化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)

1、人類基因組計(jì)劃的順利實(shí)施，使生命科學(xué)研究的重心逐漸轉(zhuǎn)移到對生物人類基因組計(jì)劃的順利實(shí)施，使生命科學(xué)研究的重心逐漸轉(zhuǎn)移到對生物功能的整體研究上。對生物功能的主要體現(xiàn)者或執(zhí)行者功能的整體研究上。對生物功能的主要體現(xiàn)者或執(zhí)行者-蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和功能模式的研究必然成為生命科學(xué)發(fā)展的趨勢。模式和功能模式的研究必然成為生命科學(xué)發(fā)展的趨勢。 在在2020世紀(jì)世紀(jì)9090年代中期，國際上萌發(fā)了一門研究年代中期，國際上萌發(fā)了一門研究細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律的新興細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律的新興學(xué)科學(xué)科-蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)(proteomics)。 蛋白質(zhì)

2、組蛋白質(zhì)組(proteome)(proteome)這一概念是這一概念是19951995年由澳大年由澳大利亞學(xué)者最先提出來的，源于蛋白質(zhì)利亞學(xué)者最先提出來的，源于蛋白質(zhì)（proteinprotein）與）與 基因組（基因組（genomegenome）兩個(gè)詞的雜）兩個(gè)詞的雜合，指的在一個(gè)特定的時(shí)間和空間內(nèi)，一個(gè)基合，指的在一個(gè)特定的時(shí)間和空間內(nèi)，一個(gè)基因組因組 一種細(xì)胞組織或一種生物體所表達(dá)的全一種細(xì)胞組織或一種生物體所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。部蛋白質(zhì)。 對蛋白質(zhì)組問題的研究稱之為蛋白質(zhì)組學(xué)對蛋白質(zhì)組問題的研究稱之為蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)(proteomics)，主要是在整體水平上研究細(xì)胞，

3、主要是在整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律。內(nèi)蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律。 而化學(xué)在這里再一次與生物學(xué)的最新發(fā)展融合，形成新的而化學(xué)在這里再一次與生物學(xué)的最新發(fā)展融合，形成新的交叉研究領(lǐng)域交叉研究領(lǐng)域- -化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)(chemical proteomics)(chemical proteomics)。化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)是一個(gè)目前仍在不斷擴(kuò)展中的全新領(lǐng)域，化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)是一個(gè)目前仍在不斷擴(kuò)展中的全新領(lǐng)域，學(xué)術(shù)界至今對其尚未有確切定義。一定程度上，化學(xué)蛋白學(xué)術(shù)界至今對其尚未有確切定義。一定程度上，化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)可以理解為質(zhì)組學(xué)可以理解為“化學(xué)加蛋白質(zhì)組學(xué)化學(xué)加蛋白質(zhì)組學(xué)”。

4、具體地說，由于大多數(shù)蛋白質(zhì)的功能直接依賴于小分子配具體地說，由于大多數(shù)蛋白質(zhì)的功能直接依賴于小分子配體與靶蛋白的結(jié)合步驟，因此，利用能夠與靶蛋白質(zhì)特異體與靶蛋白的結(jié)合步驟，因此，利用能夠與靶蛋白質(zhì)特異作用的化學(xué)小分子來擾動和探測蛋白質(zhì)組，有可能在蛋白作用的化學(xué)小分子來擾動和探測蛋白質(zhì)組，有可能在蛋白質(zhì)組的整體水平上，揭示感興趣的特定蛋白質(zhì)的功能以及質(zhì)組的整體水平上，揭示感興趣的特定蛋白質(zhì)的功能以及它們與化學(xué)小分子的相互作用它們與化學(xué)小分子的相互作用 化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)利用化學(xué)小分子直接從功能角度切入蛋白化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)利用化學(xué)小分子直接從功能角度切入蛋白質(zhì)組的研究，有別于以往的主要以蛋白質(zhì)定性定量鑒

5、定為質(zhì)組的研究，有別于以往的主要以蛋白質(zhì)定性定量鑒定為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，因此，被認(rèn)為是很有前途的新一基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，因此，被認(rèn)為是很有前途的新一代功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)代功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(function-based proteomics)(function-based proteomics)。一，化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法一，化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法 蛋白質(zhì)組學(xué)從整體上對體系內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，蛋白質(zhì)組學(xué)從整體上對體系內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，常見常見3 3種研究模式：種研究模式： 第第1 1種是檢測蛋白質(zhì)組理化參數(shù)的種是檢測蛋白質(zhì)組理化參數(shù)的“完全蛋白完全蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)組學(xué)”； 第第2 2種是差

6、異蛋白質(zhì)組學(xué)，主要通過比較分析種是差異蛋白質(zhì)組學(xué)，主要通過比較分析不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，實(shí)現(xiàn)對體系內(nèi)代不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，實(shí)現(xiàn)對體系內(nèi)代謝調(diào)控的動態(tài)監(jiān)測，從而更易于揭示機(jī)體對內(nèi)謝調(diào)控的動態(tài)監(jiān)測，從而更易于揭示機(jī)體對內(nèi)外界環(huán)境變化產(chǎn)生反應(yīng)的本質(zhì)規(guī)律；外界環(huán)境變化產(chǎn)生反應(yīng)的本質(zhì)規(guī)律； 第第3 3種主要是蛋白質(zhì)功能模式的研究，包括蛋種主要是蛋白質(zhì)功能模式的研究，包括蛋白質(zhì)的功能及蛋白質(zhì)間的相互作用。白質(zhì)的功能及蛋白質(zhì)間的相互作用。 化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的主要任務(wù)在于，發(fā)展和應(yīng)用具化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的主要任務(wù)在于，發(fā)展和應(yīng)用具有生物活性的靶向探針，用于復(fù)雜的蛋白質(zhì)組中有生物活性的靶向探針，用于復(fù)雜的蛋

7、白質(zhì)組中的特異性酶或蛋白質(zhì)家族的功能研究。小分子與的特異性酶或蛋白質(zhì)家族的功能研究。小分子與細(xì)胞內(nèi)靶蛋白質(zhì)的相互作用，是很多蛋白質(zhì)生物細(xì)胞內(nèi)靶蛋白質(zhì)的相互作用，是很多蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。這種相互作用強(qiáng)弱不一，既可以是功能的基礎(chǔ)。這種相互作用強(qiáng)弱不一，既可以是可逆的，也可以是不可逆的；可以是單靶點(diǎn)的，可逆的，也可以是不可逆的；可以是單靶點(diǎn)的，也可以是同時(shí)作用于多個(gè)靶蛋白的。也可以是同時(shí)作用于多個(gè)靶蛋白的。 生物體生物體( (細(xì)胞細(xì)胞 組織等組織等) )蛋白質(zhì)組的所有蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白質(zhì)組的所有蛋白質(zhì)經(jīng)化學(xué)小分子處理前后的差異蛋白質(zhì)組展示化學(xué)小分子處理前后的差異蛋白質(zhì)組展示(proteome prof

8、iling)(proteome profiling)，可以用來研究這種相互，可以用來研究這種相互作用。對化學(xué)學(xué)科而言，通過功能蛋白質(zhì)組學(xué)的作用。對化學(xué)學(xué)科而言，通過功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究服務(wù)于人類的健康，促進(jìn)分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展，研究服務(wù)于人類的健康，促進(jìn)分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展，如尋找先導(dǎo)藥物以及藥物的靶分子是其重要的目如尋找先導(dǎo)藥物以及藥物的靶分子是其重要的目標(biāo)。標(biāo)。（一）蛋白質(zhì)組學(xué)的基本技術(shù)流程（一）蛋白質(zhì)組學(xué)的基本技術(shù)流程 目前，蛋白質(zhì)組目前，蛋白質(zhì)組學(xué)研究通常有三學(xué)研究通常有三個(gè)步驟：第一，個(gè)步驟：第一，運(yùn)用雙向電泳技運(yùn)用雙向電泳技術(shù)分離樣品中的術(shù)分離樣品中的蛋白質(zhì)；第二，蛋白質(zhì)；第二，應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)鑒

9、應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)鑒定通過雙向電泳定通過雙向電泳分離出來的蛋白分離出來的蛋白質(zhì)；第三，應(yīng)用質(zhì)；第三，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)生物信息學(xué)技術(shù)存儲、處理、比存儲、處理、比較獲得的數(shù)據(jù)。較獲得的數(shù)據(jù)。1，雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳，雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳 19751975年年O Ofarrellfarrell和和KloseKlose首先在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別建立了首先在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別建立了雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(two dimensional (two dimensional polyacrylamide gel electrophoresispolyacrylamide gel elect

10、rophoresis，2-DE2-DE電泳電泳) )，其基本原理是利用不同蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)其基本原理是利用不同蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)(pI)(pI)和不和不同分子量大小的特點(diǎn)將它們分離。同分子量大小的特點(diǎn)將它們分離。 他們將高分辨率的等電聚集電泳他們將高分辨率的等電聚集電泳(isoelectrofocusing，IEF)和和SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)聯(lián)合組成雙聯(lián)合組成雙向電泳，第一向?yàn)橄螂娪?，第一向?yàn)镮EFIEF，采用經(jīng)典的兩性電解質(zhì)載體在，采用經(jīng)典的兩性電解質(zhì)載體在電流作用下形成電流作用下形成pHpH梯度，依據(jù)梯度，依據(jù)pIpI

11、的不同進(jìn)行分離；第二的不同進(jìn)行分離；第二向利用向利用SDS-PAGESDS-PAGE根據(jù)分子量大小進(jìn)行分離。根據(jù)分子量大小進(jìn)行分離。 2 2，基質(zhì)輔助激光解吸電離，基質(zhì)輔助激光解吸電離- -飛行飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)時(shí)間質(zhì)譜技術(shù) 基質(zhì)輔助激光解吸電離基質(zhì)輔助激光解吸電離- -飛行時(shí)間質(zhì)譜測量法以飛行時(shí)間質(zhì)譜測量法以多肽質(zhì)量多肽質(zhì)量/ /電荷比為依據(jù)同數(shù)據(jù)庫資料進(jìn)行比較電荷比為依據(jù)同數(shù)據(jù)庫資料進(jìn)行比較, ,進(jìn)而對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。此法通常被稱為肽質(zhì)量進(jìn)而對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。此法通常被稱為肽質(zhì)量指紋法。指紋法。3 3，色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 將色譜技術(shù)與新型質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合將色譜技術(shù)與新型質(zhì)譜

12、技術(shù)相結(jié)合, ,可有效地克服雙向可有效地克服雙向凝膠電泳凝膠電泳/ /質(zhì)譜的不足質(zhì)譜的不足, ,確保了分析的準(zhǔn)確性。確保了分析的準(zhǔn)確性。 首先對蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行酶切得到混合肽段首先對蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行酶切得到混合肽段, ,然后通過然后通過強(qiáng)離子交換反相色譜柱進(jìn)行多次分離強(qiáng)離子交換反相色譜柱進(jìn)行多次分離, ,并連用液相色譜并連用液相色譜- -串聯(lián)質(zhì)譜分析肽段串聯(lián)質(zhì)譜分析肽段, ,而且通過核素標(biāo)記肽段的技術(shù)實(shí)現(xiàn)而且通過核素標(biāo)記肽段的技術(shù)實(shí)現(xiàn)蛋白定量分析。分離后的產(chǎn)品離子得到完好地掃描蛋白定量分析。分離后的產(chǎn)品離子得到完好地掃描, ,連連用分析肽段用分析肽段, ,可以區(qū)分待測蛋白質(zhì)和其他類似物?？梢詤^(qū)

13、分待測蛋白質(zhì)和其他類似物。4 4，信息查詢，信息查詢 生物信息學(xué)生物信息學(xué)(Bioinformatics)(Bioinformatics)是生物與計(jì)算機(jī)是生物與計(jì)算機(jī)以及應(yīng)用數(shù)學(xué)相互結(jié)合而形成的一門新興學(xué)科。以及應(yīng)用數(shù)學(xué)相互結(jié)合而形成的一門新興學(xué)科。它通過對生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲、它通過對生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲、檢索與分析檢索與分析, ,達(dá)到解釋數(shù)據(jù)所蘊(yùn)含的生物學(xué)意達(dá)到解釋數(shù)據(jù)所蘊(yùn)含的生物學(xué)意義的目的。義的目的。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究任一物種的基因組編碼的全套蛋白質(zhì)組學(xué)研究任一物種的基因組編碼的全套蛋白質(zhì)蛋白質(zhì), ,它通常是高通量的它通常是高通量的, ,在進(jìn)行蛋白質(zhì)功能在進(jìn)行蛋白

14、質(zhì)功能預(yù)測和結(jié)構(gòu)分析時(shí)預(yù)測和結(jié)構(gòu)分析時(shí), ,生物信息學(xué)就成為蛋白質(zhì)生物信息學(xué)就成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)之一。組學(xué)研究的核心技術(shù)之一。 常用幾種軟件進(jìn)行分析。常用幾種軟件進(jìn)行分析。 PeptIdentPeptIdent是以肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)鑒定蛋白質(zhì)的查詢軟是以肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)鑒定蛋白質(zhì)的查詢軟件件, ,是將數(shù)據(jù)庫中的所有蛋白質(zhì)用我們選定的酶進(jìn)行是將數(shù)據(jù)庫中的所有蛋白質(zhì)用我們選定的酶進(jìn)行“理論消化理論消化”形成肽片段形成肽片段, ,計(jì)算其理論肽段質(zhì)量計(jì)算其理論肽段質(zhì)量, ,建立建立索引索引, ,然后再與輸入的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比然后再與輸入的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比, ,按實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匹配數(shù)的多少排

15、列并輸出匹配結(jié)果。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、匹配數(shù)的多少排列并輸出匹配結(jié)果。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量和種屬可以詳細(xì)限制候選蛋白分子量和種屬可以詳細(xì)限制候選蛋白, ,減少假陽性誤差。減少假陽性誤差。 MS-FitMS-Fit和和MascotMascot軟件利用了軟件利用了MOWSEMOWSE得分法得分法, ,特別考慮數(shù)特別考慮數(shù)據(jù)庫中肽段分布頻率的問題。據(jù)庫中肽段分布頻率的問題。MascotMascot軟件還把軟件還把MOWSEMOWSE得得分轉(zhuǎn)換為絕對概率分轉(zhuǎn)換為絕對概率, ,減少結(jié)果的不確定性。減少結(jié)果的不確定性。 蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)網(wǎng)站蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)網(wǎng)站 teomeworks.b

16、io- 蛋白質(zhì)組研究技蛋白質(zhì)組研究技術(shù)、信息等。術(shù)、信息等。 http:/ 從新藥開發(fā)角度，發(fā)現(xiàn)從新藥開發(fā)角度，發(fā)現(xiàn)新蛋白及新作用。新蛋白及新作用。 可以找到蛋白質(zhì)組可以找到蛋白質(zhì)組研究相關(guān)企業(yè)、各研究相關(guān)企業(yè)、各 種儀器來源、新聞等。種儀器來源、新聞等。teome.co.uk 各種蛋白質(zhì)組研究相關(guān)信息各種蛋白質(zhì)組研究相關(guān)信息 http:/www.micromass.co.uk 介紹蛋白質(zhì)鑒定的先進(jìn)儀器介紹蛋白質(zhì)鑒定的先進(jìn)儀器 http:/www.expasy.ch 蛋白質(zhì)鑒定專家系統(tǒng)，蛋白質(zhì)鑒定專家系

17、統(tǒng)，Swiss Institute of Bioinformatics .au 蛋白質(zhì)鑒定專家系統(tǒng)，蛋白質(zhì)鑒定專家系統(tǒng)，Australian Proteome Analysis Facilityhttp:/expasy.cbr.nrc.ca 蛋白質(zhì)鑒定專家系統(tǒng)，蛋白質(zhì)鑒定專家系統(tǒng)，Canadian Bioinformatics Resours二、功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)二、功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù) 功能蛋白質(zhì)組學(xué)主要是研究蛋白質(zhì)功能、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)功能蛋白質(zhì)組學(xué)主要是研究蛋白質(zhì)功能、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)小分子相互作用，其方法主要有蛋白相互作用、蛋白質(zhì)

18、小分子相互作用，其方法主要有蛋白質(zhì)陣列技術(shù)質(zhì)陣列技術(shù)(protein arrays)(protein arrays)、噬菌體展示技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)(phage (phage display)display)、基因芯片技術(shù)、基因芯片技術(shù)(cDNA micr-oarray)(cDNA micr-oarray)、酵母雙雜、酵母雙雜交技術(shù)等。交技術(shù)等。 而通過篩選小分子配體來描述新蛋白的功能，是化學(xué)蛋白而通過篩選小分子配體來描述新蛋白的功能，是化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究內(nèi)容，化學(xué)蛋白質(zhì)組篩選也將提供新藥質(zhì)組學(xué)的主要研究內(nèi)容，化學(xué)蛋白質(zhì)組篩選也將提供新藥開發(fā)的先導(dǎo)化合物。共價(jià)結(jié)合于目標(biāo)蛋白質(zhì)、便于純化和

19、開發(fā)的先導(dǎo)化合物。共價(jià)結(jié)合于目標(biāo)蛋白質(zhì)、便于純化和鑒定的化學(xué)探針，無疑是該領(lǐng)域最為重要的工具?？衫描b定的化學(xué)探針，無疑是該領(lǐng)域最為重要的工具?？衫没瘜W(xué)探針在純化的蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解物、活細(xì)胞和活動物化學(xué)探針在純化的蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解物、活細(xì)胞和活動物等不同水平，評價(jià)藥物作用強(qiáng)度和選擇性。一方面，可鑒等不同水平，評價(jià)藥物作用強(qiáng)度和選擇性。一方面，可鑒別與不同疾病相關(guān)的新型藥物靶點(diǎn)；另一方面可用于藥物別與不同疾病相關(guān)的新型藥物靶點(diǎn)；另一方面可用于藥物先導(dǎo)化合物的快速鑒定，從而加快候選化合物應(yīng)用于臨床先導(dǎo)化合物的快速鑒定，從而加快候選化合物應(yīng)用于臨床的進(jìn)程。其中基于靶酶活性的特異化學(xué)小分子探針的進(jìn)程

20、。其中基于靶酶活性的特異化學(xué)小分子探針(activity-based probes(activity-based probes，ABPs)ABPs)是一種新的化學(xué)蛋白質(zhì)組是一種新的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)。學(xué)研究技術(shù)。 activity-based probesactivity-based probes，ABPsABPs 該技術(shù)的原理是：合成同時(shí)帶有反應(yīng)基團(tuán)和標(biāo)簽基團(tuán)的該技術(shù)的原理是：合成同時(shí)帶有反應(yīng)基團(tuán)和標(biāo)簽基團(tuán)的ABPsABPs試劑與待研究的蛋白質(zhì)組作用試劑與待研究的蛋白質(zhì)組作用(ABPs(ABPs中的反應(yīng)基團(tuán)中的反應(yīng)基團(tuán)能夠特異性共價(jià)修飾蛋白質(zhì)組中的某類酶蛋白而將化學(xué)能夠特異性共價(jià)修飾蛋白

21、質(zhì)組中的某類酶蛋白而將化學(xué)小分子小分子“掛掛”到感興趣的靶酶上，然后，利用到感興趣的靶酶上，然后，利用ABPsABPs中的中的熒光或生物素標(biāo)簽基團(tuán)又可將這些靶酶一個(gè)個(gè)地從蛋白熒光或生物素標(biāo)簽基團(tuán)又可將這些靶酶一個(gè)個(gè)地從蛋白質(zhì)組中質(zhì)組中“釣釣”出來出來) )。由于。由于ABPsABPs是針對待研究靶酶的活是針對待研究靶酶的活性而定向設(shè)計(jì)的化學(xué)小分子，因而能夠直接檢測蛋白質(zhì)性而定向設(shè)計(jì)的化學(xué)小分子，因而能夠直接檢測蛋白質(zhì)組中感興趣的靶酶的活性。組中感興趣的靶酶的活性。 ABP ABP 的分子量通常在的分子量通常在 700-1000 D700-1000 D，這主要是由于報(bào)告，這主要是由于報(bào)告基團(tuán)基團(tuán)

22、( (熒光基團(tuán)或生物素?zé)晒饣鶊F(tuán)或生物素) )造成的，這些報(bào)告基團(tuán)還可能造成的，這些報(bào)告基團(tuán)還可能改變活性分子在體內(nèi)的性質(zhì)及其與靶蛋白的作用模式，改變活性分子在體內(nèi)的性質(zhì)及其與靶蛋白的作用模式，并因此限制了并因此限制了ABPABP分子在體內(nèi)細(xì)胞的吸收與分布。分子在體內(nèi)細(xì)胞的吸收與分布。ABPP ABPP 實(shí)驗(yàn)一般都是在體外進(jìn)行的，如細(xì)胞或組織勻漿液，這實(shí)驗(yàn)一般都是在體外進(jìn)行的，如細(xì)胞或組織勻漿液，這種實(shí)驗(yàn)方式可能會改變細(xì)胞或組織內(nèi)活性酶或非活性酶種實(shí)驗(yàn)方式可能會改變細(xì)胞或組織內(nèi)活性酶或非活性酶的濃度及它們各自的亞細(xì)胞分布。因此，體外的功能蛋的濃度及它們各自的亞細(xì)胞分布。因此，體外的功能蛋白質(zhì)組學(xué)

23、研究只能大致地揭示活細(xì)胞或動物體內(nèi)組織中白質(zhì)組學(xué)研究只能大致地揭示活細(xì)胞或動物體內(nèi)組織中蛋白質(zhì)的功能狀態(tài)。蛋白質(zhì)的功能狀態(tài)。1 1，不可逆探針，不可逆探針 就其主要基礎(chǔ)性結(jié)構(gòu)而言，不可逆的化學(xué)探針具有三種特就其主要基礎(chǔ)性結(jié)構(gòu)而言，不可逆的化學(xué)探針具有三種特異的功能部位：與酶共價(jià)交聯(lián)的反應(yīng)基團(tuán)，調(diào)節(jié)反應(yīng)基團(tuán)異的功能部位：與酶共價(jià)交聯(lián)的反應(yīng)基團(tuán)，調(diào)節(jié)反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)特異性的鏈接區(qū)和一個(gè)便于鑒別和純化目標(biāo)酶的標(biāo)記反應(yīng)特異性的鏈接區(qū)和一個(gè)便于鑒別和純化目標(biāo)酶的標(biāo)記物。物。 （1 1）反應(yīng)基團(tuán)）反應(yīng)基團(tuán) 反應(yīng)基團(tuán)為靶蛋白質(zhì)提供必要的共價(jià)修飾，其選擇性的高反應(yīng)基團(tuán)為靶蛋白質(zhì)提供必要的共價(jià)修飾，其選擇性的高低是

24、化學(xué)探針設(shè)計(jì)過程中的最大的挑戰(zhàn)低是化學(xué)探針設(shè)計(jì)過程中的最大的挑戰(zhàn) 其難度在于功能其難度在于功能基團(tuán)的二元性，一方面具有特定蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的反基團(tuán)的二元性，一方面具有特定蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的反應(yīng)性，另一方面不識別細(xì)胞或細(xì)胞抽提物的其他活性片段。應(yīng)性，另一方面不識別細(xì)胞或細(xì)胞抽提物的其他活性片段。 （2 2）鏈接區(qū)）鏈接區(qū) 通常采用長鏈烷或聚乙二醇作為化學(xué)探針的鏈接區(qū)，連接通常采用長鏈烷或聚乙二醇作為化學(xué)探針的鏈接區(qū)，連接反應(yīng)基團(tuán)和標(biāo)記物。主要在反應(yīng)基團(tuán)和標(biāo)記物之間提供足反應(yīng)基團(tuán)和標(biāo)記物。主要在反應(yīng)基團(tuán)和標(biāo)記物之間提供足夠的空間以阻止空間障礙的形成，便于反應(yīng)基團(tuán)與酶的結(jié)夠的空間以阻止空間障礙的

25、形成，便于反應(yīng)基團(tuán)與酶的結(jié)合以及對結(jié)合物的純化。烷基鏈可調(diào)節(jié)探針的疏水性，使合以及對結(jié)合物的純化。烷基鏈可調(diào)節(jié)探針的疏水性，使其便于進(jìn)入活細(xì)胞和組織；而聚乙二醇鏈可提高疏水探針其便于進(jìn)入活細(xì)胞和組織；而聚乙二醇鏈可提高疏水探針的溶解性，便于進(jìn)入水溶液。的溶解性，便于進(jìn)入水溶液。（3 3）標(biāo)記物）標(biāo)記物 一般選用生物一般選用生物素、熒光物質(zhì)素、熒光物質(zhì)和放射性物質(zhì)和放射性物質(zhì)作為化學(xué)探針作為化學(xué)探針的標(biāo)記物，可的標(biāo)記物，可快速鑒別和純快速鑒別和純化探針?biāo)揎椈结標(biāo)揎椀牡鞍踪|(zhì)。蛋的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)凝膠電泳白質(zhì)凝膠電泳是最簡單有效是最簡單有效的蛋白質(zhì)分離的蛋白質(zhì)分離方法，因此用方法，因此用于標(biāo)記探

26、針的于標(biāo)記探針的物質(zhì)應(yīng)兼容于物質(zhì)應(yīng)兼容于SDS-PAGESDS-PAGE法。法。目前目前, ,該方法已成功地分別用于針對絲氨酸蛋白酶，巰基蛋白酶，去泛該方法已成功地分別用于針對絲氨酸蛋白酶，巰基蛋白酶，去泛蛋白化酶等靶酶的功能蛋白質(zhì)組研究蛋白化酶等靶酶的功能蛋白質(zhì)組研究, ,并從中發(fā)現(xiàn)了一些化學(xué)小分子體并從中發(fā)現(xiàn)了一些化學(xué)小分子體內(nèi)作用的疾病相關(guān)新靶點(diǎn)。內(nèi)作用的疾病相關(guān)新靶點(diǎn)。2 2，可逆探針，可逆探針由于不可逆探針的設(shè)計(jì)受到對蛋白質(zhì)（酶）活性中心結(jié)構(gòu)信息、小由于不可逆探針的設(shè)計(jì)受到對蛋白質(zhì)（酶）活性中心結(jié)構(gòu)信息、小分子化合物對酶抑制部位信息等缺乏的局限性，人們希望直接用可分子化合物對酶抑制部

27、位信息等缺乏的局限性，人們希望直接用可逆抑制劑作為化學(xué)探針，這種方法有望擴(kuò)展于針對所有靶蛋白質(zhì)的逆抑制劑作為化學(xué)探針，這種方法有望擴(kuò)展于針對所有靶蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)組研究，并可用于新藥篩選。功能蛋白質(zhì)組研究，并可用于新藥篩選。 3 3，無標(biāo)記探針，無標(biāo)記探針ABPPABPP實(shí)驗(yàn)一直是在細(xì)胞或組織勻漿液中進(jìn)行的，一個(gè)主要的原因?qū)嶒?yàn)一直是在細(xì)胞或組織勻漿液中進(jìn)行的，一個(gè)主要的原因是報(bào)告基團(tuán)體積很大是報(bào)告基團(tuán)體積很大( (分子量通常在分子量通常在700700一一10o0Da)10o0Da)，限制了探針分，限制了探針分子的吸收、分布，甚至可能改變探針分子的作用模式子的吸收、分布，甚至可能改變探針分子的

28、作用模式) )。近年來，近年來， ABPP ABPP 實(shí)驗(yàn)引入了實(shí)驗(yàn)引入了click-chemistryclick-chemistry，發(fā)展了沒有標(biāo)簽，發(fā)展了沒有標(biāo)簽(tag-free)(tag-free)的探針分子，報(bào)告基團(tuán)的探針分子，報(bào)告基團(tuán)( (熒光素或生物素?zé)晒馑鼗蛏锼? )是在探針分是在探針分子共價(jià)標(biāo)記了靶蛋白后，通過子共價(jià)標(biāo)記了靶蛋白后，通過 Huisgen 1,3- Huisgen 1,3- 偶極環(huán)加成反應(yīng)偶極環(huán)加成反應(yīng)( (炔炔基與疊氮基反應(yīng)形成穩(wěn)定的三氮唑結(jié)構(gòu)基與疊氮基反應(yīng)形成穩(wěn)定的三氮唑結(jié)構(gòu)) )連接到探針分子上。連接到探針分子上。Sharpless Sharpless

29、等發(fā)現(xiàn)在等發(fā)現(xiàn)在 Cu(I)Cu(I)催化下炔基與疊氮基可以在溫和的條催化下炔基與疊氮基可以在溫和的條件下高產(chǎn)率得到三氮唑，這一發(fā)現(xiàn)使得件下高產(chǎn)率得到三氮唑，這一發(fā)現(xiàn)使得click-chemistryclick-chemistry可以有效可以有效地運(yùn)用到功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。地運(yùn)用到功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。 無標(biāo)記探針分子的設(shè)計(jì)需要運(yùn)用光親和標(biāo)記技術(shù)，引入光親合標(biāo)記基無標(biāo)記探針分子的設(shè)計(jì)需要運(yùn)用光親和標(biāo)記技術(shù)，引入光親合標(biāo)記基團(tuán)團(tuán)(photoaffinity labeling group)(photoaffinity labeling group)，其作用是在探針分子與靶蛋，其作用是在探針分子與

30、靶蛋白結(jié)合白結(jié)合( (可逆可逆) )后，通過光解作用在探針分子與靶蛋白之間引入共價(jià)鍵。后，通過光解作用在探針分子與靶蛋白之間引入共價(jià)鍵。通常這類探針分子包括活性部位通常這類探針分子包括活性部位(activity unit)(activity unit)、光親合標(biāo)記基團(tuán)、光親合標(biāo)記基團(tuán)、連接部位及報(bào)告基團(tuán)。連接部位及報(bào)告基團(tuán)。 光親和標(biāo)記探針分子的光親和基團(tuán)有：苯基疊氮類光親和標(biāo)記探針分子的光親和基團(tuán)有：苯基疊氮類 (phenyl azides)(phenyl azides)、trifluoro methylphenyl diazirinetrifluoro methylphenyl diazi

31、rine、二苯甲酮類二苯甲酮類(benzophenone)(benzophenone)等。通常理想的光親和基團(tuán)應(yīng)等。通常理想的光親和基團(tuán)應(yīng)具備以下幾個(gè)特征具備以下幾個(gè)特征: (1) : (1) 具有一定的化學(xué)穩(wěn)定性，能耐受具有一定的化學(xué)穩(wěn)定性，能耐受普通的化學(xué)反應(yīng)；普通的化學(xué)反應(yīng)；(2) (2) 在自然光中合理的穩(wěn)定性；在自然光中合理的穩(wěn)定性；(3) (3) 在在黑暗中穩(wěn)定，在不對生物樣品造成損傷黑暗中穩(wěn)定，在不對生物樣品造成損傷(300 nm)(300 nm)的紫外光的紫外光照下很容易光解；照下很容易光解；(4) (4) 光解后的活性中間體既能與親核的光解后的活性中間體既能與親核的X-H(X

32、=N,S,O)X-H(X=N,S,O)官能團(tuán)反應(yīng)，也能與官能團(tuán)反應(yīng)，也能與C-H C-H 官能團(tuán)反應(yīng)。光解官能團(tuán)反應(yīng)。光解中間體與受體作用得到的產(chǎn)物應(yīng)該比較穩(wěn)定，能夠耐受分中間體與受體作用得到的產(chǎn)物應(yīng)該比較穩(wěn)定，能夠耐受分離、純化和分析等操作。離、純化和分析等操作。 光親和標(biāo)記光親和標(biāo)記-ABPP (CC-ABPP) -ABPP (CC-ABPP) 實(shí)驗(yàn)?zāi)壳爸皇蔷窒抻诠矁r(jià)作實(shí)驗(yàn)?zāi)壳爸皇蔷窒抻诠矁r(jià)作用的探針分子的設(shè)計(jì)、研究，但是在很多情況下我們所能用的探針分子的設(shè)計(jì)、研究，但是在很多情況下我們所能得到的活性小分子與蛋白質(zhì)的作用方式是非共價(jià)的，此時(shí)得到的活性小分子與蛋白質(zhì)的作用方式是非共價(jià)的，此時(shí)

33、就希望將就希望將click-chemistry click-chemistry 引入到光親和標(biāo)記技術(shù)中，設(shè)引入到光親和標(biāo)記技術(shù)中，設(shè)計(jì)非共價(jià)作用的探針分子進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，成為蛋白計(jì)非共價(jià)作用的探針分子進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的更強(qiáng)有力的工具，對藥物的發(fā)現(xiàn)起到更大的質(zhì)組學(xué)研究的更強(qiáng)有力的工具，對藥物的發(fā)現(xiàn)起到更大的推動作用。推動作用。 化學(xué)探針可用于藥效研究。通過分析候選藥物和化學(xué)探化學(xué)探針可用于藥效研究。通過分析候選藥物和化學(xué)探針之間簡單的競爭結(jié)合針之間簡單的競爭結(jié)合, ,鑒別出復(fù)雜的蛋白質(zhì)組中藥物鑒別出復(fù)雜的蛋白質(zhì)組中藥物靶點(diǎn)。同時(shí)靶點(diǎn)。同時(shí), ,可利用更貼近生理?xiàng)l件的天然酶可利用更貼近生理?xiàng)l件的天