低氧預適應對移植肝內膽管的顯微及超微結構的影響.

1、低氧預適應對移植肝內膽管的顯微及超微結構的影響作者：張培建 周斌 金成 李勇 田田 馮敏 劉新顏 卜 平 作者單位：揚州大學醫(yī)學院 外科教研室【摘要】 目的：探討移植肝內膽管的顯微和超微結構的變化以及低 氧預適應的保護作用。方法：建立大鼠自體原位肝移植模型，30 只 SD 大鼠隨機分為 3 組， A 組：自體原位肝移植組； B 組：低氧預適應后行自體原位肝移 植組；C 組：假手術組。術后 48 h 取材，檢測各組血清膽紅素水平，光學顯 微鏡下觀察各組膽管上皮細胞的顯微結構，透射電子顯微鏡下觀察肝內毛細膽 管的超微結構。結果：A 組血清膽紅素水平比 B 組升高更明顯（PvO.01）;光 學顯微鏡

2、下，A 組與 B 組相比，膽管上皮細胞損傷嚴重，細胞排列缺失明顯， 炎性細胞浸潤增加；電子顯微鏡下， A組與 B 組相比，肝內毛細膽管管腔擴張 明顯，微絨毛腫脹、數(shù)量減少或消失的情況嚴重，膽汁淤積程度明顯。結論： 低氧預適應對移植肝內膽管具有顯著的保護作用?！娟P鍵詞】細胞低氧移植物膽管，肝內顯微結構超微結構Effect on the micro- and ultramicro-structure of intrahepatic bile ductmediated by hypoxic preconditioning after liver graftZHANG Pei-jian, ZHOU B

3、in, JIN Cheng, LI Yong, TIAN Tian, FENG Min, LIUXin-yan, BO PingInstitute of General Surgical Research, Medical College of YangzhouUniversity ( Yangzhou 225001, China )【ABSTRAC】T Objective: To investigate the change of the micro- andultramicro-structure of intrahepatic bile duct after liver graft an

4、d the protection ofhypoxic preconditioning. Methods: The model of orthotopic autologous livertransplantation was used, thirty SD rats were randomly divided into three groups. A:orthotopic autologous liver transplantation group; B: hypoxic preconditioning beforeoperation group; C: sham operation grou

5、p. The serum bilirubin ,the micro-structure ofbiliary epithelial cell and the ultramicro-structure of cholangiole were determined inthree groups after 48hours after operation. Results: As compared with B group: the serum bilirubinincreased (P0.05) ; the biliary epithelial cell was damaged and inflam

6、matory cellinfiltrated; the cholangiole was distended, microvilli were swelled the degree ofcholestasis were more obviously in group A. Conclusion: The micro- and ultramicro-structure of intrahepatic bile duct after liver graft were protected by hy肝移植術后膽道并發(fā)癥發(fā)生率高達 5.8 35，是肝移植后居第 2 位的主要并發(fā)癥 1，嚴重影響肝移植受者

7、術后生活質量、導致移植物喪失甚 至患者死亡2。非致死性低氧預適應(hypoxic preconditioning, HP 的大鼠腦組織損傷明顯減輕，這種內源性保護現(xiàn)象也存在于肝、腎等多種組織器 官3-4 。本研究通過觀察 HP 對移植肝內膽管顯微及超微結構的影響，來探 討 HP 對其的保護作用。1材料與方法1.1實驗動物及分組SD 大鼠 30 只(揚州大學動物實驗中心提供)，1012 周齡，體質量 200250 g。隨機分為 3 組，每小組 10 只。A 組：自體原位肝移植組；B 組：術前行 8%J 氧混合氣體的低氧預處理 90 min5,然后行自體原位肝移植；C 組：假手術組，僅行開腹，分離

8、肝門部即關 腹。各組于術后 48 h 迅速取材。1.2動物模型的制備 大鼠自體原位肝移植參照趙宏峰等 6的模型并進行改進，具體步驟如下。 1)乙醚半開放式面罩吸入麻醉，術前 10 min 肌 肉注射阿托品 0.03 mg，仰臥位固定。2)取正中切口進腹，進腹后逆時針游離 肝周韌帶。然后游離肝上腔靜脈( suprahepatic vena cava, SVC )、肝下腔靜 脈( inferior vena cava,IVC )。 解剖第一肝門， 游離肝動脈， 從腸系膜下靜 脈和脾靜脈匯合處游離門靜脈(portalvein, PV)至肝門部，并將 PV 壁鞘膜分離干凈。 3)在腸系膜上靜脈及脾靜脈

9、匯合處上無損傷血管夾，輕輕向上向后 提起血管夾，用 4 號針頭刺入 PV,并用無損傷血管夾固定穿刺針，推入肝素鹽 水約 3 mL，使肝臟內的血液進入體循環(huán)，準備進行冷灌注。4)冷灌注前分別在肝動脈、SVC IVC 上無損傷血管夾，并在 IVC 血管夾稍上方靜脈壁剪開約 1 mn 缺口作流出道。然后經(jīng) PV 穿刺處灌注 4 C 含肝素的乳酸林格液，在灌注的 同時不斷用4C乳酸林格液澆注肝臟表面降溫。直至肝臟逐漸變成土黃色時停止灌注。5)灌注完成后拔出穿刺針，用 prolene 縫線修補 PV 穿刺點和 IVC 流 出道，并預松血管夾查看修補是否成功，成功后分別松開PV SVC IVC 及肝動脈的

10、無損傷血管夾，使肝臟復流，結束無肝期。同時用38C生理鹽水 20 mL澆注肝臟表面以快速復溫。6)關腹，38C恒溫箱清潔飼養(yǎng)。1.3觀測指標及方法 1)心臟取血以全自動生化分析儀測定血清總膽紅素( total bilirubin ， TBIL )、直接膽紅素( direct bilirubin ， DBIL) 和間接膽紅素( indirect bilirubin, IBIL)。 2)肝內膽管的顯微結構：動物取血后立即處死，迅速切取肝左葉，取5 mm 10 mm 大小置于 10%勺中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋制片，HE 染色，光學顯微鏡觀察并采集圖像。3)肝內毛 細膽管的超微結構：動物取血后立即處

11、死，迅速切取肝左葉，取1 mmx 1 mm 大小， 2%戊二醛、 1%鋨酸固定后，逐級乙醇脫水、環(huán)氧乙酸置換、浸透、包埋， 超薄切片、鈾酸染色，透射電子顯微鏡觀察并采集圖像。1.4統(tǒng)計學處理 采用 SPSS10.0 統(tǒng)計軟件包進行分析，實驗數(shù)據(jù)用 xs表示，獨立樣本 t 檢驗比較兩組間均數(shù)的差異，單因素方差分析比較多組 間均數(shù)的差異。pw0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1膽紅素水平 與 C 組相比較，A 組與 B 組都有不同程度的升高，A組比 B 組升高更明顯（P0.01）;其中以 A 組 DBIL 升高較其他兩組明顯（P 0.05，表 1）。2.2肝內膽管上皮細胞顯微結構變化C 組肝

12、內膽管上皮細胞在光學顯微鏡下呈柱狀，排列整齊;細胞核位于基底部，無炎癥細胞浸潤，管腔內無 或少有脫落壞死的上皮細胞。A 組可見膽管上皮細胞排列紊亂、有缺失；細胞 腫脹明顯，形態(tài)多樣，部分呈立方狀或柱狀;細胞核內染色質邊集，部分細胞 出現(xiàn)核分裂；膽管上皮細胞周圍炎癥細胞浸潤明顯，管腔內可見壞死脫落的細 胞碎片。B 組肝內膽管上皮細胞損傷程度較 A 組明顯減輕（圖 1）。2.3肝內毛細膽管超微結構變化C 組肝內毛細膽管壁實際由肝細胞的界膜作局灶性分隔而形成，管腔直徑約 1 卩 m 其間無細胞器，腔內見散在 分布微絲結構和豐富的微絨毛突起，部分微絲可延伸至膽管微絨毛中。A組毛細膽管腔明顯擴大，其中的

13、微絨毛腫脹、減少或缺失；毛細膽管腔內膽汁淤積 明顯，顆粒成份增加。B 組毛細膽管腔未見擴大，微絨毛豐富，腫脹不明顯； 管腔內無明顯膽汁淤積的表現(xiàn)，顆粒成份較少（圖 2）。3討論本研究采用自體原位肝移植模型，很好的模擬了原位肝移植過程中 膽管經(jīng)歷的缺血再灌注損傷（ ischemia and reperfusion injury, IRI）。另外本模型與大鼠異體原位肝移植相比不切斷出入肝的血管，避免了血管吻合， 降低了手術難度，并且自體移植完全排除了免疫排斥方面的影響，能夠更直 接、更客觀地反映 IRI 對肝內膽管的損傷作用 6。隨著對膽道并發(fā)癥認識的 深入和外科吻合技術的提高，由外科技術原因造成

14、的膽管吻合口并發(fā)癥及引流 管相關并發(fā)癥的發(fā)生率呈下降的趨勢，而非外科技術因素所導致的以移植物膽 管樹損害為主要特征的供體膽管并發(fā)癥則成為術后膽管并發(fā)癥的主要類型。一 般認為， IRI 是導致非外科性移植物膽管樹損害最重要的始動因素之一7。有研究表明，HP 可以通過促使線粒體在低氧狀態(tài)下糖酵解供能增加，改善移植 術后的肝臟微循環(huán)，從而提高肝細胞對肝移植時較嚴重的 IRI 耐受力，提高移 植術后的存活率 8。毛細膽管由相鄰肝細胞的毛細膽管面構成，是膽汁形成和分泌的主 要場所，由毛細膽管形成和分泌的膽汁約占每日膽汁形成和分泌總量的75%。已有研究指出，毛細膽管是肝臟中最容易遭受 IRI 的結構之一

15、9，再灌注后 肝細胞毛細膽管面可發(fā)生顯著的形態(tài)學改變。陳耿等 7在移植肝門靜脈血流 恢復后 6090 min 取得的標本中，見毛細膽管明顯擴張，呈靜脈曲張樣改變，微絨毛消失，同時伴隨周圍微絲結構的改變和膽汁分泌的減少。本研究同樣顯 示，肝內毛細膽管經(jīng)歷了自體原位肝移植 IRI 后，通過透射電子顯微鏡觀察可 見毛細膽管腔擴張明顯，微絨毛腫脹、減少或缺失；毛細膽管腔內膽汁淤積明 顯，顆粒成份增加。而經(jīng)過低氧預處理后行自體原位肝移植組，肝內毛細膽管 腔未見明顯擴大，微絨毛豐富，腫脹不明顯；管腔內無明顯膽汁淤積，顆粒成 份較少。同時，術后的血清膽紅素指標顯示，與B 組相比，A 組血清膽紅素水平較 C

16、組升高更明顯，其中以 DBIL 升高為主（PvO.01）。兩者結合均提示經(jīng)過 低氧預處理后，肝內毛細膽管的功能得到了很好的保護，術后膽汁淤積程度明 顯減輕。繼而減輕了肝內膽管在肝移植過程中所經(jīng)歷的 IRI ，減少了非外科技 術因素所導致的膽管并發(fā)癥。由于肝內膽管僅由肝動脈供血，故膽管上皮細胞應該是一類高氧 耗、高代謝、低缺氧耐受、易受損的細胞群體。膽管上皮細胞內缺乏過氧化氫 酶、過氧化物歧化酶、還原型谷胱甘肽等抗氧化的酶系，因而較肝細胞更易受 到 IRI 時氧自由基的損傷 10。 Elimadi 等11的研究提示，再灌注后小 葉間膽管上皮細胞損傷明顯，包括膽管直徑變小、上皮平均面積及微絨毛數(shù)量

17、 減少，甚至引起膽管上皮細胞干裂、脫落，出現(xiàn)黏膜全層壞死或穿孔，壞死后 纖維組織增生而致狹窄，這是肝移植術后非吻合性膽管狹窄的重要原因。本研 究顯示，肝內膽管上皮細胞經(jīng) IRI 光學顯微鏡下可見細胞排列紊亂，有缺失； 細胞腫脹明顯，形態(tài)多樣，部分呈立方狀或柱狀；細胞核內染色質邊集，部分 細胞出現(xiàn)核分裂；細胞周圍炎癥細胞浸潤明顯，管腔內可見壞死脫落的細胞碎 片。而經(jīng)過 HP 后行自體原位肝移植組，膽管上皮細胞損傷程度明顯減輕。說明 HP 對移植肝內膽管上皮細胞具有顯著的保護作用，可以預防和減輕肝移植術后 非吻合性膽管狹窄。但 HP 對其保護作用的確切機制有待于進一步研究?！緟⒖嘉墨I】1吳寶國，鄭

18、樹國，董家鴻，等 .供肝兩種再灌注方式對肝移植術后早期肝功 能影響的對比研究 J. 消化外科， 2006， 5（3）：175-178.2 Ben-Ari Z, Pappo O, Mor E Intrahepatie cholestasis after livetransplantationJ Liver Transpl ， 2003， 9（10）：1005-10183 Cai Z, Manalo DJ, Wei G, et al. Hearts from rodents exposed to intermittenthypoxia or erythropoietin are protected

19、 against ischemia-reperfusion injuryJ.Circulation， 2003,108 （ 1 ） :79-85.4 Dong JW, Zhu HF, Zhu WZ, et al. Intermittent hypoxia attenuatesischemia/reperfusion induced apoptosis in cardiac myocytes viaregulating Bcl-2/Bax expressionJ. Cell Res, 2003,13（5） ：385-391.5 Stroka DM, Burkhardt T, Desbaillets I, et al. HIF-1 is expressed in normoxic tissueand displays an organ specific regulation under systemic