第五章 電泳分析技術(shù)

1、醫(yī)學(xué)檢驗教研室宜春職業(yè)技術(shù)學(xué)院第五章 電泳分析技術(shù) 一、概述一、概述 1.電泳是指帶電荷的溶質(zhì)或粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。 2.利用電泳現(xiàn)象將多組分物質(zhì)分離、分析的技術(shù)叫做電泳技術(shù) 3.可以實現(xiàn)電泳分離技術(shù)的儀器稱之為電泳儀 目前，電泳技術(shù)已廣泛用于蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核苷酸、無機(jī)離子等成份的分離和鑒定，甚至還用于細(xì)胞與病毒的研究。 臨床常用的電泳分析方法主要有醋酸纖維素薄膜電泳、凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳和毛細(xì)管電泳等。 第一節(jié)第一節(jié) 電泳原理電泳原理第二節(jié)第二節(jié) 常用電泳技術(shù)和電泳方法常用電泳技術(shù)和電泳方法第三節(jié)第三節(jié) 常用電泳設(shè)備的基本結(jié)構(gòu)及技術(shù)指標(biāo)常

2、用電泳設(shè)備的基本結(jié)構(gòu)及技術(shù)指標(biāo)第四節(jié)第四節(jié) 毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式毛細(xì)管電泳的基本結(jié)構(gòu)和分離模式第五節(jié)第五節(jié) 電泳儀的臨床應(yīng)用電泳儀的臨床應(yīng)用第六節(jié)第六節(jié) 電泳技術(shù)的質(zhì)量控制電泳技術(shù)的質(zhì)量控制本章目錄本章目錄第一節(jié) 電泳原理 一、電泳的基本原理 物質(zhì)分子在正常情況下一般不帶電，即所帶正負(fù)電荷量相 等，故不顯示帶電性。但是在一定的物理作用或化學(xué)反應(yīng)條件下，某些物質(zhì)分子會成為帶電的離子，不同的物質(zhì)，由于其帶電性質(zhì)、顆粒形狀和大小不同，因而在一定的電場中它們的移動方向和移 動速度也不同，因此可使它們分離。 若將帶凈電荷Q的粒子放入電場，則該粒子所受到的電荷引力為： F引=E Q （6-1）

3、在溶液中,運動粒子與溶液之間存在阻力F阻 F阻=6rV （6-2） 當(dāng)當(dāng)F引引=F阻阻時時 EQ= 6rV V = EQ/6r （6-3） 由上式可以看出由上式可以看出,粒子的移動速度粒子的移動速度(泳動速泳動速度度V)與電場強(qiáng)度與電場強(qiáng)度(E)和粒子所帶電荷量和粒子所帶電荷量(Q)成正比成正比,而與粒子的半徑而與粒子的半徑(r)及溶液的粘度及溶液的粘度()成反比。成反比。 二、影響電泳的外界因素 （一）電場強(qiáng)度 （二）溶液的pHpH值 （三）溶液的離子強(qiáng)度 （四）電滲作用 （五）粒子的遷移率 （六）吸附作用第二節(jié) 常用電泳技術(shù)和電泳方法一、電泳技術(shù)的分類 （一）根據(jù)工作原理的不同：可分為移界

4、電泳、區(qū)帶電泳、等速電泳、等電聚焦電泳、免疫電泳等。 （二）根據(jù)有無固體支持物可分為：自由電泳和支持物電泳 （三）根據(jù)支持載體的位置或形狀可分成：水平電泳、垂直電泳、板狀電泳、柱狀電泳、U U型管電泳、倒V V字形電泳、毛細(xì)管電泳等。（四）根據(jù)支持物的特點又可分為： 無阻滯支持物電泳。高密度的凝膠電泳。 （五）根據(jù)電源控制的不同，一般可分為以下3 3類： 1. 1. 恒壓電泳; 2. ; 2. 恒流電泳; 3. ; 3. 恒功率電泳 。 （六）根據(jù)自動化程度的不同，可分為半自動和（六）根據(jù)自動化程度的不同，可分為半自動和 全自動型。全自動型。 （七）根據(jù)其功能的不同，可分為制備型、分析（七）根

5、據(jù)其功能的不同，可分為制備型、分析 型、轉(zhuǎn)移型、濃縮型等。型、轉(zhuǎn)移型、濃縮型等。 （八）根據(jù)用法的類型可分為：雙向電泳、交叉（八）根據(jù)用法的類型可分為：雙向電泳、交叉 電泳、連續(xù)紙電泳、電泳層析相結(jié)合技術(shù)等。電泳、連續(xù)紙電泳、電泳層析相結(jié)合技術(shù)等。 （九）根據(jù)不同的使用目的可分為：核酸電泳、（九）根據(jù)不同的使用目的可分為：核酸電泳、 血清蛋白電泳、制備電泳、血清蛋白電泳、制備電泳、DNADNA測序電泳等。測序電泳等。 二、電泳方法簡介 （一）紙電泳 指用濾紙作為支持載體的電泳方法。是最早使用的區(qū)帶電泳。 06-02 平臥式電泳槽裝置示意圖 將濾紙條水平地架設(shè)在兩個裝有緩沖將濾紙條水平地架設(shè)在兩

6、個裝有緩沖溶液的容器之間，樣品點于濾紙中央。當(dāng)溶液的容器之間，樣品點于濾紙中央。當(dāng)濾紙條被緩沖液潤濕后，再蓋上絕緣密封濾紙條被緩沖液潤濕后，再蓋上絕緣密封罩，即可由電泳電源輸入直流電壓罩，即可由電泳電源輸入直流電壓（100V100V1000V1000V）進(jìn)行電泳。）進(jìn)行電泳。 （二）醋酸纖維素薄膜電泳 電泳時經(jīng)過膜的預(yù)處理、加樣、電泳、染色、脫色與透明即可得到滿意的分離效果。此電泳的特點是分離速度快、 電泳時間短、樣品 用量少。因此特別 適合于病理情況下 微量異常蛋白的檢測。 06-03 血清蛋白的電泳圖譜 （三）凝膠電泳 由區(qū)帶電泳中派生出一種用凝膠物質(zhì)作支持物進(jìn)行電泳的方式，被稱為凝膠電泳

7、。普通的凝膠電泳在板上進(jìn)行，以凝膠作為介質(zhì)。電泳中常用的凝膠為葡聚糖、交聯(lián)聚丙烯酰胺和瓊脂糖。 它具有機(jī)械強(qiáng)度好、彈性大、 透明、化學(xué)穩(wěn)定性高、無電滲 作用、設(shè)備簡單、樣品量小 (1(1100g100g）、分辨率高等優(yōu)點。 06-04 凝膠電泳圖凝膠電泳圖（四）等電聚焦電泳 1 等電聚焦電泳過程 一種利用有pH值梯度的介質(zhì)，分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。 06-05 凈電荷與PH的關(guān)系曲線 將等電點不同的蛋白質(zhì)混合物加入有將等電點不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pHpH值梯度值梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一段時間后，的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一段時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應(yīng)的各組分將

8、分別聚焦在各自等電點相應(yīng)的pHpH值值位置上，最后，樣品的各組分在各自的等電位置上，最后，樣品的各組分在各自的等電點聚焦成一條清晰而穩(wěn)定的窄帶。點聚焦成一條清晰而穩(wěn)定的窄帶。 2 2等電聚焦電泳的特點 使用兩性載體電解質(zhì)，在電極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)、線性的pHpH梯度；由于“聚焦效應(yīng)”，即使很小的樣品也能獲得清晰、鮮明的區(qū)帶界面；電泳速度快; ;分辨率高; ;加入樣品的位置可任意選擇；可用于測定蛋白質(zhì)類物質(zhì)的等電點; ;適用于中、大分子量（如蛋白質(zhì)、肽類、同工酶等）生物組分的分離分析。（五）等速電泳 采用兩種不同濃度的電解質(zhì)組成，一種為前導(dǎo)電解質(zhì)，充滿整個毛細(xì)管柱；另一種為尾隨電解質(zhì)，置于一端的

9、電泳槽中。前導(dǎo)電解質(zhì)的遷移率高于任何樣品組分，后者則低于任何樣品組分，被分離的組分按其不同的遷移率夾在中間，在強(qiáng)電場的作用下，各被分離組分在前導(dǎo)電解質(zhì)與尾隨電解 質(zhì)之間的空隙中移動， 實現(xiàn)分離。 06-06 等速電泳示意圖 （六）雙向凝膠電泳（二維電泳） 第一向采用等電聚焦 根據(jù)復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分中各個蛋白質(zhì)的PIPI的不同，將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。 第二向采用了十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGESDS-PAGE）就是按蛋白質(zhì)分子量的大小使其在垂直方向進(jìn)行分離。其結(jié)果不再是條帶狀，而是呈現(xiàn)為斑點狀 。膠性 PH9中電加解入質(zhì)了溶雙液 PH3加上電場后建立穩(wěn)定PH梯度蛋白質(zhì)溶液加入，

10、建立電場染色后，蛋白質(zhì)因PI值不同，沿PH梯度分離開第一向等電聚焦等電聚焦PI逐漸降低等電聚焦膠放在SDS聚丙烯酰胺凝膠上 第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量逐漸降低PI 逐漸降低 06-07 雙向凝膠電泳示意圖雙向凝膠電泳示意圖 (七）免疫電泳 免疫電泳是瓊脂平板電泳和雙相免疫擴(kuò)散兩種方法的結(jié)合。將抗原樣品在瓊脂平板上先進(jìn)行電泳，使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而彼此分開，然后加入抗體做雙相免疫擴(kuò)散，把已分離的各抗原成分與抗體在瓊脂中擴(kuò)散而相遇，在二者比例適當(dāng)?shù)牡胤剑纬扇庋劭梢姷某恋砘?。第三?jié) 常用電泳設(shè)備的基本結(jié)構(gòu)及技術(shù)指標(biāo)一、常用電泳設(shè)備的基本結(jié)構(gòu)（一）電泳電源（二）電泳槽（三）附

11、加裝置 06-08 平臥式電泳槽裝置示意圖平臥式電泳槽裝置示意圖二、電泳儀的主要技術(shù)指標(biāo) 1 輸出電壓 8 連續(xù)工作時間 2 輸出電流 9 保護(hù)措施 3 輸出功率 10 顯示方式 4 電壓穩(wěn)定度 11 定時方式 5 電流穩(wěn)定度 12 電源電壓 6 功率穩(wěn)定度 13 電源頻率 7 輸出組數(shù) 14 功耗 一、毛細(xì)管電泳的相關(guān)概念 1. 1. 電場強(qiáng)度 （Electric Field StrengthElectric Field Strength） 2. 2. 電泳淌度 ( Electrophoretic Mobility) ( Electrophoretic Mobility) 3. 3. 遷移時

12、間 （Migration TimeMigration Time） 4. 4. 電泳速度 ( Electrophoretic Velocity) ( Electrophoretic Velocity) 5. 5. 電滲流 （Electroosmotic FlowElectroosmotic Flow，EOFEOF） 6. 6. 焦耳熱 （Joule HeatingJoule Heating） 二、毛細(xì)管電泳的基本工作原理 溶液中的帶電粒子以高壓電場為驅(qū)動力，沿毛細(xì)管通道，以不同速度向與其所帶電荷相反的電極方向遷移，并依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異 而實現(xiàn)分離。 06-09 毛細(xì)管電泳

13、儀裝置示意圖 三、毛細(xì)管電泳的特點 1. 高靈敏度 2. 高速度 3. 高分辨率 4. 樣品少 5. 自動化程度高 6. 應(yīng)用范圍廣 06-10 英特雷勃英特雷勃 全自動電泳儀全自動電泳儀四、毛細(xì)管電泳的分離模式 （一）毛細(xì)管區(qū)帶電泳 它是通過在充滿電解質(zhì)溶液的毛細(xì)管中，不同質(zhì)荷比大小的組分在電場的作用下，依遷移速度的不同而進(jìn)行分離的。根據(jù)組分的遷移時間 進(jìn)行定性，根據(jù)電泳峰 的峰面積或峰高進(jìn)行定 量分析。 06-11 毛細(xì)血管區(qū)帶電泳原理圖 （二）毛細(xì)管凝膠電泳 將板上的凝膠移到毛細(xì)管中作支持物進(jìn)行的電泳。 凝膠具有多孔性，起類似分子篩的作用，能根據(jù)待測組分的質(zhì)荷比和分子體積的不同而進(jìn)行分離

14、。 適用于分離、測定肽類、蛋白質(zhì)、DNA類物質(zhì)的分離。 （三）毛細(xì)管膠束電動色譜(MECC) 使MECC系統(tǒng)中存在兩個相：流動的水相和起到固定相作用的膠束相。在含有膠束的流動相中，溶質(zhì)在“水相”和“膠束相”(準(zhǔn)固定相)之間進(jìn)行分配，即使是中性溶質(zhì)，因其本身疏水性不同，在二者之間的分 配也會有差異，疏水性強(qiáng)的溶質(zhì)在“膠束相”中停留時間長，遷移速度就慢。反之，親水性強(qiáng)的溶質(zhì)遷移速度就快，最終中性溶質(zhì)將依其疏水性不同而得以分離。 06-12毛細(xì)管膠束電動色譜原理圖毛細(xì)管膠束電動色譜原理圖（四）毛細(xì)管等電聚焦電泳 不同等電點的分子分別聚集在不同的位置上，不作遷移而彼此分離，這就是等電聚焦分離過程。毛細(xì)

15、管的等電聚焦是在毛細(xì)管內(nèi)實現(xiàn)的等電聚焦過程，具有極高的分辨率，通?？梢苑蛛x等電點差異小于 0.01pH單位的兩種蛋白質(zhì)，例如肽類、蛋白質(zhì)的分離。（五）毛細(xì)管等速電泳 毛細(xì)管內(nèi)首先導(dǎo)入具有比被分離各組分高電泳淌度的前導(dǎo)電解質(zhì)，然后進(jìn)樣，隨后再導(dǎo)入比各分離組份低電泳淌度的尾隨電解質(zhì)，在強(qiáng)電場的作用下，各被分離組分在前導(dǎo)電解質(zhì)與尾隨電解質(zhì)之間的空隙中發(fā)生分離。 （六）毛細(xì)管電色譜 它包含了電泳和色譜兩種機(jī)制，是在毛細(xì)管中填充 或在毛細(xì)管壁 上鍵合（或涂壁）固 定相，從而構(gòu)成毛細(xì) 管色譜柱，依靠電滲 流推動流動相，攜帶 樣品遷移，根據(jù)樣品 分子的質(zhì)荷比、分子 尺寸及分配系數(shù)的差 別而分離。 06-13

16、 CEC-加壓毛細(xì)管電色譜加壓毛細(xì)管電色譜儀儀五、毛細(xì)管電泳儀的基本結(jié)構(gòu) 毛細(xì)管電泳儀的結(jié)構(gòu)并不復(fù)雜，主要有高壓源、毛細(xì)管柱、檢測器，以及兩 個供毛細(xì)管兩端插入而又可 和電源相連的緩沖液槽。 （一）毛細(xì)管柱 （二）檢測器 （三）毛細(xì)管電泳 法的進(jìn)樣技術(shù) 06-14毛細(xì)管電泳儀毛細(xì)管電泳儀 六、常用各種電泳儀簡介 （一）穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀是中壓電泳儀。其輸出電壓的調(diào)節(jié)范圍為0V0V600V600V、輸出電流為0mA0mA100mA100mA。該機(jī)工作穩(wěn)定性好、調(diào)節(jié)范圍寬，并設(shè)有完善的短路保護(hù)電路和過流保護(hù)電路，是目前國內(nèi)中、低壓電泳實驗中應(yīng)用最廣泛的電泳儀之一。 06-15 穩(wěn)壓穩(wěn)流

17、電泳儀穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（二）全自動醋纖膜電泳儀 全自動醋纖膜電泳儀為全自動電泳儀，有可見光單系統(tǒng)，使用醋酸纖維薄膜電泳片，優(yōu)點為自動化程度高。只需將樣品、試劑、電泳片放好，人員可離機(jī)完成實驗并得到結(jié)果。 （三）全自動熒光/可見光雙系統(tǒng)電泳儀 全自動熒光/可見光雙系統(tǒng)電泳儀為全自動電泳儀，具有熒光/可見光雙系統(tǒng)，在使用熒光試劑項目如CK、LD同工酶時為全自動。只需將樣品、試劑、瓊脂糖凝膠電泳膠片放好后，操作人員可離機(jī)完成實驗并得到結(jié)果。 （四）全自動瓊脂糖電泳儀 全自動電泳儀，有可見光單系統(tǒng)，使用瓊脂糖凝膠電泳膠片，優(yōu)點為靈敏度高，可適用于低濃度蛋白檢驗 。該儀器自動化程度較差，當(dāng)電泳結(jié)束和染色脫

18、色完成后，工作人員必須將電泳片由機(jī)器中取出。 （五）雙向電泳及雙向電泳- -液相色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用 雙向電泳是將樣品進(jìn)行電泳后，在它的直角方向再進(jìn)行一次電泳。雙向電泳第一向為等電聚焦，第二向為梯度SDSSDS電泳。樣品經(jīng)過電荷與質(zhì)量兩次分離后可得到分子的等電點、分子量等信息。這是目前所有電泳技術(shù)中分辨率最高，信息量最多的技術(shù)，已成為分析復(fù)雜蛋白混合物的基本工具。 （六）高效毛細(xì)管電泳及高效毛細(xì)管電泳- -質(zhì)譜聯(lián)用 高效毛細(xì)管電泳是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為推動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。高效毛細(xì)管電泳是一種迅速發(fā)展的分離技術(shù)，儀

19、器簡單、操作簡便、分析速度快、分離效率高、操作模式多、開發(fā)分析方法容易、實驗成本低、消耗少、應(yīng)用范圍極廣。 （七）毛細(xì)管電泳芯片 利用毛細(xì)管電泳芯片可以進(jìn)行DNA長度分析、序列分析和基因分型等研究。是利用芯片分離熒光標(biāo)記的寡核苷酸，整個分離過程在45s之內(nèi)，而芯片的長度僅為3.8cm。因為其可承載高電壓（2300V/cm）并具有較小的樣品體積，故有利于得到較好的分離效果。 （八）DNA測序系統(tǒng) 該系統(tǒng)利用凝膠毛細(xì)管的原理，將多道毛細(xì)管陣列設(shè)計，用四種不同的熒光染色標(biāo)記4 4種核苷酸，在模板上合成DNADNA單鏈，然后在DNADNA外切酶的作用下進(jìn)行堿基的連續(xù)水解和釋放，用激光識別和記錄釋放的堿基。 06-16 DNA測序系統(tǒng)測序系統(tǒng)第五節(jié) 電泳儀的臨床應(yīng)用 一、 血清蛋白電泳 新鮮血清經(jīng)醋酸纖維薄膜或瓊脂糖電泳、染色后，通?？梢? 5條帶，即清蛋白、 1 1、 2 2、 和 球蛋白。許多疾病總血清蛋白濃度和各蛋白組分的比例有所改變，通過血清蛋白電泳圖譜能幫助我們對某些疾病進(jìn)行診斷及鑒別診斷。 06-17 血清蛋白電泳圖譜血清蛋白電泳圖譜二、尿蛋白電泳 臨床進(jìn)行尿蛋白電泳的主要目的是：確定尿蛋白的來源；了解腎臟病變的嚴(yán)重程度（選擇性蛋白尿與非選