木聚糖酶的基因來源及研究進展

1、木聚糖酶的基因來源及研究進展1 木聚糖酶介紹 木聚糖是半纖維素的一種組成部分，是半纖維素中含量最豐富的一種，主要成分是D-木糖，是除纖維素之外自然界最為豐富的多糖，也是自然界中獲得的可再生資源之一，幾乎所有植物都含有木聚糖，它是細(xì)胞壁的組成成分，占細(xì)胞干重的1530%。木聚糖是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的非均一聚糖，主鏈骨架是由多個D-木糖基通過-1，4糖昔鍵相連而成。木聚糖的完全降解需要多種水解酶的參與而共同完成。木聚糖酶是一類將木聚糖降解為低聚糖和木糖的一組酶系，屬于水解酶類。廣義上包括內(nèi)切-1,4-木聚糖酶、外切-1,4-木聚糖酶和-木二糖苷酶。內(nèi)切-1,4-木聚糖酶優(yōu)先在不同位點上作用于木聚糖和長鏈

2、木寡糖， 從-1,4-木聚糖主鏈的內(nèi)部切割木糖苷鍵， 從而使木聚糖降解為木寡糖，其水解產(chǎn)物主要為木二糖與木二糖以上的寡聚木糖，也有少量的木糖和阿拉伯糖。外切-1,4-木聚糖酶作用于木聚糖和木寡糖的非還原端，產(chǎn)物為木糖。-木二糖苷酶通過切割木寡糖末端而釋放木糖殘基。狹義上的木聚糖酶僅指內(nèi)切-1,4-木聚糖酶。2 木聚糖酶的不同來源微生物來源的木聚糖酶的分子量在 8145 KDa，它們只含一個亞基。一般來說，分子量小于30 KDa的木聚糖酶為堿性木聚糖酶，它們通常含有 182234個氨基酸殘基；而分子量大于30 KDa的木聚糖酶為酸性木聚糖酶，它們通常含有 269809個氨基酸殘基。通常細(xì)菌可產(chǎn)生

3、兩種木聚糖酶，即低分子量堿性木聚糖酶和高分子量的酸性木聚糖酶，但真菌一般產(chǎn)生低分子量堿性木聚糖酶。據(jù)資料報道，產(chǎn)該酶的微生物有幾十個屬，一百多個種，主要來源于細(xì)菌和真菌。目前，已從20余種細(xì)菌菌株、16種真菌、3種酵母以及8種放線菌中分離出相應(yīng)的木聚糖酶。2.1 細(xì)菌來源的木聚糖酶目前對來源于細(xì)菌的木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，研究得比較清楚，芽孢桿菌的研究多集中在環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans D1），短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus ASH)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）上。芽孢桿菌產(chǎn)生的木

4、聚糖酶的最適pH在5.59.0，多數(shù)為pH 6.0；最適反應(yīng)溫度在5075，多數(shù)為70，分子量集中在1656 KDa，多數(shù)為24 KDa。Irwin等(1994)對嗜熱單孢菌的木聚糖酶特性進行了分析，分子量為32KDa，在75，18 h下酶活力為96%。某些放線菌也能產(chǎn)生木聚糖酶(Ethier等，1994)。表1 近年細(xì)菌木聚糖酶的研究菌種是否工程菌發(fā)酵方式酶活參考文獻Bacillus circulans D1否液態(tài)深層發(fā)酵8.4UmLBocchini等（2005）Bacillus pumilus ASH否固態(tài)發(fā)酵7087 Ug（干物質(zhì)）Battan等（2006）Bacillus subtil

5、is否液態(tài)深層發(fā)酵3194.25 UmLDeepak等（2008）Bacillus subtilis ASH否固態(tài)發(fā)酵8964 Ug（干物質(zhì)）Sanghi等（2009）Ecoli是液態(tài)深層發(fā)酵2122.5 UmLRusli等（2009）2.2真菌來源的木聚糖酶木霉木聚糖酶特性木霉（Trichoderma harzianum）是一類工業(yè)上生產(chǎn)纖維素酶的主要真菌，同時一些木霉也能產(chǎn)生各種不同的木聚糖酶。Koyer等(1991)從里氏木霉中純化得到兩種木聚糖酶，木聚糖酶A的分子量為21.5KDa，分解產(chǎn)物為木二糖和木三糖；木聚糖酶B分子量為33KDa，分解產(chǎn)物為木二糖和木糖。木二糖能抑制木聚搪酶B的

6、酶活，而對木聚糖酶A無此效應(yīng)。里氏木霉制備的木聚糖酶，水解植物半纖維素后，分離提純該酶解液，用HCLP法分析其組成為；木糖3.4%、木二糖37.9%、木三糖18.5%、木四糖6.5%、木五糖6.5%，其它27.2%(徐勇等，2001)。植物半纖維素經(jīng)低聚木糖酶的定向酶解后分離提純的主要成分為木二糖和木三糖。曲霉木聚糖酶特性Kimwa等(1995)從曲霉（Aspergillus Sojae）中得到了內(nèi)切-1,4一木聚糖酶的兩種同工酶，分子量分別為32.7KDa和35KDa，等電點分別為3.50和3.75，這兩種酶活性能明顯被Mn2+和EDTA所抑制。Femandez等(1995)發(fā)現(xiàn)，構(gòu)巢曲霉在

7、以木聚糖為碳源時至少可分泌三種內(nèi)切一木聚糖酶：X22、X24、和X34，分子量分別為22、24和34KDa，其中X22是中性酶，其余兩種為酸性酶。此酶對木聚糖有很高的專一性，是一種非脫支型木聚糖酶，與黑曲霉木聚糖酶近似，但后者分子量較小(28KDa)。注：Aspergillus niger XY-1、LBP326、SS7黑曲霉，Aspergillus terreus MTCC8661土曲霉，Aspergillus foetidus MTCC4898臭曲霉，Penicillium canescens變灰青霉菌，Thermonyces lanuginosus195嗜熱真菌，Trichoderma

8、harzianum KSR-2木霉，Burkholderia sp. DMAX伯克霍爾德氏菌此外， 裂褶菌（Schizophyllum commune），固體培養(yǎng)產(chǎn)木聚糖酶酶活2700U/g，鈞木霉（Trichoderma hamatum）產(chǎn)木聚糖酶酶活7000U/g，嗜熱擬青霉（Paecilomyces thermophila T18）通過小麥秸稈固體發(fā)酵產(chǎn)酶酶活18580 U/g，里氏木霉（Trichoderma reesei），產(chǎn)生的木聚糖酶的最大酶活為3350U/ml，綠色木霉：產(chǎn)生三種木聚糖酶XI 、X II和 XIII，它們最適反應(yīng)溫度分別為60、 60、 50，最適反應(yīng)pH 分別

9、為5.5、5.0、4.5。2.3畢赤酵母表達的木聚糖酶表達細(xì)菌來源的木聚糖酶芽孢桿菌Bacillus sp.NG-27 耐熱耐堿木聚糖酶AFO15445最適pH8.5，最適溫度70，最高酶活：426 U/ml，成熟蛋白基因大小、編碼氨基酸數(shù)目和分子量大小都未知。表達菌株為GS115，表達載體是pHBM905。2.3.2 表達真菌來源的木聚糖酶（1）曲霉，產(chǎn)生高穩(wěn)定性木聚糖酶，最適pH5.0， 最適溫度60，比活856U/mg，成熟蛋白基因555bp，編碼185個氨基酸，分子量約26 kDa，表達菌株X-33，表達載體pGAP。（2）黑曲霉N402，產(chǎn)生耐高溫木聚糖酶xyl，最適pH2.5，最適

10、溫度50，比活未知，成熟蛋白基因636bp，成熟蛋白基因編碼212個氨基酸，分子量約23kDa，表達菌株GS115SMD1168，表達載體pGAPZa。（3）里氏木霉 Rut C- 30，產(chǎn)生酸性木聚糖酶XYN II，最適pH5.0，最適溫度60，比活856U/mg，成熟蛋白基因669bp，成熟蛋白基因編碼223個氨基酸，分子量為24.5 kDa，表達菌株GS115，表達載體pPIC9K 。（4）鏈霉菌（Streptomyces olivaceoviridis A1），最適pH4.6，最適溫度50，比活未知，成熟蛋白基因576bp，成熟蛋白基因編碼191個氨基酸，分子量約23.0 kDa。（5

11、）橄欖綠鏈霉菌（Streptomyces olivaceoviridis XYNB），最適pH5.6，最適溫度60，最高酶活10000 U/ml，比活1179.6 U/mg，成熟蛋白基因576bp，成熟蛋白基因編碼191個氨基酸，分子量約23kDa，表達菌株GS115，表達載體pPIC9a。（6）瓶霉屬：phialophora sp.J88 高溫酸性木聚糖酶XYN10J88 最適pH：4.0 最適溫度：70 比活：350.6U/mg 成熟蛋白基因：1137bp 成熟蛋白基因編碼379個氨基酸 分子量為：40.0 kDa，表達菌株GS115，表達載體pPIC9。3木聚糖酶的應(yīng)用3.1木聚糖酶在飼

12、料上的應(yīng)用（1）木聚糖酶降解木聚糖，降低腸道食糜黏度，破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，消除其抗?fàn)I養(yǎng)作用，改善動物生產(chǎn)性能。降低飼料用糧中的非淀粉多糖，提高飼料代謝能，促進養(yǎng)分吸收。（2）消除木聚糖對內(nèi)源酶的抑制，防止消化器官代償性肥大。（3）木聚糖降解后生成大量功能性寡糖（木二糖、木三糖等），改善腸道微生物區(qū)系，有利于動物健康。（4）增加營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，減少糞便排放，保護環(huán)境，同時減少糞便有機物質(zhì)分解產(chǎn)生的有害氣體對畜禽的刺激，減少呼吸道疾病的發(fā)生。（5）減少飼料原料品質(zhì)變異造成的飼料產(chǎn)品質(zhì)量波動，穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量，減少投訴。（6）拓寬飼料原料使用范圍，加大非常規(guī)飼料如麩皮、次粉、米糠等在飼料中的用量，降

13、低飼料配方成本。增強飼料和養(yǎng)殖企業(yè)贏利能力。在飼料制粒過程中有一個短暫的高溫過程（溫度一般在7593），一般木聚糖酶在此溫度下會大幅度喪失活性，因此能在飼料中真正推廣的木聚糖酶必須具有良好的熱穩(wěn)定性。一般來說，非淀粉多糖(NSP)酶在75時是穩(wěn)定的。80時酶活損失50%以上(Pilip Lobo等，1998)；另一方面飼料中木聚糖酶最終的作用場所是動物正常體溫(37)的胃腸道中，木聚糖酶必須在常溫下具有較高的活性。近年來，已從嗜溫微生物中發(fā)現(xiàn)了多種耐高溫木聚糖酶，對它們的結(jié)構(gòu)與熱穩(wěn)定性的研究將為木聚糖酶基因的分子改造提供理論依據(jù)。3.2在食品上的應(yīng)用小麥面食。木聚糖酶在食品中的應(yīng)用主要是在小麥

14、面粉的改良方面。小麥面粉中的戊聚糖含量雖少，但卻對面團的流變性質(zhì)和面食品質(zhì)有著顯著影響。烘焙面包時，在面粉中加入木聚糖酶可以改善面粉的切分、搓團和成型等機械加工性能,增加面包的體積和比容，改善面包心的彈性、硬度和柔軟性，延緩面包的老化。同樣，木聚糖酶還可以應(yīng)用在饅頭、蛋糕等其他小麥?zhǔn)称分校ㄟ^面粉持水性的改善和面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化來提高其品質(zhì)，并可延長其貨架壽命。果蔬加工。果蔬細(xì)胞壁是由果膠質(zhì)、纖維素和木聚糖等半纖維素組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可阻止細(xì)胞內(nèi)容物的滲出。因此，要將新鮮水果蔬菜加工成果蔬汁，關(guān)鍵是徹底水解果膠。過去，人們認(rèn)為只要有一定的果膠酶即可水解果膠，提高出汁率，但結(jié)果并不理想。后來發(fā)現(xiàn)將

15、木聚糖酶與纖維素酶和果膠酶合理搭配就可在溫和的條件下破壞果蔬的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提高出汁率。同時，由于該復(fù)合酶分解了果蔬中的果膠和半纖維素等物質(zhì)，降低了果汁的粘度，從而也就加快了果汁的流出，使得壓榨時間縮短，提高了工廠的生產(chǎn)效率。此外，部分木聚糖等半纖維素在酶的作用下分解成水溶物，這也提高了飲料中可溶性固形物的含量。釀酒。在啤酒釀造中，木聚糖酶主要是應(yīng)用在麥芽汁的生產(chǎn)上。生產(chǎn)中由于原料含-葡聚糖和木聚糖較多，使得麥汁粘度高而難以過濾,并引起啤酒混濁、 啤酒濾膜堵塞等問題。在麥芽汁制備過程中加入木聚糖酶后，酶不但能通過降解木聚糖破壞植物細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物充分釋放出來與麥芽中的淀粉酶和蛋白酶等水解酶充分接觸而消化，縮短糖化時間，而且還可以水解水溶性木聚糖，降低麥汁粘度，從而有效地提高了麥芽汁的過濾速度。木聚糖酶和-葡聚糖酶協(xié)同作用處理效果更佳。在白酒生產(chǎn)中，木聚糖酶的主要作用是和纖維素酶等其他多糖水解酶協(xié)同破壞原料細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。這是因為白酒是以谷物的粉碎顆粒為原料進行固體發(fā)酵而釀造的。因此，只有徹底破壞纖維素、半纖維素、果膠、蛋白質(zhì)等組分對淀粉顆粒的屏蔽和保護作用，才能充分淀粉酶的糖化作用。木聚糖酶的活性和出酒率密切相關(guān)。3.3在造紙上的應(yīng)用制漿造紙向來是環(huán)境污染的