HIV感染的實驗室檢測

1、常用常用HIV病原學(xué)檢測方法病原學(xué)檢測方法: 病毒分離病毒分離 抗原檢測抗原檢測 核酸檢測（核酸檢測（ cDNA測定-PCR、 RNA測定-病毒載量） 其他方法：其他方法：逆轉(zhuǎn)錄酶測定、原位雜交常用常用HIV抗體檢測方法抗體檢測方法: ELISA 快速快速HIV檢測檢測 免疫印記法免疫印記法 （ Western Blot） 其他方法：其他方法：免疫熒光法（IFA）、放射免疫沉淀實驗 嬰幼兒HIV抗體陽性不能用于診斷感染HIV 嬰幼兒體內(nèi)從母親得到的HIV抗體持續(xù)存在時間最長不超過18個月。 在18月齡以前可以用多種不同的非抗體依賴性的檢驗方法對新生兒HIV感染進行輔助診斷，包括：HIV P24

2、抗原檢測、病毒分離培養(yǎng)、RNA或DNA測定。 18月齡以前嬰幼兒感染HIV診斷要結(jié)合臨床表現(xiàn)和實驗室綜合診斷。 輸血輸血和移植安全（為了接受者的安全）和移植安全（為了接受者的安全） 監(jiān)測監(jiān)測(為了知曉為了知曉人群流行狀況人群流行狀況) 臨床臨床HIV疾病的疾病的診斷診斷 (為了知曉為了知曉個體感染狀況個體感染狀況） 為了達到以上的某個目的的為了達到以上的某個目的的HIV 檢測可能不適檢測可能不適合其他目的，比如輸血服務(wù)的檢測不適合臨床診合其他目的，比如輸血服務(wù)的檢測不適合臨床診斷斷HIV感染感染 HIV抗體檢測分為篩查試驗（包括初篩和復(fù) 檢）和確認試驗（WB)。 （一）檢測試劑 篩查試劑必須是

3、經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準、批檢合格、臨床評估質(zhì)量優(yōu)良、在有效期內(nèi)的試劑。目前常用的篩查試劑有酶聯(lián)免疫、顆粒凝集和其它快速診斷試劑。采供血機構(gòu)進行血液篩查應(yīng)采用HIV-1/2混合型酶聯(lián)免疫試劑。自采自供血的單位必須進行HIV抗體檢測。 1. 常用的篩查方法是酶聯(lián)免疫試驗（ELISA）目前國內(nèi)外主要使用第三代（雙抗原夾心法）試劑，少數(shù)使用第二代試劑。血源篩查仍以第三代ELISA為主，國際上有些國家和地區(qū)已將線性免疫酶測定（第四代ELISA試劑）用于血源篩查。第四代ELISA試劑是最近發(fā)展起來的HIV抗原抗體聯(lián)合測定試劑，可同時檢測P24抗原和抗HIV-1/2抗體。與第三代抗HIV-1/2試

4、劑相比，檢出時間提前了4-9.1d。其優(yōu)點在于能同時檢測抗原抗體，降低血源篩查的殘余危險度。 ELISA的原理 ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗體或抗原的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性 。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。 用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的

5、量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。 雙抗原夾心法測抗體雙抗原夾心法測抗體 雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原 間接法測抗體間接法測抗體 競爭法、捕獲包被法等競爭法、捕獲包被法等 將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。 加受檢標本，保溫反應(yīng)。標本中的抗體與固相加受檢標本，保溫反應(yīng)。標本中的抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。去其他未結(jié)合物質(zhì)。 加酶標抗原，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的加

6、酶標抗原，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗體與酶標抗原結(jié)合，徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體與酶標抗原結(jié)合，徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗原?？乖?加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標本中抗體的量。物。通過比色，測知標本中抗體的量。包被了包被了HIV 抗原的檢測抗原的檢測板板患者的抗體患者的抗體酶酶顯色劑顯色劑+ ve- ve酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗HIV 檢測的介紹檢測的介紹ELISAELISA 板板質(zhì)控質(zhì)控陽性陽性陰性? 結(jié)果結(jié)果Introduction to HIV TestingModule 1 Sub Module 3 PPT0

7、2 隨著對HIV感染者和AIDS病人抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的進展，及對無癥狀HIV感染者提供自愿咨詢檢測（VCT）的迫切需求，簡便、快速的HIV檢測方法被廣泛應(yīng)用。常用的主要有以下幾種： （1）明膠顆粒凝集試驗（PA）：PA是HIV血清抗體檢測的一種簡便方法，是將HIV抗原致敏明膠顆粒作為載體，與待檢樣品作用，混勻后保溫（一般為室溫）。當待檢樣品含有HIV抗體時，經(jīng)抗原致敏的明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，根據(jù)明膠顆粒在孔中的凝集情況判讀結(jié)果。PA試劑有兩種，HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA試劑（AFD HIV-1/2 PA），已經(jīng)我國食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）注冊批準；HIV-1、H

8、IV-2抗原分別致敏的PA試劑（SERODIA-HIV-1/2）可初步區(qū)分HIV-1型和HIV-2型，目前我國尚未引進。 以硝酸纖維膜為載體，將HIV抗原滴在膜上成點狀，即為固相抗原。加血清樣品作用，以后步驟同ELISA。陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點。反應(yīng)時間在10 min以內(nèi)，使用抗原量少。 金標紙條采用雙抗原夾心法免疫測定原理，選擇經(jīng)純化的基因工程制備的gp36、gp41、p24抗原作為包被抗原和gp41、gp36基因工程抗原和p24合成肽作為膠體金結(jié)合抗原。當待檢標本中含有HIV抗體時，先和金標記抗原結(jié)合，由于層析作用反應(yīng)復(fù)合物沿硝酸纖維膜向前移動，當遇到包被抗原時，形成Ag-A

9、b-Ag-Au復(fù)合物而富集在包被線上，形成紅色沉淀線。同時在包被膜上還有一條質(zhì)控線對照，故當有兩條紅線時判為陽性，只有一條紅線時，判為陰性。 試劑穩(wěn)定，可室溫長期保存。試驗時不需任何設(shè)備，迅速、簡便、特異性較好，敏感性約相當于中度敏感的ELISA，適用于應(yīng)急檢測、門診急診個體檢測。目前已有在國內(nèi)被SFDA批準注冊的國外進口試劑和國內(nèi)產(chǎn)品。一般可在1030min內(nèi)判讀結(jié)果。無反應(yīng)無反應(yīng)反應(yīng)反應(yīng)無意義無意義無意義無意義無意義無意義無意義無意義金標法（膠體硒法）結(jié)果判定 （4）艾滋病唾液檢測卡：在硝酸纖維膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同時檢測含在唾液中的HIV-1/HIV-2

10、抗體，原理為酶免疫間接法。主要檢測唾液中的HIV IgA與IgG抗體，敏感性特異性與ELISA相近，可避免靜脈穿刺。但樣品預(yù)處理時間長且售價較高。以唾液為樣品測定HIV抗體的ELISA、免疫印跡法（WB）試劑已經(jīng)美國FDA批準 。 （5）其它快速篩查試驗方法： 家庭HIV檢測（Home Access System）等。 快速*平均45分鐘（10分鐘2.5小時） 常規(guī)平均3.5小時（94分鐘16小時）* 一般不要特殊設(shè)備，試劑可不用冰箱存放 一般不用于血液篩查（除5年行動計劃） 有一定的假陽性反應(yīng)，如作為臨床診斷，要復(fù)檢和確認 有一定的假陰性反應(yīng)（尤其暴露時間3個月） 隨訪檢測（解釋檢測前后咨詢

11、必要性） 根據(jù)檢測目的選用符合要求的篩查試劑對樣品進行初篩和重復(fù)檢測（復(fù)檢） 初篩試驗：以第三代ELISA（雙抗原夾心法）梅里埃試劑為例。 （1）實驗準備：試驗開始前將試劑和樣品放置在室溫(1823), 按實驗室SOP做好試劑準備。 磷酸鹽緩沖液：若液體內(nèi)有結(jié)晶,應(yīng)放置在37直至溶解，用蒸餾水1：25稀釋濃縮液，4保存2周。 TMB底物液：使用前配制，TMB液和過氧化脲液等量混勻。 1M硫酸終止液：85 ml蒸餾水中加入5 ml濃硫酸。 備好試劑盒、待檢樣品和外部對照質(zhì)控血清后，按試劑盒說明書以及質(zhì)控和安全防護要求進行篩查檢測。 （2）實驗操作 裝好所需使用數(shù)目的孔條,每孔均加入100l樣品稀

12、釋液。設(shè)3個陰性對照孔，1個HIV-1陽性對照孔，若需要可再設(shè)1個HIV-2陽性對照孔。 每孔加入50l待檢樣品及對照（對照要后加），未用孔用樣品稀釋液加滿以溶解結(jié)合物球，以免堵塞洗板機孔?？烧饟u15S，372孵育605min。 置洗板機上洗滌6遍（用洗液將反應(yīng)孔完全加滿,靜置3060S,共洗滌6遍，洗完后孔上方及底部不應(yīng)殘存液體.）。 每孔加入100l底物液，勿攪動，室溫避光孵育302min。 每孔加入100l 1M硫酸終止反應(yīng)，充分混勻。 在2h內(nèi)置于酶標儀讀數(shù)，單波長450nm，或雙波長450/630nm測OD值。 （3）實驗結(jié)果 陰性對照（NC），HIV-1陽性對照（PC1），HIV-2陽性對照（PC2） NC 必須0.25方可用，排除NC0.25的值，計算NC平均值。 NC界限范圍：0.6倍NC均值NC1.4倍NC均值。 符合以下條件的實驗成立： 兩個以上的NC可用。 PC1-NC均值 0.4，PC2-NC均值 0.4 Cut off值 = 陰性對照均值 + 0.100 小于Cut off為陰性，大于或等于Cut off為陽性（4）報告：對呈陰性