1熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理如果兩個熒光團相距在1~10nm之間,且一個

1、1.熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理如果兩個熒光團相距在 PIO nm 之間，且一個熒光團的發(fā)射光譜與另一個熒光 團的吸收光譜有重疊，當供體被入射光激發(fā)時，可通過偶極-偶極耦合作用將其能量 以非輻射方式傳遞給受體分子,供體分子衰變到基態(tài)而不發(fā)射熒光，受體分子由基態(tài) 躍遷到激發(fā)態(tài)，再衰變到基態(tài)同時發(fā)射熒光。這一過程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (fluorescenceresonance energy transfer, FRET)。優(yōu)點1. 適用于活細胞和固定細胞的各類分子，2. 靈敬度和分辨率高，并能清晰成像，3. 準確度高，操作簡便4. 最直觀地提供蛋口質(zhì)相互作用的定位和定量信息，缺點首先,FRET 對空間構(gòu)

2、想改變十分敬感,其測量范圍在 P10 nm,但如果待測蛋口 原本就相當接近，F(xiàn)RET 信號已經(jīng)達到最大值，此時一些刺激引起的微小的構(gòu)想改變 就可能無法引起 FRET 信號的很大改變；其次，存在光漂口作用，F(xiàn)RET 需要起始激發(fā)光激發(fā) D,這時就很難避免對 A 的 間接激發(fā)，這樣的交義激發(fā)降低了分析的靈墩性；第三,存在其他一些本底熒光的干 擾；另外，起始激發(fā)光可能會破壞一些光敏的組織和細胞，產(chǎn)生光毒性。這些缺點 很大程度上限制了 FRET 的進一步發(fā)展。2. 蛋口質(zhì)雙雜交技術(shù)原理以與調(diào)控 SUC2 基因有關的兩個蛋口質(zhì) Snfl 和 Snf2 為模型，將前者與 Gal4 的 DB結(jié)構(gòu)域融合，另外

3、一個與 G&14 的 AD 結(jié)構(gòu)域的酸性區(qū)域融合。山 DB 和 AD 形 成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌” (bait)和“獵物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在 Snfl 和 Snf2 之間存在相互作用，那么分別位于這兩個 融合蛋口上的 DB 和 AD 就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而激活相應基因的 轉(zhuǎn)錄與表達。這個被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”相互作用的基因稱之為報 道基因(reporter gene)。通過對報道基因表達產(chǎn)物的檢測，反過來可判別作為誘餌”和“獵物”的兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點及局限雙雜交系統(tǒng)

4、的另一個重要的元件是報道株。報道株指經(jīng)改造的、含報道基因(reporter gene)的重組質(zhì)粒的宿主細胞。最常用的是酵母細胞，酵母細胞作為報道 株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點：1易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴增質(zhì)粒。2具 有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因。3酵母的內(nèi)源性蛋白不易同 來源于哺乳動物的蛋口結(jié)合。 一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 的 DA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如GAL4-bd, LexA-bd);另一個基因融合到轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如 GAL4-ad, VP16)o 激活結(jié)構(gòu)域融合基因轉(zhuǎn)入表達結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合基因的酵母細胞系 中，蛋白間的作用使得轉(zhuǎn)錄因子重建導致相鄰的報道基因表達

5、(如 lacZ),從而可分析蛋白間的結(jié)合作用。酵母雙雜交系統(tǒng)在分析蛋口一蛋口間相互作時的優(yōu)點：(1) 檢測在真核活細胞內(nèi)進行，在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實悄況。(2) 作用信號是在融合基因表達后，在細胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的，省 去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。(3) 檢測的結(jié)果可以是基因表達產(chǎn)物的積累效應，因而可檢測存在于蛋口質(zhì)之 間的微弱的或暫時的相互作用。(4) 酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構(gòu)建 cDNA文庫，能分析細胞漿、細胞核及膜結(jié)合蛋口等多種不同亞細胞部位及功能的蛋 白。(5) 分析新基因的生物學功能，用未知功能的基因去篩選文庫，然后根據(jù)釣到的 已知基

6、因的功能推測新基因的功能。缺點(1) 雙雜交系統(tǒng)分析蛋口間的相互作用定位于細胞核內(nèi)，而許多蛋口間的相互 作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應在細胞核內(nèi)無法進行。(2) 酵母雙雜交系統(tǒng)的“假陰性”(3) 酵母雙雜交系統(tǒng)的一個重要的問題是“假陽性”。3. 噬菌體展示技術(shù)原理噬菌體展示技術(shù)是利用基因工程手段將合成的一組一定長度的隨機序列寡核昔酸片段克隆到特定表達載體中，使其表達產(chǎn)物以融合蛋口的 形式呈現(xiàn)在絲狀噬菌體表面。進而通過親和富集法篩選表達有特異肽或蛋口質(zhì)的噬 菌體。優(yōu)點不受樣品量限制，可人工擴增，類似 PCR 對 DNA 的擴增融合 U 的蛋口的噬菌體被分泌出胞外，免去了細胞

7、破碎、提純等物理化學步驟, 保持了蛋白的天然構(gòu)象可進行反復篩選，對 U 的蛋口進行春花和富集缺點山于受大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率的限制，一般肽庫的容量只有 109,所以高于這一 限制的基因?qū)㈦y以表達。從建庫開始，密碼子的選擇與寡核昔酸的合成，即編碼肽的基因就帶有一定 的偏愛性，這就從先天決定了肽庫復雜度即多樣性的局限性。作為噬菌體的宿主，大腸桿菌的生物合成系統(tǒng)有本身的表達限制，如不能進 行氨基酸的修飾。4. 蛋口質(zhì)的親和色譜原理色譜乂叫層析。親和層析屬于吸附層析的范疇，根據(jù)不同物質(zhì)在同一吸附劑上 的吸附能力不同進行分離，將樣品放入基質(zhì)中，經(jīng)展開，吸附能力差的遷移快,吸附能 力強的遷移慢，達到分離的 U 的。優(yōu)點利用它從粗提液中經(jīng)過一次簡單的處理便可得到所需的高純度的活性物質(zhì)，不 但能可以用來分離一些含量極微的物質(zhì)，而且可以分離那些性質(zhì)十分相似的生化物 質(zhì)。缺點載體(如瓊脂糖)價格昂貴,機械強度低;配基制備困難，有的配基本身需要分離 純化，步驟繁瑣。5. 親和印跡原理印跡法(bloting)是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上,而后利用相