銀杏葉提取物對兔脊髓缺血再灌注損傷的保護作用

1、銀杏葉提取物對兔脊髓缺血再灌注損傷的保護作用               作者：樊立宏，王坤正，程斌【關(guān)鍵詞】  銀杏葉提取物   摘要  目的：探討銀杏葉提取物對兔脊髓缺血再灌注（ischemiareperfusion, IR）損傷的保護作用及其機制。方法：27只新西蘭大白兔隨機分為假手術(shù)組、模型組和銀杏葉提取物治療組，每組9只。建立兔脊髓IR模型。對脊髓IR前及IR后24、48 h實驗兔后肢運動功能進行評分，檢測缺血脊髓組

2、織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和丙二醛（malondialdehyde, MDA）的含量，并檢測缺血脊髓組織神經(jīng)細胞的凋亡指數(shù)及Bcl2、Bax蛋白的表達水平。結(jié)果：銀杏葉提取物可明顯改善脊髓IR后實驗兔的后肢運動功能；提高脊髓組織中SOD的活性，降低MDA的水平；通過上調(diào)Bcl2及下調(diào)Bax蛋白的表達，抑制IR所致的脊髓神經(jīng)細胞的凋亡。結(jié)論：銀杏葉提取物對脊髓IR損傷有一定的保護作用，其機制可能與減輕脊髓神經(jīng)細胞脂質(zhì)過氧化損傷和抑制神經(jīng)細胞的凋亡有關(guān)。關(guān)鍵詞  銀杏葉提取物; 再灌注損傷; 細胞凋亡; 脊髓; 脂質(zhì)過氧化作用Protecti

3、ve effects of ginkgo leaf extracts on neurons in spinal cord after ischemiareperfusion injury in rabbitsABSTRACT  Objective: To observe the protective effects of ginkgo leaf extracts on spinal cord after ischemiareperfusion (IR) injury in rabbits and to find out its possible mechanism. Methods:

4、 Twentyseven New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups, which were shamoperation group, untreated group and ginkgo leaf extractstreated group. The locomotor scores of hindlimbs in rabbits after 24 and 48 h of reperfusion were evaluated, and the activity of superoxide dismutas

5、e (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) in ischemia spinal cord were examined. The apoptotic index (AI) of neurons in spinal cord was detected by terminal deoxyribonucleotidyl transferase (TdT)mediated dUTPbiotin nick end labeling (TUNEL) method. The expressions of Bcl2 and Bax proteins wer

6、e examined by streptavidinbiotin peroxidase method. Results: The locomotor scores of hindlimbs in rabbits after 24 and 48 h of reperfusion in the ginkgo leaf extractstreated group were obviously elevated as compared with those in the untreated group (P0.05). The activity of SOD was higher and the le

7、vel of MDA was lower in ischemia spinal cord in the ginkgo leaf extractstreated group than those in the untreated group (P0.01). The decreased neuron AI and the expressions of upregulated Bcl2 protein and downregulated Bax protein were also observed in the ginkgo leaf extractstreated group. Conclusi

8、on: The protective effects of the ginkgo leaf extracts against spinal cord injury induced by IR may be related to scavenging oxygen free radicals, reducing lipid peroxidation injury and inhibiting apoptosis.KEY WORDS  ginkgo leaf extracts; reperfusion injury; apoptosis; spinal cord; lipid perox

9、idation銀杏葉提取物是從銀杏科植物銀杏的葉子中提取的有效成分，研究表明其對心、腦、肝、腎等器官的缺血再灌注（ischemiareperfusion, IR）損傷具有保護作用，但對脊髓缺血再灌注損傷是否有保護作用則鮮見報道。本研究采用兔腹主動脈阻斷建立脊髓IR損傷模型，探討銀杏葉提取物對脊髓IR損傷的保護作用及其機制，為臨床應用提供實驗依據(jù)。1  材料和方法1.1  材料1.2  兔脊髓IR損傷模型制備  參照Zivin1法，用戊巴比妥納按30 mg/kg予以兔靜脈注射麻醉后，于兔左腎動脈起始處下方0.5 cm處夾閉腹主動脈30 min，然后去除血管

10、夾進行再灌注。1.3  動物分組及藥物處理  27只大白兔，隨機分為3組：假手術(shù)組、模型組和銀杏葉提取物治療組，每組各9只。銀杏葉提取物治療組于腹主動脈夾閉前30 min及再灌注開始后靜脈輸入銀杏葉提取物100 mg/kg。模型組以等量生理鹽水替代銀杏葉提取物。假手術(shù)組僅暴露腹主動脈，不夾閉血管，亦不予以藥物處理。1.4  兔后肢運動功能評分  再灌注24、48 h后分別采用單盲法對兔后肢運動功能進行評分2：后肢完全癱瘓，0分；后肢嚴重的不全癱瘓，1分；后肢可以運動但不能跳躍，2分；后肢可以跳躍但明顯不穩(wěn)，3分；后肢可以跳躍但有輕微不穩(wěn)，4分；后肢運動功

11、能完全正常，5分。1.5  脊髓組織指標檢測1.6  統(tǒng)計學方法  采用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料均數(shù)用x±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，后肢運動功能評分比較采用秩和檢驗。2  結(jié)果2.1  銀杏葉提取物對神經(jīng)運動功能的影響  假手術(shù)組實驗兔后肢運動功能正常。模型組和銀杏葉提取物治療組實驗兔于缺血再灌注后均出現(xiàn)不同程度的癱瘓，再灌注后2448 h，部分兔的后肢運動功能再次惡化，甚至出現(xiàn)第2次癱瘓。銀杏葉提取物治療組實驗兔后肢運動功能的恢復情況要優(yōu)于模型組，于IR后24、48 h，兩組之間比較有統(tǒng)計學差

12、異。見表1。2.2  銀杏葉提取物對脊髓組織SOD、MDA含量的影響  假手術(shù)組實驗兔脊髓組織的SOD含量較高，而MDA則處于較低水平。模型組SOD含量則有明顯降低，MDA含量明顯升高，與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計學差異。銀杏葉提取物治療組與模型組比較，SOD含量明顯升高，MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義。見表2。2.3  銀杏葉提取物對脊髓神經(jīng)細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響  假手術(shù)組脊髓組織未見神經(jīng)細胞凋亡，Bcl2、Bax蛋白亦呈極少量表達。模型組脊髓組織可見大量凋亡細胞，Bax蛋白在缺血組織中大量表達，而Bcl2蛋白表達則較低，兩者比例失調(diào)。與模型

13、組比較，銀杏葉提取物治療組凋亡細胞明顯減少，Bax蛋白的表達明顯降低，Bcl2蛋白的表達則有增高，差異有統(tǒng)計學意義。見表3和圖17。表1  銀杏葉提取物治療組和模型組實驗兔于IR后24、48 h后肢運動功能評分（略）Table 1  Locomotor scores of hindlimbs in rabbits after 24 and 48 h of reperfusion in ginkgo leaf extractstreated group and untreated group*P0.05, vs ginkgo leaf extractstreated grou

14、p.表2  IR后48 h各組實驗兔脊髓組織SOD活性和MDA含量（略）Table 2  Activity of SOD and content of MDA in ischemia spinal cord in rabbits after 48 h of reperfusion in three groups*P0.01, vs untreated group; P0.01, vs shamoperation group.表3  IR后48 h各組實驗兔脊髓組織AI及Bcl2、Bax蛋白表達（略）Table 3  AI and expressions

15、of Bcl2 and Bax proteins in ischemia spinal cord in rabbits after 48 h of reperfusion in three groups*P0.01, vs untreated group; P0.01, vs shamoperation group.         圖1  兔脊髓IR損傷后48 h各組脊髓神經(jīng)細胞的凋亡情況（TUNEL method, ×200）（略）Figure 1  Neuron apoptosi

16、s in ischemia spinal cord in rabbits after 48 h of reperfusion in three groupsA: Shamoperation group; B: Untreated group; C: Ginkgo leaf extractstreated group.圖2  兔脊髓IR損傷后48 h脊髓組織Bax蛋白的表達情況（SP method, ×400）（略）Figure 2  Bax protein expression in ischemia spinal cord in rabbits after 48

17、 h of reperfusion  A: Untreated group; B: Ginkgo leaf extractstreated group.圖3  兔脊髓IR損傷后48 h脊髓組織Bcl2蛋白的表達情況（SP method, ×400）（略）Figure 3  Bcl2 protein expression in ischemia spinal cord in rabbits after 48 h of reperfusion  A: Untreated group; B: Ginkgo leaf extract

18、streated group.3  討論IR損傷時最重要的毒性物質(zhì)是自由基，而脂質(zhì)過氧化是其主要的損傷機制。脊髓發(fā)生IR后，黃嘌呤、次黃嘌呤等ATP代謝產(chǎn)物及黃嘌呤氧化酶大量生成，并產(chǎn)生大量的氧自由基3，作用于細胞膜磷脂，使溶酶體、線粒體和細胞膜遭受破壞。神經(jīng)組織中的脂質(zhì)含量較高，因此脊髓對自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應尤為敏感，自由基可通過多種途徑（膜損傷、線粒體損傷、DNA直接損傷等）導致脊髓神經(jīng)細胞發(fā)生不同程度的凋亡或壞死。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脊髓IR損傷動物的后肢運動功能評分與假手術(shù)組比較有明顯下降，其脊髓組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量升高而抗氧化酶SOD的含量則有明顯下降，差異有

19、統(tǒng)計學意義，驗證了氧自由基在脊髓IR中所起的損傷作用。以往認為，脊髓缺血后神經(jīng)細胞的死亡方式為缺血壞死。但近年來有研究認為，細胞凋亡可能是脊髓缺血后神經(jīng)細胞死亡的主要方式。Hayashi等4報道，脊髓發(fā)生IR損傷后，運動神經(jīng)元的死亡主要與凋亡程序的激活有關(guān)。細胞凋亡與多種機制相關(guān)，如自由基作用和基因調(diào)控。氧自由基可以通過脂質(zhì)過氧化損傷細胞膜和線粒體膜等途徑誘導促凋亡相關(guān)蛋白的表達，啟動凋亡程序。已有多項研究表明，氧自由基可以通過啟動Bcl2、Bax等細胞凋亡相關(guān)因素誘導細胞發(fā)生凋亡5。Bcl2與Bax是重要的凋亡調(diào)控基因，前者抑制細胞凋亡，后者促進細胞凋亡。Bcl2與Bax表達的比值可以提示細

20、胞是否發(fā)生凋亡，兩者比值增高時促進細胞存活，否則細胞發(fā)生死亡6。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組脊髓組織中Bax、Bcl2蛋白的表達基本呈陰性；模型組則可見大量凋亡細胞，Bax蛋白在缺血的脊髓組織中大量表達，Bcl2則表達較低，兩者比例失調(diào)，這與自由基的變化相一致，提示自由基在脊髓IR損傷時對細胞凋亡起著重要的作用。銀杏葉提取物中含有黃酮苷、萜烯內(nèi)酯這兩類主要的活性成分，具有明顯的清除自由基的作用。其中黃酮類化合物（山奈酚、槲皮素、異鼠李素等）可顯著降低超氧陰離子自由基的濃度。Xin等7報道，銀杏葉提取物可以通過清除自由基以保護小腦顆粒細胞免受過氧化損傷，并能對抗自由基誘導的神經(jīng)細胞凋亡。Smith等

21、8報道，銀杏葉提取物能上調(diào)PC12細胞Bcl2的表達、抑制caspase3的激活、下調(diào)caspase12及減少細胞色素C的釋放，并能減少DNA斷裂的發(fā)生，從而減少細胞凋亡。Unal等9發(fā)現(xiàn)，長期給予銀杏葉提取物可以增加大鼠局灶性腦缺血后Bcl2基因的表達。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物能明顯降低IR后脊髓組織中MDA的含量，保護SOD的活性，提示銀杏葉提取物能夠減輕由氧自由基介導的脂質(zhì)過氧化反應對脊髓的損害。銀杏葉提取物還能抑制脊髓IR后Bax基因的表達，并誘導Bcl2基因的表達，提示其可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達而抑制脊髓IR后的細胞凋亡。本實驗結(jié)果亦顯示，銀杏葉提取物有較好的清除氧自由基的

22、作用，可通過抗氧自由基損傷來調(diào)控凋亡相關(guān)基因Bcl2和Bax的表達，抑制IR后脊髓神經(jīng)細胞的凋亡，對脊髓IR損傷有一定的保護作用。參考文獻1  Zivin JA, DeGirolami U. Spinal cord infarction: a highly reproducible stroke model. Stroke, 1980, 11(2): 200202.2  Johnson SH, Kraimer JM, Graeber GM. Effects of flunarizine on neurological recovery and spinal cord blo

23、od flow in experimental spinal cord ischemia in rabbits. Stroke, 1993, 24(10): 15471553.3  Basu S, Hellberg A, Ulus AT, et al. Biomarkers of free radical injury during spinal cord ischemia. FEBS Lett, 2001, 508(1): 3638.4  Hayashi T, Sakurai M, Abe K, et al. Apoptosis of motor neurons with induction of caspases in the spinal cord after ischemia. Strok