醋酸薄膜電泳

1、實驗三 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳（Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins）1、掌握電泳法分離蛋白質(zhì)的原理2、熟悉醋酸纖維素薄膜電泳的操作、注意事項3、熟悉測定血清中各種蛋白質(zhì)相對百分含量 的方法4、了解AG的臨床意義 實驗目的分離蛋白質(zhì)的方法分離蛋白質(zhì)的方法分離方法分離方法沉淀法沉淀法鹽析法鹽析法有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法層析法層析法電學法電學法電泳法電泳法等電聚焦等電聚焦超速離心法超速離心法離子交換層析離子交換層析吸附層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）凝膠過濾（分子篩）親和層析親和層析電泳 依據(jù)分子或顆粒所帶

2、電荷、形狀、大小等不同，因而在電場介質(zhì)中移動速度不同，從而達到分離的技術。 一、電泳一、電泳PrCOO-NH2PrCOO-NH3+PrCOOHNH3+HOHHOHpHpI pH=pI pHpI 陰離子，向正極移動陽離子，向負極移動電泳速度電泳速度: :帶電粒子在電場中運動時，單帶電粒子在電場中運動時，單位電場強度內(nèi)粒子運動的速度，以位電場強度內(nèi)粒子運動的速度，以u u表示，表示，即即 V粒子運動的速度 X電場強度Q粒子所帶電荷 r粒子的半徑介質(zhì)的粘度VQu=X6r二、電泳的影響因素二、電泳的影響因素u 分離樣品的性質(zhì)分離樣品的性質(zhì)u 電泳介質(zhì)的電泳介質(zhì)的pHu 緩沖液的離子強度緩沖液的離子強度

3、u 電場強度電場強度u 電滲作用電滲作用電滲作用電滲作用 在電場中液體對固體支持物的相對移動.如果樣品原本是移向負極的，則泳動的速度加快；如果樣品原本是移向負極的，則泳動的速度加快；如果樣品原本是如果樣品原本是移向正極的，則泳動的速度減慢。移向正極的，則泳動的速度減慢。 負極負極正極正極 表面帶負電荷表面帶負電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負極移動帶正電荷的水層攜帶粒子向負極移動 三、電泳的分類三、電泳的分類支持介質(zhì)支持介質(zhì)不同紙電泳（Paper electrophorisis）醋酸纖維薄膜電泳（Cellulose Acetate electrophoresis）瓊脂凝膠電泳（Agar Gel e

4、lectrophoresis）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）支持介質(zhì)裝置形式支持介質(zhì)裝置形式不同： 平板式電泳 ； 垂直板式電泳 ； 垂直柱式電泳pH pH 的連續(xù)性的連續(xù)性不同： 連續(xù)pH 電泳 非連續(xù)pH 電泳血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins 本實驗以醋酸纖維膜為電泳支持物，分離各種血清蛋白。 醋酸纖維膜是由醋酸纖維加工制成的一種細密且薄的微孔膜。廣泛應用于醫(yī)學臨床中各種生物分子的分離分析中。實驗原理醋酸纖維素較紙電泳的優(yōu)點n電滲作用影響

5、小n醋酸纖維素膜對蛋白的吸附小，幾乎無“拖尾”。n由于醋酸纖維素親水性小，所容納的緩沖液也較少，電流大部分是由樣品傳導，所以分離速度快。醋酸纖維素是纖維素（紙）的醋酸酯醋酸纖維素是纖維素（紙）的醋酸酯血清蛋白質(zhì)血清蛋白質(zhì)n 清蛋白和球蛋白n 清蛋白和1、2、-球蛋白電泳電泳 血清蛋白的等電點pI大多在7.5以下，在pH為8.6的巴比妥緩沖液中以負離子形式存在，并且蛋白質(zhì)的分子量、立體構象、等電點及形狀也有差異，在電場中遷移速率不同，可以在醋酸纖維素薄膜上分離成清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、r球蛋白五個區(qū)帶 。預測電泳譜是預測電泳譜是什么樣？什么樣？血清蛋白電泳的正常組分 醋酸纖維膜電泳蛋

6、白組分變化的臨床意義（醋酸纖維膜電泳蛋白組分變化的臨床意義（A/GA/G） 可能相關疾病可能相關疾病清蛋清蛋白白1 1球蛋球蛋白白2 2球蛋球蛋白白球蛋球蛋白白球蛋球蛋白白骨髓瘤* *腎病綜合癥* * *腎炎* *肝硬化* *急性肝壞死 * *傳染性肝炎* * *急性感染初期* * * *慢性炎癥/感染后期* *低球蛋白血癥* * 實驗步驟一、準備與點樣一、準備與點樣1、濾紙橋； 2、電泳槽； 3、醋酸纖維素薄膜；4、電泳槽膜支架； 5、電極室中央隔板 鑷子取出鑷子取出膜條膜條取一條取一條2.52.58cm8cm的膜條的膜條充分浸透在充分浸透在巴比妥緩沖巴比妥緩沖液中液中濾紙吸去濾紙吸去多余的

7、緩多余的緩沖液沖液無光面距一無光面距一端端1.5cm1.5cm（大（大拇指寬）處拇指寬）處作點樣線作點樣線點樣器下端點樣器下端粘上薄層血粘上薄層血清清垂直垂直點樣點樣 加樣時一定要呈直線，垂直分布均勻，這樣泳動的區(qū)帶整齊不歪。加樣時一定要呈直線，垂直分布均勻，這樣泳動的區(qū)帶整齊不歪。放置放置膜條膜條平衡平衡5分鐘分鐘通通電電關閉關閉電源電源點樣面點樣面向下向下點樣端點樣端置于置于陰極陰極膜條貼膜條貼緊濾紙，緊濾紙，拉直膜條拉直膜條電壓：電壓：120v/160v時間：時間：10min/50 min二、電泳二、電泳點樣線勿與濾紙橋接觸點樣線勿與濾紙橋接觸 通電后，不要用手或鑷子接觸電泳槽，通電后，

8、不要用手或鑷子接觸電泳槽，通電完畢，先切斷電源，以防觸電。通電完畢，先切斷電源，以防觸電。通電通電完畢完畢浸于染色液浸于染色液（氨基黑（氨基黑10B10B）中）中取出取出膜條膜條三、染色、脫色三、染色、脫色取出取出膜條膜條3min依次浸于依次浸于漂洗液漂洗液、濾紙吸濾紙吸干薄膜干薄膜各各5min直至直至漂凈漂凈白蛋白白蛋白1球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 2球蛋白球蛋白點樣線點樣線 球蛋白球蛋白取試管取試管6支，編號如下支，編號如下四、定量四、定量 ( (兩人的膜條共用兩人的膜條共用) ) 試管編號試管編號A1 12 200.4mol/LNaOH 6.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3

9、.0ml蛋白條帶蛋白條帶 清蛋白清蛋白1 1球蛋白球蛋白2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白無蛋白區(qū)無蛋白區(qū)充分振蕩、脫凈染料充分振蕩、脫凈染料比比 色色650nm、定、定 量量15min 原始數(shù)據(jù)：清蛋白清蛋白1 1球蛋白球蛋白2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白A 表表1 1 血清各蛋白質(zhì)吸光值血清各蛋白質(zhì)吸光值儀器型號：儀器型號： 吸收波長：吸收波長： 實驗時間：實驗時間：實驗結果1計算出各部分蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的百分數(shù)。清蛋白（2A / T）1001球蛋白（ 1 / T）1002球蛋白（ 2 / T）100球蛋白（/ T）100球蛋白（/ T）100光密度總和T2A+12 2

10、計算出清蛋白與球蛋白之比值（A/G）G=12注意事項1.點樣面為不光滑面，勿用手觸摸感知；2.點樣量適中，垂直點樣；3.點樣端接電泳儀負極；4.膜條與濾紙需貼緊，拉直；5.謹防觸電。1、電泳時，點樣端置于電場的正極還是負極？為什么？2、電泳后，泳動在最前面的是何種蛋白質(zhì)？各譜帶為何種成分？請分析原因。3、電泳圖譜清晰的關鍵是什么？如何正確操作？實驗思考討論1.蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)？2.蛋白質(zhì)的鹽析？3.蛋白質(zhì)的顯色反應有哪些？4.分離蛋白質(zhì)的方法有哪些？5.層析技術的分類及各自的原理。6.透析的原理？實驗四 血清-球蛋白的提純待分離大分子的性質(zhì)待分離大分子的性質(zhì) 所帶的電荷、分子大小和形狀。分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。 pH值距離其等電點愈遠，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大。pH過高或過低會引起蛋白質(zhì)變性。電泳介質(zhì)的電泳介質(zhì)的pHpH緩沖液的離子強度緩沖液的離子強度u 離子強度過低，則緩沖能力差，不易維 持PH恒定；u 離子強度過高，在待分離分子周圍形成 較強的帶相反電荷的離子擴散層（即離 子氛），降低了蛋白質(zhì)的帶電量