第十章轉(zhuǎn)化與篩選

1、重組重組DNADNA導(dǎo)入宿主細(xì)導(dǎo)入宿主細(xì) 胞與轉(zhuǎn)化子的篩選胞與轉(zhuǎn)化子的篩選 第一節(jié)重組DNA向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入 第二節(jié)轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定 第三節(jié)目的基因序列測(cè)定第一節(jié)重組DNA向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入一、轉(zhuǎn)化二、通過(guò)接合作用傳遞質(zhì)粒DNA三、通過(guò)轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)作用傳遞遺傳物質(zhì)一、轉(zhuǎn)化:以質(zhì)粒作為克隆載體將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞1928年,美國(guó)的Oswald,Avery首次開(kāi)展了肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)感受態(tài)細(xì)菌是指細(xì)菌處于容易接受外源DNA的狀態(tài)。有的細(xì)菌在生長(zhǎng)周期任何時(shí)候自動(dòng)產(chǎn)生如枯草、嗜血桿菌。有的在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期發(fā)生，如E.coli。產(chǎn)生機(jī)制不明。一是原生質(zhì)體假說(shuō)，另一是酶受體假說(shuō)。轉(zhuǎn)化作用就是一種基因型細(xì)胞（感

2、受態(tài)細(xì)菌）從周?chē)橘|(zhì)中吸收來(lái)自另一種基因型細(xì)胞的DNA,進(jìn)而使原來(lái)細(xì)胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。常見(jiàn)轉(zhuǎn)化方法有 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法；原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法； 化學(xué)轉(zhuǎn)化法；化學(xué)轉(zhuǎn)化法； 電穿孔法。 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法:除去細(xì)胞壁后加外源DNA，經(jīng)吸收恢復(fù)再生培養(yǎng)，如枯草桿菌。 化學(xué)轉(zhuǎn)化法化學(xué)轉(zhuǎn)化法: 1970年Mandel和Higa首先用CaCl2經(jīng)短暫的熱休克后，可使外源DNA轉(zhuǎn)入E.coli。1.原理：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌在0下,用預(yù)冷的CaCl2溶液低滲處理,以使菌體的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性增加,菌體膨脹成球形。DNA易于進(jìn)入細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)。用冷CaCl2低滲處理E.coli使菌體成球

3、形，外源DNA可形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物而被吸附，經(jīng)短暫42熱休克，易于進(jìn)入胞內(nèi)而不被降解，轉(zhuǎn)化效率達(dá)105-106，它與菌株（hsdR-).2.方法:（1）感受態(tài)細(xì)菌的制備（2）轉(zhuǎn)化（1）感受態(tài)細(xì)菌的制備接種一環(huán)DH5于2mlLB中37，振蕩過(guò)夜以約1%的接種量接入20mlLB中振蕩培養(yǎng)約90至OD6000.2離心（5K，5）收集菌體加入預(yù)冷CaCl2（10ml100mM）冰浴20離心收集菌體加入100ul100mM預(yù)冷CaCl2混勻轉(zhuǎn)化項(xiàng)目CaCl2受體菌DNA液體LB皿a陽(yáng)性對(duì)照10ulPBR322DNAlng100ulb陰性對(duì)照10ul2ul連接液100ulc陰性對(duì)照10u

4、l100uld連接液轉(zhuǎn)化組60ul6ul連接液600ul（2）轉(zhuǎn)化：0，在1.5ml離心管中按下表加入CaCl2、受體菌及DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)冰浴30422（熱休克）冰浴，2加37預(yù)熱LB培養(yǎng)45表中a、b、c各取100ul/皿涂布（連接液轉(zhuǎn)化組d梯度涂布I50ul2皿；II.500ul濃縮后2皿）37倒置培養(yǎng)過(guò)夜檢查細(xì)菌生長(zhǎng)情況電穿孔法原理：利用高壓脈沖電場(chǎng),在宿主細(xì)胞表面形成暫時(shí)性的微孔,質(zhì)粒DNA可乘隙而入,在脈沖過(guò)后,微孔復(fù)原。它比CaCl2法操作更簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化效率高（一般可達(dá)1091010個(gè)轉(zhuǎn)化子gDNA）,不僅無(wú)需制備感受態(tài)細(xì)胞,而且適用于任何菌株。二、通過(guò)接合作用傳遞質(zhì)粒DNAF質(zhì)粒

5、（F因子）又稱(chēng)性質(zhì)粒,除了含有自我復(fù)制基因外,還帶有一套接合轉(zhuǎn)移的基因,凡攜有F質(zhì)粒的細(xì)菌稱(chēng)F+菌株。不帶有F質(zhì)粒的細(xì)菌稱(chēng)F菌株。F+菌株（供體菌）一旦與F菌株（受體菌）發(fā)生接觸，F(xiàn)+菌株可通過(guò)性菌毛將F質(zhì)粒轉(zhuǎn)給F菌株，使F-菌株轉(zhuǎn)變成F+菌株。質(zhì)粒由F+向F菌的轉(zhuǎn)移過(guò)程叫接合作用傳遞質(zhì)粒,又稱(chēng)質(zhì)粒的接合傳遞。凡帶有在染色體上整合F質(zhì)粒的細(xì)菌又稱(chēng)高頻重組株系（Hfr株系）。Hfr株系不穩(wěn)定，F(xiàn)質(zhì)粒可發(fā)生接合傳遞質(zhì)粒DNA,F+菌株可失去F質(zhì)粒,F菌也可獲得F質(zhì)粒,其轉(zhuǎn)移難以人為控制,又不穩(wěn)定，通常不用作克隆載體。接合- F+FF+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipient三、通過(guò)

6、轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)作用傳遞遺傳物質(zhì) 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染病毒（含噬菌體）DNA及其重組子DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（或細(xì)菌）的過(guò)程稱(chēng)轉(zhuǎn)染。 轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)以噬菌體為媒介，將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程稱(chēng)轉(zhuǎn)導(dǎo)。原理：1.重組外源基因的噬菌體DNA,體外包裝成噬菌體，感染宿主菌，同時(shí)導(dǎo)入外源基因。2.噬菌體的主動(dòng)感染將含有外源DNA片段的重組噬菌體DNA導(dǎo)入宿主菌體內(nèi)第二節(jié)轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定一、利用遺傳標(biāo)志的表型特征篩選二、根據(jù)重組子的結(jié)構(gòu)特征篩選一、利用遺傳標(biāo)志的表型特征篩選由載體提供的性狀進(jìn)行篩選 1.抗菌素抗性標(biāo)記篩選 2.抗性基因的插入失活篩選 3.-半乳糖苷酶（LacZ）基因失活篩選法及其-互補(bǔ)的原理根據(jù)插入基因的遺傳性狀進(jìn)

7、行篩選亮氨酸（Leu)缺陷菌在無(wú)Leu培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)，當(dāng)含Leu外源基因在此缺陷菌中表達(dá)時(shí)可生長(zhǎng)，以此來(lái)篩選陽(yáng)性克隆。Ampicillin 抗性? yes yesTetracycline 抗性? No yesB X BBBXAmproriAmprTcroriAmprTcroripBR322Bbacktransfer of colonies+ampicillin+ ampicillin+ tetracycline這些克隆是有重組質(zhì)粒的細(xì)菌編碼編碼b-半乳糖苷酶 IPTGX-gal(酶的底物酶的底物)lac promoter藍(lán)色菌落IPTG可誘導(dǎo)lacZ形成肽鏈,該產(chǎn)物能與有缺陷的宿主細(xì)胞所編碼的

8、N-末端發(fā)生基因內(nèi)互補(bǔ)，形成有活性的-半乳糖苷酶，分解底物X-gal使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。當(dāng)外源基因DNA片段插入多克隆位點(diǎn)后, 使其編碼的肽鏈?zhǔn)セ钚? 使其不能形成-互補(bǔ), 因此帶有外源基因重組子的細(xì)菌形成白色菌落。 非重組質(zhì)粒非重組質(zhì)粒: 不含有插入的 DNA藍(lán)色菌落 重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒: 含有插入的 DNA: 白色菌落back非重組質(zhì)粒非重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒-互補(bǔ)的原理所謂基因內(nèi)互補(bǔ)作用，在LacZ體系中,是指二個(gè)彼此互補(bǔ)的突變基因（突變體1缺失LacZ近操作基因區(qū)段LacI；突變體2帶有完整的近操縱基因而無(wú)-半乳糖苷酶活性），它們編碼產(chǎn)生的無(wú)活性的多肽產(chǎn)物，但由于二個(gè)突變體之間通過(guò)肽互補(bǔ)

9、作用可呈現(xiàn)有功能的-半乳糖苷酶活性,進(jìn)而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）而產(chǎn)生半乳糖和深藍(lán)色的底物5-溴-4-氯-青定藍(lán),使菌落呈現(xiàn)出藍(lán)色反應(yīng)。然而，當(dāng)外源基因DNA片段插入載體中LacZ肽區(qū)段的多克隆位點(diǎn)后,就會(huì)阻斷序列的讀碼結(jié)構(gòu),使其編碼的肽失去活性,使重組子所在的細(xì)菌不能完成-互補(bǔ),因此帶有外源基因重組子的細(xì)菌形成白色菌落。根據(jù)這種-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，可以檢測(cè)和篩選出攜有外源基因重組子克隆。此法又稱(chēng)藍(lán)白篩選法。如圖5-1二、根據(jù)重組子的結(jié)構(gòu)特征篩選 1.重組子大小鑒別篩選菌落提取質(zhì)粒單酶切電泳原質(zhì)粒 2.酶切鑒定菌落提取質(zhì)粒雙酶切電泳原質(zhì)粒 3.PCR篩

10、選法能與插入基因片斷兩端互補(bǔ)的特異引物,以少量抽提的重組子DNA為模板,進(jìn)行PCR分析 4.原位雜交圖5-3、5-4該法是從基因組文庫(kù)中篩選目的基因的首選方法。 5.斑點(diǎn)雜交1)重組體DNA或RNA抽提出來(lái),點(diǎn)膜，然后雜交。2)經(jīng)提取純化后,雜質(zhì)少,所以能得到更為確切的結(jié)果,既可用于定性,也可通過(guò)內(nèi)參照進(jìn)行相對(duì)定量。 6.Southernblot雜交法原位雜交與斑點(diǎn)雜交都只能鑒定整個(gè)重組子中是否會(huì)有與探針互補(bǔ)的同源片段,而Southernblot雜交能將同源片斷定位于基因鑒別法比較：同尾酶BamHI和BglIIAGATCTGGATCCTCTAGACCTAGGBglBamHIAGATCCTCTA

11、GT4連接酶GAGATCCTCTAGG肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第三節(jié)目的基因序列測(cè)定一、目的基因序列測(cè)定的意義 美國(guó)聯(lián)邦國(guó)家人類(lèi)基因組研究項(xiàng)目負(fù)責(zé)人弗朗西斯柯林斯博士在華盛頓隆重宣布，人類(lèi)基因組序列圖繪制成功，人類(lèi)基因組計(jì)劃的所有目標(biāo)全部實(shí)現(xiàn)。由美、英、日、法、德和中國(guó)科學(xué)家經(jīng)過(guò)13年努力共同繪制完成了人類(lèi)基因組序列圖，在人類(lèi)揭示生命奧秘、認(rèn)識(shí)自我的漫漫長(zhǎng)路上又邁出了重要的一步。 二、目的基因測(cè)序方法 酶法酶法雙脫氧鏈的末端終止法雙脫氧鏈的末端終止法 化學(xué)（裂解）法化學(xué)（裂解）法酶法酶法雙脫氧鏈的末端終止法雙脫氧鏈的末端終止法1.Sanger雙脫氧末端終止法：因摻入dd-NTP的鏈不能再延長(zhǎng)而形成不

12、同長(zhǎng)度的末端為A、G、C、T的片段。圖5-52.Sanger雙脫氧-M13體系測(cè)序法：采用M13噬菌體組裝基因后，再由引物合成不同長(zhǎng)度末端為A、G、C、T的片段圖5-63.Sanger雙脫氧-PUC體系測(cè)序法：類(lèi)似M13體系，只是由PUC體系替代M13噬菌體，再由引物合成不同長(zhǎng)度末端為A、G、C、T的片段。圖5-7雙脫氧M13體系DNA序列分析法M13含單鏈DNA，在細(xì)菌內(nèi)形成雙鏈環(huán)狀DNA（RF）。成熟的噬菌體含單鏈DNA分泌到培養(yǎng)液中。雙鏈DNA（RF）：克隆載體，按提取質(zhì)粒方法從細(xì)菌中制備單鏈DNA：測(cè)序模板，從培養(yǎng)基的上清中提取目前常用的M13mp18圖5-6 化學(xué)（裂解）法化學(xué)（裂解）法(如圖如圖)在無(wú)NaCl下，用聯(lián)氨（肼）可打開(kāi)C、T堿基，在C、T堿基發(fā)生斷裂，形成T+C組。加入NaCl，肼切割C形成C組。在中性條件下，硫酸二甲酯可在G處斷開(kāi)形成G組。加入甲酸可在A、G處斷開(kāi)，形成G+A組，最后電泳經(jīng)感光讀片，自動(dòng)分析得到測(cè)序結(jié)果。如、圖5-95-10全自動(dòng)DNA測(cè)序儀末端終止法，采用4種熒光染料標(biāo)記ddNTP，在同一泳道測(cè)序，為人類(lèi)基因