食品理化檢驗 氨基酸及蛋白質

1、 第三章第三章 食品的營養(yǎng)成分分析食品的營養(yǎng)成分分析水分的測定水分的測定u 蛋白質和氨基酸的測定蛋白質和氨基酸的測定u 脂肪的測定脂肪的測定u 碳水化合物的測定碳水化合物的測定u 維生素的測定維生素的測定u 灰分及有關元素的測定灰分及有關元素的測定第三節(jié)第三節(jié) 食品中蛋白質和氨基酸的測定食品中蛋白質和氨基酸的測定Determination of protein and amino acid in Food復習一下復習一下1.1.蛋白質的元素組成蛋白質的元素組成 C C：50-55% H50-55% H：6-8% O6-8% O：20-23% 20-23% N N：15-18% S15-18%

2、S：0-4%0-4% 微量元素：還含有微量的微量元素：還含有微量的 P P、CuCu、FeFe、I I 等等2.2.基本結構單位：基本結構單位：氨基酸氨基酸3.3.蛋白質的變性作用。蛋白質的變性作用。（一）蛋白質的生理功能及在食品中的作用（一）蛋白質的生理功能及在食品中的作用（二）食品中的蛋白質含量（二）食品中的蛋白質含量（三）蛋白質系數(shù)（三）蛋白質系數(shù)（四）蛋白質水解（四）蛋白質水解（五）蛋白質測定方法（五）蛋白質測定方法一、概述一、概述 蛋白質是生命的物質基礎，是構成生物體細胞組織的蛋白質是生命的物質基礎，是構成生物體細胞組織的重要成分；重要成分； 維持人體的酸堿平衡、水平衡；維持人體的酸

3、堿平衡、水平衡； 物質的代謝及運轉都與蛋白質有關物質的代謝及運轉都與蛋白質有關; ; 蛋白質是食品的最重要的營養(yǎng)指標。其含量與分解產蛋白質是食品的最重要的營養(yǎng)指標。其含量與分解產物直接影響食品的色、香、味。物直接影響食品的色、香、味。（一）蛋白質的生理功用及在食品中的作用（一）蛋白質的生理功用及在食品中的作用不同食品蛋白質的含量不同，可作為質量檢驗的一種重要手段。不同食品蛋白質的含量不同，可作為質量檢驗的一種重要手段。( (二二) ) 食品中的蛋白質含量食品中的蛋白質含量谷類和面食：谷類和面食： （% %）大米（糙米、長粒、生）大米（糙米、長粒、生） 7.97.9大米（白米、長粒、生）大米（白

4、米、長粒、生） 7.17.1小麥粉（整粒）小麥粉（整粒） 13.713.7玉米粉（整粒、黃色）玉米粉（整粒、黃色） 6.96.9玉米淀粉玉米淀粉 0.30.3豆類：豆類：大豆（成熟的種子、生）大豆（成熟的種子、生） 36.536.5豆（腰子狀、所有品種）豆（腰子狀、所有品種） 23.623.6豆腐（生、普通）豆腐（生、普通） 8.18.1水果和蔬菜：水果和蔬菜：蘋果（生、帶皮）蘋果（生、帶皮） 0.20.2蘆筍（生）蘆筍（生） 2.32.3草莓（生）草莓（生） 0.60.6萵苣（冰、生）萵苣（冰、生） 1.01.0肉、家禽、魚：肉、家禽、魚：牛肉（頸肉、烤前腿）牛肉（頸肉、烤前腿） 18.51

5、8.5牛肉（腌制、干牛肉）牛肉（腌制、干牛肉） 29.129.1雞（可供煎炸的雞胸肉、生）雞（可供煎炸的雞胸肉、生） 23.123.1火腿（切片、普通的）火腿（切片、普通的） 17.617.6雞蛋（生、全蛋）雞蛋（生、全蛋） 12.512.5魚（太平洋鱈魚、生）魚（太平洋鱈魚、生） 17.917.9魚（罐裝金槍魚滴干的固體）魚（罐裝金槍魚滴干的固體） 26.526.5乳制品：乳制品：牛乳（全脂、液體）牛乳（全脂、液體） 3.33.3牛乳（脫脂、干）牛乳（脫脂、干） 36.236.2干酪干酪 24.924.9酸奶（普通的、低脂）酸奶（普通的、低脂） 5.35.3不同的蛋白質其氨基酸構成比例及方式

6、不同，故各種不同不同的蛋白質其氨基酸構成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質其含氮量也不同的蛋白質其含氮量也不同；一般蛋白質含氮量為一般蛋白質含氮量為16%，即一，即一 份氮素相當于份氮素相當于6.25份蛋白質，此數(shù)值（份蛋白質，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質系數(shù)）稱為蛋白質系數(shù)。 不同種類食品的蛋白質系數(shù)有所不同不同種類食品的蛋白質系數(shù)有所不同，如玉米，蕎麥，如玉米，蕎麥，青豆，雞蛋等為青豆，雞蛋等為6.25，花生為，花生為5.46，大米為，大米為5.95，大豆及其制，大豆及其制品為品為5.71，小麥粉為，小麥粉為5.70，牛乳及其制品為，牛乳及其制品為6.38。（三）蛋白質系數(shù)（三）蛋白質系數(shù)

7、 （四）（四） 蛋白質水解蛋白質水解 在構成蛋白質的氨基酸中，亮氨酸、異亮氨酸、賴在構成蛋白質的氨基酸中，亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等8種氨基酸在人體內不能合成，必須依靠食品提供，故被種氨基酸在人體內不能合成，必須依靠食品提供，故被稱為必需氨基酸，他們對人體有極其重要的生理作用。稱為必需氨基酸，他們對人體有極其重要的生理作用。 蛋白質蛋白質胨胨肽肽氨基酸氨基酸凱氏定氮法凱氏定氮法杜馬斯法杜馬斯法福林酚法福林酚法染色法染色法（五）蛋白質的測定方法凱氏定氮法凱氏定氮法1.1.原理原理 樣品與樣品與濃硫酸和催化劑

8、濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨。然后氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨。然后加堿加堿，在氫氧化鈉在氫氧化鈉的作用下，的作用下，經水蒸氣蒸餾使經水蒸氣蒸餾使氨蒸出氨蒸出，用過量的，用過量的硼酸溶液吸硼酸溶液吸收后收后，再以鹽酸或硫酸標準溶液滴定再以鹽酸或硫酸標準溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量計，根據(jù)酸的消耗量計算算含氮量含氮量，并換算成，并換算成蛋白質含量蛋白質含量。 2NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4 (NH4) 2SO4+6C

9、O2+12SO2+16H2O加硫酸鉀加硫酸鉀 作為增溫劑，提高溶液沸點作為增溫劑，提高溶液沸點加氧化劑加氧化劑 加速有機物氧化速度加速有機物氧化速度LOGO硫酸鉀硫酸鉀的作用的作用u 作為增溫劑，作為增溫劑，它與硫酸作用生成硫酸氫鉀它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高可提高反應溫度反應溫度，而加快有機物分解，而加快有機物分解；u 一般純硫酸的沸點在一般純硫酸的沸點在3400C左右，而添加硫酸鉀后，左右，而添加硫酸鉀后，可使溫度提高到可使溫度提高到4000C以上，原因主要在于隨著消以上，原因主要在于隨著消化過程中硫酸不斷地被分解化過程中硫酸不斷地被分解 ，水分不斷逸出而使硫，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度

10、增大酸鉀濃度增大 ，故沸點升高，其反應式如下：，故沸點升高，其反應式如下： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3LOGO但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失：損失： （NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O除硫酸鉀外也可加入硫酸鈉，氯化鉀等鹽類除硫酸鉀外也可加入硫酸鈉，氯化鉀等鹽類來提高沸點，但效果不如硫酸鉀。來提高沸點，但效果不如硫酸鉀。LOGO 硫酸銅的作用硫酸

11、銅的作用 催化劑催化劑 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 此反應不斷進行，待有機物被消化完此反應不斷進行，待有機物被消化完后，后，不不再有硫酸亞銅再有硫酸亞銅（褐色）（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍綠生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍綠色。色。 可以指示可以指示消化消化終點的到達終點的到達消化具體操作消化具體操作準確稱取樣品，置于凱氏燒瓶中；準確稱取樣品，置于凱氏燒瓶中；加入硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸搖勻；加入硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸搖勻；置于電爐上，成置于電爐上，成4545度角，小火加熱。度角，小火加

12、熱。待泡沫停止后，加大火力，保持微待泡沫停止后，加大火力，保持微沸，至液體變藍綠色透明，再繼續(xù)沸，至液體變藍綠色透明，再繼續(xù)加熱加熱0.50.51h1h，取下冷卻后，小心加入水，轉移至取下冷卻后，小心加入水，轉移至1000ml1000ml容量瓶，定容，作為樣品液容量瓶，定容，作為樣品液備用，同時做空白試驗。備用，同時做空白試驗。l按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置;l于水蒸氣發(fā)生瓶內裝水裝水至2/3容積處，加指示劑數(shù)滴及硫酸硫酸數(shù)毫升，以保持水呈，加入數(shù)粒玻璃珠，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內的水。l在加入硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。 用硼酸吸收，用用硼酸吸收，用鹽酸標準溶液鹽酸標準溶液滴

13、定至滴定至灰色灰色為終點為終點 指示劑：混合指示劑（甲基紅指示劑：混合指示劑（甲基紅溴甲酚綠）溴甲酚綠） 指示劑指示劑 紅色紅色 綠色綠色 紅色紅色 （酸）（酸） （堿）（堿） （酸）（酸）2NH + 4H BO =(NH ) B O +5H O (NH ) B O +2HCl+5H O=2NH Cl+4H BO1000W%100K)(CMVVN21半微量凱氏定氮蒸餾裝置半微量凱氏定氮蒸餾裝置LOGO（1）測得的是粗蛋白含量（總氮量，含非蛋白氮）；測得的是粗蛋白含量（總氮量，含非蛋白氮）；（2）所用試劑應用所用試劑應用配制配制；（3）消化過程應注意消化過程應注意凱氏燒瓶，利用冷凝酸液將凱氏燒瓶

14、，利用冷凝酸液將附在瓶壁上的炭粒沖下，以促進消化完全。附在瓶壁上的炭粒沖下，以促進消化完全。（4）若樣品含脂肪或糖較多時，）若樣品含脂肪或糖較多時，消化時易產生大量泡消化時易產生大量泡沫，可加沫，可加少量辛醇或液體石蠟，或硅少量辛醇或液體石蠟，或硅油油消泡劑，并消泡劑，并注意適當控制熱源強度注意適當控制熱源強度（要小火加熱）（要小火加熱）。（5）若樣品消化液不易澄清透明，可將凱氏燒瓶冷卻，）若樣品消化液不易澄清透明，可將凱氏燒瓶冷卻，加入加入300g/L23ml后再加熱。后再加熱。注意事項注意事項LOGO（5）若取樣量較大，如干試樣超過若取樣量較大，如干試樣超過5 5g g，可按每克試樣可按每

15、克試樣5 5mlml的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。（6 6）消化時間一般約消化時間一般約4 4小時左右即可，消化時間過長小時左右即可，消化時間過長會引起氨的損失。會引起氨的損失。一般消化至透明后，繼續(xù)消化一般消化至透明后，繼續(xù)消化3030minmin即可，但當含有特別難以氨化的即可，但當含有特別難以氨化的氮氮化化合合物的樣物的樣品，品，如含賴氨酸或組氨酸時，消化時間需適當延長如含賴氨酸或組氨酸時，消化時間需適當延長，因為這兩種氨基酸中的氮在短時間內不易消化完全，因為這兩種氨基酸中的氮在短時間內不易消化完全，往往導致總氮量偏低往往導致總氮量偏低。有機物如分解完全，分解液。有機物如分解完

16、全，分解液呈藍色或淺綠色。但含鐵量多時，呈較深綠色呈藍色或淺綠色。但含鐵量多時，呈較深綠色。LOGO（7）蒸餾過程應注意接頭處無）蒸餾過程應注意接頭處無現(xiàn)象，蒸餾完畢，現(xiàn)象，蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開液面，繼續(xù)蒸餾先將蒸餾出口離開液面，繼續(xù)蒸餾1min，將附著在將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內，再將吸收瓶移開，尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內，再將吸收瓶移開，最后關閉電源，最后關閉電源，絕絕不能先關閉電源，否則吸收液將不能先關閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。發(fā)生倒吸。（8）不應超過不應超過40C，否則氨吸收否則氨吸收減弱，造成損失，可置于冷水浴中。減弱，造成損失，可置于冷水浴中。（9）混合指示劑

17、在堿性溶液中呈）混合指示劑在堿性溶液中呈，在中性溶液中，在中性溶液中呈呈，在酸性溶液中呈，在酸性溶液中呈。LOGO自動凱氏定氮儀自動凱氏定氮儀特點：特點：（1）消化裝置用優(yōu)質玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。）消化裝置用優(yōu)質玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時消化多個樣品，）快速：一次可同時消化多個樣品， 消化時間短；消化時間短；（3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？桑┳詣樱鹤詣蛹訅A蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置。可計算總氮百分含量并記錄，計算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成分鐘完成1個樣。個樣。LOGO 1、試述蛋白質測定中

18、，樣品消化過程所必須注意試述蛋白質測定中，樣品消化過程所必須注意的事項，消化過程中內容物顏色發(fā)生什么變化？為的事項，消化過程中內容物顏色發(fā)生什么變化？為什么？什么？ 2 2、樣品經消化進行蒸餾前，為什么要加入氫氧化樣品經消化進行蒸餾前，為什么要加入氫氧化鈉？這時溶液發(fā)生什么變化？為什么？如果沒有變鈉？這時溶液發(fā)生什么變化？為什么？如果沒有變化，說明什么問題？須采用什么措施？化，說明什么問題？須采用什么措施？ 3 3、硫酸銅及硫酸鉀在測定中起了什么作用？硫酸銅及硫酸鉀在測定中起了什么作用？ 作作 業(yè)業(yè)氨基酸的測定氨基酸的測定Determination of amino acid in Food氨

19、基酸的測定方法氨基酸的測定方法 氨基酸分析儀法（國標法）氨基酸分析儀法（國標法） 高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC)HPLC) 氣相色譜法（氣相色譜法（GC)GC) 熒光分光光度法熒光分光光度法 紫外紫外- -可見分光光度法可見分光光度法氨基酸分析儀法氨基酸分析儀法1、原理、原理 利用氨基酸的利用氨基酸的酸堿性、極性和分子量大小不同酸堿性、極性和分子量大小不同等性質，等性質，使用使用陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂在色譜柱上進行分離。當樣液加入色在色譜柱上進行分離。當樣液加入色譜柱頂端后，采用譜柱頂端后，采用不同的不同的pHpH值和離子濃度的緩沖溶液值和離子濃度的緩沖溶液即可即可將它們依次

20、洗脫下來，洗脫下來的氨基酸可用將它們依次洗脫下來，洗脫下來的氨基酸可用茚三酮顯色茚三酮顯色，再通過分光光度計比色測定氨基酸含量。再通過分光光度計比色測定氨基酸含量。定量依據(jù)：定量依據(jù)：是是氨基酸和茚三酮反應氨基酸和茚三酮反應生成藍紫色化合物的生成藍紫色化合物的顏色深淺顏色深淺與各有關與各有關氨基酸的含量成正比氨基酸的含量成正比。脯氨酸和羥脯氨酸則生成黃棕色化合物，故需在另外波脯氨酸和羥脯氨酸則生成黃棕色化合物，故需在另外波長處定量測定。長處定量測定。 氨基酸自動分析儀氨基酸自動分析儀氨基酸分析儀法氨基酸分析儀法2. 操作方法操作方法 （1 1）樣品處理：）樣品處理：測定測定樣品中樣品中各種各種

21、游離氨基酸含量游離氨基酸含量，可，可以以除去脂肪等除去脂肪等雜質后，雜質后，直接上柱進行分析直接上柱進行分析。 測定測定蛋白質的氨基酸組成時樣品蛋白質的氨基酸組成時樣品必須必須經酸水解經酸水解，使蛋，使蛋白質完全變成氨基酸后才能上柱進行分析。白質完全變成氨基酸后才能上柱進行分析。酸水解的方法：酸水解的方法：稱取經干燥的蛋白質樣品鹽酸，置于稱取經干燥的蛋白質樣品鹽酸，置于110110 C C烘箱內水解烘箱內水解2424小時，然后除去過量的鹽酸，加緩沖小時，然后除去過量的鹽酸，加緩沖溶液稀釋到一定體積，搖勻。取一定量的水解樣品上柱溶液稀釋到一定體積，搖勻。取一定量的水解樣品上柱進行分析。進行分析。

22、 氨基酸分析儀法氨基酸分析儀法 如果樣品中如果樣品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、無機鹽等雜含有糖和淀粉、脂肪、核酸、無機鹽等雜質，質，必須將樣品預先除去雜質后再進行酸水解處理。去除必須將樣品預先除去雜質后再進行酸水解處理。去除雜質的方法如下雜質的方法如下: : 去糖和淀粉去糖和淀粉：把樣品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗：把樣品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗滌，得蛋白質沉淀物；滌，得蛋白質沉淀物； 去脂肪：去脂肪：先把干燥的樣品經研碎后用丙酮或乙醚等有機先把干燥的樣品經研碎后用丙酮或乙醚等有機溶劑離心或過濾抽提，得蛋白質沉淀物；溶劑離心或過濾抽提，得蛋白質沉淀物； 去核酸：去核酸：將樣品在將樣品在

23、10%10%氯化鈉溶液中，氯化鈉溶液中，8585加熱加熱6 6小時，小時，然后用熱水洗滌，過濾后將固形物用丙酮干燥即可；然后用熱水洗滌，過濾后將固形物用丙酮干燥即可；去無機鹽：樣品經水解后含有大量無機鹽時還必須用陽離去無機鹽：樣品經水解后含有大量無機鹽時還必須用陽離子交換樹脂進行去鹽處理。子交換樹脂進行去鹽處理。氨基酸分析儀法氨基酸分析儀法（2 2）樣品分析：）樣品分析： 經過處理后的樣品上柱進行分析。上柱的樣品量視所經過處理后的樣品上柱進行分析。上柱的樣品量視所用自動分析儀的靈敏度而定。一般為每種氨基酸用自動分析儀的靈敏度而定。一般為每種氨基酸0.10.1 molmol左左右右( (水解樣品

24、干重為水解樣品干重為0.3mg0.3mg左右左右) )；生成的紫色物質在；生成的紫色物質在570nm570nm波長下進行比色測定。而生成的黃色化合物在波長下進行比色測定。而生成的黃色化合物在440nm440nm波長下波長下進行比色測定。進行比色測定。（3 3）結果計算：）結果計算： 根據(jù)峰出現(xiàn)的時間來確定氨基酸的種類。從峰的高度根據(jù)峰出現(xiàn)的時間來確定氨基酸的種類。從峰的高度和寬度可計算氨基酸的含量。和寬度可計算氨基酸的含量。用陽離子交換柱分離及測定氨基酸所得圖譜如下：用陽離子交換柱分離及測定氨基酸所得圖譜如下： 高效液相色譜法高效液相色譜法原理原理 蛋白質樣品經酸或堿水解后，將氨基酸進行衍生化作蛋白質樣品經酸或堿水解后，將氨基酸進行衍生化作用而溶解于流動相溶液中，采用高效液相色譜儀分離并用用而溶解于流動相溶液中，采用高效液相色譜儀分離并用熒光檢測器進行測定，即可測定出各種氨基酸的含量。熒光檢測器進行測定，即可測定出各種氨基酸的含量。高效液相色譜法適于分析沸點高、分子量大、熱穩(wěn)定性差高效液相色譜法適于分析沸點高、分子量大、熱穩(wěn)定性差的物質和生物活性物質。的物質和生物活性物質。由于大多數(shù)氨基酸無紫外吸收及熒光發(fā)射特性，而紫外吸由于大多數(shù)氨基酸無紫外吸收及熒光發(fā)射特性，而紫外吸收檢測器（收檢測器（UVDUVD）和熒光檢測器（）和熒光檢測器（FDFD）又是）又是HPLCHPLC儀的最