegAlign第十八頁，共49頁。兩種基本方法兩種基本方法MegAlign提供兩種基本的隊(duì)列方法：配提供兩種基本的隊(duì)列方法：配對比較（雙序列比較）和多序列比較。對比較（雙序列比較）和多序列比較?！芭鋵Ρ容^配對比較”可以比較任何可以比較任何2個(gè)選定序列個(gè)選定序列的相似性，而的相似性，而“多序列比較多序列比較”對輸入到對輸入到工作臺(tái)中的所有序列進(jìn)行比較分析。工作臺(tái)中的所有序列進(jìn)

11、行比較分析。 MegAlign第十九頁，共49頁。創(chuàng)建隊(duì)列文件創(chuàng)建隊(duì)列文件 從文件菜單，選從文件菜單，選Enter Sequences打開打開Enter Sequences對話框?qū)υ捒?。從你從你DNASTAR文件夾文件夾中的中的“Demo MegAlign”，雙擊打開，雙擊打開“Histone Sequences.” MegAlign第二十頁，共49頁。配對比較配對比較MegAlign提供多種提供多種DNA配對比較方法：配對比較方法：Wilbur-Lipman，Martinez-Needleman-Wunsch和和Dotplot。在這入門介紹中，我們使用第一種方法。在這入門介紹中，我們使用第

12、一種方法。同時(shí)選中兩個(gè)序列。同時(shí)選中兩個(gè)序列。從從ALIGN 中的中的One Pair選擇選擇Wilbur-Lipman方法。方法。使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行比較，點(diǎn)擊使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行比較，點(diǎn)擊OK。出現(xiàn)如下頁所。出現(xiàn)如下頁所示界面。示界面。 MegAlign第二十一頁，共49頁。第二十二頁，共49頁。多序列比較多序列比較 為了在為了在MegAlign中進(jìn)行多序列比較，我們選中進(jìn)行多序列比較，我們選擇十四個(gè)相關(guān)的鈣調(diào)蛋白序列進(jìn)行操作。使擇十四個(gè)相關(guān)的鈣調(diào)蛋白序列進(jìn)行操作。使用這個(gè)大的數(shù)據(jù)庫，我們可以制作進(jìn)化樹，用這個(gè)大的數(shù)據(jù)庫，我們可以制作進(jìn)化樹，了解軟件的其他特性。了解軟件的其他特性。首先，我們要?jiǎng)?chuàng)建

13、一個(gè)包括首先，我們要?jiǎng)?chuàng)建一個(gè)包括14 個(gè)個(gè)calmodulin序列的新文件。序列的新文件。 MegAlign第二十三頁，共49頁。打開或輸入序列打開或輸入序列打開打開 “Demo MegAlign”文件夾文件夾 雙擊打開雙擊打開“Calmodulin Alignment” 文件文件從從OPTIONS MENU，使用使用Size命令增加字體命令增加字體大小到看得清楚為止。大小到看得清楚為止。 MegAlign第二十四頁，共49頁。簡單說明簡單說明現(xiàn)在我們需要選現(xiàn)在我們需要選MegAligns的兩個(gè)多序列比較方的兩個(gè)多序列比較方法中的一個(gè)進(jìn)行操作：法中的一個(gè)進(jìn)行操作：Clustal或者或者Jotu

14、n Hein。如果已知序列有一定的如果已知序列有一定的同源性同源性，我們推薦使用第二，我們推薦使用第二種，如果序列相關(guān)背景種，如果序列相關(guān)背景未知未知，可以選擇，可以選擇Clustal。我們使用的序列已知全部是我們使用的序列已知全部是calmodulins，所以，我，所以，我們使用們使用Jotun Hein 。 MegAlign第二十五頁，共49頁。簡單說明簡單說明在我們實(shí)行隊(duì)列之前，我們應(yīng)該選擇一在我們實(shí)行隊(duì)列之前，我們應(yīng)該選擇一個(gè)權(quán)重表。個(gè)權(quán)重表。MegAligns殘基權(quán)重表，用于對多序列殘基權(quán)重表，用于對多序列比較進(jìn)行評分，這樣雖然殘基不匹配，比較進(jìn)行評分，這樣雖然殘基不匹配，但殘基化學(xué)

15、性質(zhì)相似的序列的評分要比但殘基化學(xué)性質(zhì)相似的序列的評分要比化學(xué)性質(zhì)不相似的序列的評分要高。我化學(xué)性質(zhì)不相似的序列的評分要高。我們的序列是蛋白質(zhì)，并且我們將使用們的序列是蛋白質(zhì)，并且我們將使用Jotun Hein方法，所以方法，所以“Structural”表是表是最好的選擇。最好的選擇。 MegAlign第二十六頁，共49頁。設(shè)置權(quán)重表設(shè)置權(quán)重表l 從從ALIGN 菜單選擇菜單選擇Set Residue Weight Table打開打開左面的窗口。左面的窗口。l 從上面的下拉菜單選擇從上面的下拉菜單選擇Structural。單擊同意。單擊同意?，F(xiàn)在我們可以比較我們的現(xiàn)在我們可以比較我們的calm

16、odulin序列了。序列了。 MegAlign第二十七頁，共49頁。進(jìn)行隊(duì)列分析進(jìn)行隊(duì)列分析從從ALIGN MENU選擇選擇Jotun Hein Method。隊(duì)列進(jìn)程窗顯示比較完隊(duì)列進(jìn)程窗顯示比較完成的百分比。成的百分比。當(dāng)隊(duì)列完畢，工作臺(tái)會(huì)當(dāng)隊(duì)列完畢，工作臺(tái)會(huì)顯示隊(duì)列的結(jié)果。顯示隊(duì)列的結(jié)果。 MegAlign第二十八頁，共49頁。序列的差別和相似性序列的差別和相似性通過通過VIEW 菜單中的菜單中的Sequence Distanc查看查看序列的差別序列的差別和相似性和相似性 。如右所示如右所示 MegAlign第二十九頁，共49頁。殘基取代數(shù)目殘基取代數(shù)目通過VIEW 菜單中的Residu

17、e Substitutions查看殘基的替代數(shù)目（如右）。 MegAlign第三十頁，共49頁。Phylogenetic Tree查看查看 MegAlign第三十一頁，共49頁。查看隊(duì)列報(bào)告查看隊(duì)列報(bào)告 MegAlign第三十二頁，共49頁。創(chuàng)建創(chuàng)建Decorations和和Consensi 另外，我們可以通過加入另外，我們可以通過加入“decorations”和和“consensi.”來優(yōu)化展示的效果。來優(yōu)化展示的效果。 Decorations包括加框、加陰影和隱藏。在包括加框、加陰影和隱藏。在這節(jié)中，我們將介紹如何將一致堿基隱藏這節(jié)中，我們將介紹如何將一致堿基隱藏起來，使隊(duì)列報(bào)告更直觀、清

18、晰。起來，使隊(duì)列報(bào)告更直觀、清晰。 MegAlign第三十三頁，共49頁。Decorations“修飾修飾” 后的隊(duì)列報(bào)告后的隊(duì)列報(bào)告最終的隊(duì)列報(bào)告如右所示 MegAlign第三十四頁，共49頁。創(chuàng)建創(chuàng)建Decorations和和ConsensiConsensi是另外一種圖形展示方法，可是另外一種圖形展示方法，可以用來標(biāo)志以用來標(biāo)志ambiguous殘基。另外，序列殘基。另外，序列中一致和不一致的殘基可以用直方圖在中一致和不一致的殘基可以用直方圖在隊(duì)列報(bào)告中展示。當(dāng)在某個(gè)位置上，任隊(duì)列報(bào)告中展示。當(dāng)在某個(gè)位置上，任何一個(gè)序列的殘基與其他序列不一樣時(shí)，何一個(gè)序列的殘基與其他序列不一樣時(shí)，一致序列

19、就會(huì)以星號表示。并且用直方一致序列就會(huì)以星號表示。并且用直方圖的長短顯示其中一致殘基的多少。圖的長短顯示其中一致殘基的多少。 MegAlign第三十五頁，共49頁。Consensi“一致性一致性”優(yōu)化后的隊(duì)列報(bào)告優(yōu)化后的隊(duì)列報(bào)告最終的隊(duì)列報(bào)告便如右所示 MegAlign第三十六頁，共49頁。從從Protean開始開始 在這一節(jié)中，利用在這一節(jié)中，利用protean軟件包，我軟件包，我們可以對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、電荷分布、們可以對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、電荷分布、疏水性、抗原性等進(jìn)行預(yù)測。疏水性、抗原性等進(jìn)行預(yù)測。 Protean第三十七頁，共49頁。創(chuàng)建蛋白質(zhì)分析文件創(chuàng)建蛋白質(zhì)分析文件 打開名為打開名

20、為“Demo Sequences.”的文的文件夾。件夾。 雙擊雙擊“Human Calmodulin” ，打打開如右窗口，在開如右窗口，在這里，可以看到這里，可以看到 Protean第三十八頁，共49頁。ProteansProteans蛋白質(zhì)分析方蛋白質(zhì)分析方法法 使用蛋白酶消化與使用蛋白酶消化與SDS PAGE電泳電泳 Protean可以識別蛋白序列上的蛋白酶酶切位點(diǎn)，并將酶切片段的電泳結(jié)果可以識別蛋白序列上的蛋白酶酶切位點(diǎn)，并將酶切片段的電泳結(jié)果以圖形展示出來。以圖形展示出來。 二級結(jié)構(gòu)模擬二級結(jié)構(gòu)模擬 Protean能夠展示諸如螺旋輪，螺旋網(wǎng)和能夠展示諸如螺旋輪，螺旋網(wǎng)和beta片層等基

21、本元件的二級片層等基本元件的二級結(jié)構(gòu)。在這一節(jié)中，我們做一個(gè)阿爾法區(qū)域的螺旋輪二級結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。在這一節(jié)中，我們做一個(gè)阿爾法區(qū)域的螺旋輪二級結(jié)構(gòu)。 展示滴定曲線展示滴定曲線 Protean會(huì)在等電點(diǎn)處加一個(gè)藍(lán)色的會(huì)在等電點(diǎn)處加一個(gè)藍(lán)色的“crosshairs”，以顯示，以顯示pH和和所帶電荷。所帶電荷。 Protean第三十九頁，共49頁。Primer primier 5.0是一種設(shè)計(jì)引物的應(yīng)用軟件，利用它的高級引物搜索、引物數(shù)據(jù)庫、引物編輯和分析等功能可以設(shè)計(jì)出具有高效擴(kuò)增能力的理想引物。第四十頁，共49頁。primer簡介簡介該軟件主要由一下四個(gè)主要功能板塊組成：Primer 引物設(shè)計(jì)引物設(shè)

22、計(jì)Align 序列比較Enzyme 酶切分析Motif 模體分析primer第四十一頁，共49頁。一些原則和說明一些原則和說明引物長度引物長度一般為一般為18到到24個(gè)堿基個(gè)堿基控制著引物的特異性和在控制著引物的特異性和在PCR反應(yīng)中的退火溫反應(yīng)中的退火溫度度TM值值56到到63C，引物對的，引物對的TM值要接近。值要接近。GC含量含量在在50%左右比較合適左右比較合適多義性多義性 盡量減少引物多義性，特別是盡量減少引物多義性，特別是3 3 End Stability 穩(wěn)定性較強(qiáng)的穩(wěn)定性較強(qiáng)的5 末端和相對較弱的末端和相對較弱的3 末端。末端。primer第四十二頁，共49頁。一些原則和說明一些原則和說明二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)Hairpin 發(fā)卡結(jié)構(gòu)：發(fā)卡結(jié)構(gòu)：自由能值大于自由能值大于0二聚體二聚體：3 末端配對很容易引起引物二聚體擴(kuò)增末端配對很容易引起引物二聚體擴(kuò)增False Priming 錯(cuò)配錯(cuò)配：降低擴(kuò)增效率，特別是：降低擴(kuò)增效率，特別是3 Pair Rati