一哺乳動物細胞的培養(yǎng)凍存和融合課件

1、一哺乳動物細胞的培養(yǎng)凍存和融合實驗三實驗三 新生新生(xnshng)(xnshng)大鼠大大鼠大腦皮層混合細胞的培養(yǎng)和腦皮層混合細胞的培養(yǎng)和鑒定鑒定 第一頁，共十三頁。一哺乳動物細胞的培養(yǎng)凍存和融合一、實驗一、實驗(shyn)目的目的 n通過混合培養(yǎng)傳代的方法純化能得到星形膠質細胞，同時對其進行形態(tài)學的觀察和相關的免疫抗原反應鑒定(jindng)，旨在建立比較成熟的細胞培養(yǎng)系統，為后續(xù)實驗中提供穩(wěn)定的細胞來源。 第二頁，共十三頁。一哺乳動物細胞的培養(yǎng)凍存和融合二、實驗材料二、實驗材料(cilio)、試劑與器材、試劑與器材 n1H-DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清；小牛血清；N2 Supplement；

2、多聚賴氨酸、Hoechst 33258、BrdU；羊抗鼠GFAP抗體、羊抗鼠BrdU抗體；FITC標記羊抗鼠二抗、PE標記的羊抗鼠二抗；FITC標記的羊抗鼠-III-Tubulin抗體。 n2 超凈工作臺；二氧化碳培養(yǎng)箱；低速臺式離心機；活細胞(xbo)工作站；倒置相差顯微鏡及照相系統；倒置熒光顯微鏡及照相系統；電熱恒溫鼓風干燥箱；電熱恒溫水槽；超聲波清洗機；立式壓力蒸汽滅菌器。 第三頁，共十三頁。一哺乳動物細胞的培養(yǎng)凍存和融合三、實驗三、實驗(shyn)原理原理 混合細胞培養(yǎng)時主要取材于SD大鼠大腦皮層，體外剝離腦膜后機械吹打(chud)分散成單細胞懸液接種在血清培養(yǎng)基中，因為原代培養(yǎng)過程是

3、將體內環(huán)境轉變成體外環(huán)境，只有一小部分細胞成活下來，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞開始成熟、分裂。原代培養(yǎng)約一周左右，細胞能長滿皿底，細胞生長狀態(tài)較好。胰酶消化原代培養(yǎng)的混合細胞并重新接種，大部分神經元死亡，在含有血清的培養(yǎng)條件下不斷的傳代導致細胞種類單一化，即為星形膠質細胞。相對于神經元的培養(yǎng)，神經星形膠質細胞的培養(yǎng)要簡單，細胞對環(huán)境的變化要求較小。 第四頁，共十三頁。一哺乳動物細胞的培養(yǎng)凍存和融合n神經膠質酸性蛋白(dnbi)（GFAP）是星形膠質細胞特異性胞內抗原，而神經細胞粘附分子（NCAM）是神經類細胞（包括神經膠質細胞、神經元以及神經前體細胞）表面特異性抗原；微管蛋白（tubulin）是

4、組成神經元骨架的重要組成成分和原始神經上皮中所表達的最早的神經元標志物之一，其中III型微管蛋白（-III-tubulin）作為神經元特有標志物，被廣泛應用于神經生物學研究中。本實驗利用GFAP、NCAM、-III-tubulin分別對體外培養(yǎng)的星形膠質細胞和神經元進行特異性抗原染色，鑒定細胞種類及純度。 第五頁，共十三頁。一哺乳動物細胞的培養(yǎng)凍存和融合四、實驗四、實驗(shyn)(shyn)步驟步驟 n取出生48 h以內(y ni)的新生大鼠，75%酒精擦拭消毒后斷頭處死，剪開頭部皮膚，外撕，然后剪破顱骨，用眼科鑷沿大腦前方夾斷視神經，小心取出大腦放于90 mm塑料培養(yǎng)皿預冷的無菌Hanks

5、液中。在解剖顯微鏡下用腦科鑷分開左右半球，除去腦膜以及上面的血管，并除去大腦前方的嗅球和下方的下丘腦，將剝離腦膜的大腦皮層轉入另一含預冷Hanks液的塑料培養(yǎng)皿中，清洗2-3次。將清洗后的大腦皮層轉到5 ml離心管內，加入預冷的Hanks，巴氏吸管吹打，直至組織塊完全打散，液體成懸液狀。1000-1200 r/min下離心10 min左右。離心三次，最后一次將Hanks換成DMEM。調整細胞密度（約4105 /ml），將細胞接種在包被有0.01% PLL的75 cm3細胞瓶內（培養(yǎng)基為H-DMEM+10% FBS+1%雙抗）。37，5% CO2培養(yǎng)三天，第四天換液。以后每三天換液 。第六頁，共

6、十三頁。一哺乳動物細胞的培養(yǎng)凍存和融合【實驗結果與分析】【實驗結果與分析】 SD大鼠大腦皮層神經類細胞原代培養(yǎng)第三天時，培養(yǎng)皿底部有小部分細胞開始貼壁生長；換液后繼續(xù)培養(yǎng)約6 d左右，細胞鋪滿皿底，并且出現明顯的分層現象，上層細胞形態(tài)比較單一，細胞呈二極或三極狀，主要為未成熟的神經元和神經前體細胞；下層細胞呈鋪展狀，細胞較大，主要為星形膠質細胞。將混合培養(yǎng)長滿皿底的細胞胰酶消化后重新接種，得到第一代細胞，并反復按此方法將細胞按1：3進行反復傳代3-4次，因為在有血清條件下神經元在體外存活(cn hu)時間較短且不能分裂，所以隨著細胞的傳代次數的增加，神經元樣細胞越來越少，細胞形態(tài)也越來越單一，

7、同時發(fā)現隨著傳代次數的增加，細胞生長的速率越來越快。 第七頁，共十三頁。一哺乳動物細胞的培養(yǎng)凍存和融合第八頁，共十三頁。一哺乳動物細胞的培養(yǎng)凍存和融合混合細胞混合細胞(xbo)(xbo)的鑒定的鑒定 將原代長滿以及傳至第四或第五代的大鼠中樞神經系統細胞進行GFAP和NCAM免疫化學染色(rns)，鑒定細胞種類及細胞純度。細胞吸出培養(yǎng)液后，0.01 M PBS（pH7.2）洗兩次，每次5 min。吸去PBS，加入4%多聚甲醛，4冰箱固定過夜。然后PBS洗三次，每次5 min。滴加用PBS + NaN3（0.02%）+ BSA（3%）+ Triton X-100（0.2%)稀釋的mouse ant

8、i-GFAP IgG (1：1000）或者rabbit anti-NCAM IgG（1：500）， 4冰箱過夜后PBS洗三次，每次5 min，再加入FITC標記的山羊抗小鼠或者山羊抗兔二抗，室溫下作用45 min。吸去二抗，PBS洗三次，每次5 min，加入1 M Hoechst 33258室溫孵育5 min，PBS洗兩次，共5 min，最后50%緩沖甘油（PBS配制）封片，熒光顯微鏡下觀察陽性細胞。陰性對照采用PBS代替一抗或者二抗，結果陰性 。第九頁，共十三頁。一哺乳動物細胞的培養(yǎng)凍存和融合【實驗結果與分析】【實驗結果與分析】 分別對混合培養(yǎng)和不同傳代次數的細胞進行神經膠質酸性蛋白（GFA

9、P）和III型微管蛋白（-III-Tubulin）免疫熒光染色鑒定，從表一的結果可以看到，隨著傳代次數的增加，GFAP陽性細胞的比率在逐漸的提高，說明星形膠質細胞在不斷的純化?；旌吓囵B(yǎng)原代的免疫熒光結果顯示含有部分神經元，同時在對P4代細胞的神經細胞粘著(zhn zhe)分子（NCAM）和GFAP免疫抗原染色也發(fā)現存在少部分陰性細胞，可能是由于在分離腦膜時未去除干凈的少量成纖維細胞造成的。 第十頁，共十三頁。一哺乳動物細胞的培養(yǎng)凍存和融合圖A：原代細胞GFAP免疫熒光鑒定；圖B：混合(hnh)培養(yǎng)原代-III-Tubulin免疫熒光鑒定; 圖C：P4代細胞NCAM免疫熒光鑒定；圖D：P4代細胞GFAP免疫熒光鑒定。 第十一頁，共十三頁。一哺乳動物細胞的培養(yǎng)凍存和融合【思考題思考題 】 1 1、如何從混合細胞中純化星形膠質細胞？、如何從混合細胞中純化星形膠質細胞？ 2、混合細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)的有哪幾種主要的細胞類型，混合細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)的有哪幾種主要的細胞類型，如何進行如何進行(jnxng)(jnxng)鑒定？鑒定？ 第十二頁，共十三頁。一哺乳動物細胞的培養(yǎng)凍存