藥物色譜分析期末考試重點(diǎn)及內(nèi)容 藥大

1、考試題型：名解、填空、選擇、問答、計(jì)算藥物色譜分析復(fù)習(xí)重點(diǎn)第三章 氣相色譜法1. 了解氣相色譜法的特點(diǎn)及分類；特點(diǎn)：1、效能高 2、靈敏度高 3、選擇性高 4、分析速度快 5、應(yīng)用范圍廣，測(cè)定高溫下可氣化的物質(zhì) 6、樣品用量少分類：1、按固定相分：氣-固、氣-液 2、按柱子分：填充柱、毛細(xì)管柱 3、按分離機(jī)制分：吸附、分配2. 氣相色譜的固定液（1）對(duì)固定液的要求1、熱穩(wěn)定性好，在柱溫下不熱解，2、化學(xué)惰性，不應(yīng)與樣品組分、擔(dān)體、柱材料及載氣發(fā)生不可逆反應(yīng)。3、蒸氣壓低，在操作溫度下一般應(yīng)低于0.1mmHg，否則固定液易流失，影響柱使用壽命、保留時(shí)間及檢測(cè)器響應(yīng)。4、對(duì)樣品組分有一定的溶解度，

2、否則樣品組分不被保留而得不到分離。5、對(duì)樣品組分具有選擇性，不同的組分有不同的分配系數(shù)，以利分離。6、對(duì)擔(dān)體有濕潤(rùn)性，以利于在擔(dān)體表面形成均勻液膜，以增加柱效。（2） 樣品組分與固定液之間的分子作用力的種類1、 定向力：由極性分子的永久偶極間的靜電作用形成的。如極性組分與強(qiáng)極性固定液PEG-20M等的作用力。2、 誘導(dǎo)力：在極性分子的永久偶極的電場(chǎng)作用下，鄰近的可極化的非極性分子可產(chǎn)生誘導(dǎo)偶極，因而兩分子間產(chǎn)生相互作用力，這種作用力通常較小。3、 色散力：非極性分子由于原子核和電子的運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生瞬間偶極，因而產(chǎn)生相互作用，這種力普遍存在，但非極性分子間的作用力僅此一種。此作用力更弱。4、 特殊作

3、用力：主要來源于組分與固定液形成絡(luò)合物。例如含有Ag+的固定液與烯烴可形成絡(luò)合物。（3） 固定液的極性與分離特性評(píng)價(jià)，主要掌握Rohrschneider常數(shù)，了解McReynolds常數(shù)組分的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與固定液相似時(shí)，在固定相中的溶解度大，因而保留時(shí)間長(zhǎng)；反之，溶解度小，保留時(shí)間短。Rohrschneider（羅胥耐得）提出了一種固定相極性的分類法：規(guī)定非極性固定液角鯊?fù)榈南鄬?duì)極性為0，強(qiáng)極性固定液,-氧二丙腈的極性為100，其它固定液的極性按下式計(jì)算： q為丁二烯和正丁烷在固定液上的相對(duì)保留值之比的對(duì)數(shù)，即：q 1、q 2、q x 分別為待測(cè)物在氧二丙腈、角鯊?fù)榧坝麥y(cè)固定液上的q按這一方法測(cè)

4、出的相對(duì)極性，從0至100分為五級(jí)，每20為一級(jí)，用“”表示。按上述方法不能反映出樣品組分與固定液之間的全部相互作用力，只是反映了色散力和誘導(dǎo)力。Mc Reynolds改進(jìn)了羅氏的方法，采用下列十種化合物作為檢測(cè)物： 麥?zhǔn)铣?shù)I的計(jì)算公式如下： Ip為某組分在待測(cè)固定液上的保留指數(shù)，Ia為同一組分在角鯊?fù)樯系谋Ａ糁笖?shù)， 一種固定液在規(guī)定的十種組分上測(cè)得的各個(gè)I值，體現(xiàn)了組分與固定液間的色散力、誘導(dǎo)力、定向力與氫鍵力。因而比較全面地反映了該固定液的分離特性。 結(jié)論：1、 當(dāng)固定液品種不同，但I(xiàn)值均幾乎相同時(shí)，它們的分離特性也幾乎相同，如SE-30，OV-1，OV-101，DC-410，SE-96

5、。2、 當(dāng)固定液之間的I值接近時(shí)，它們的分離特性也接近，如DC710與OV-17。3、 當(dāng)固定液間的I值差別大時(shí)，它們的分離特性也有很大差別。 （4） 固定液的分類，掌握幾種常見常見固定液如聚二甲基硅氧烷類、聚苯基甲基硅氧烷類、氰烷基聚硅氧烷類和聚乙二醇的特點(diǎn)及使用分析對(duì)象，特別是一些商品代碼所表示的對(duì)應(yīng)的固定液名稱。常用：1、 甲基硅酮（又稱甲基聚硅氧烷） 甲基硅酮SE-30，OV-1是最常用的固定液，極性很弱，與組分的相互作用力主要是色散力，對(duì)含氧化合物有一定的選擇性。對(duì)于烴類等非極性化合物基本上按沸點(diǎn)順序分離。2、 苯基甲基硅酮 按苯基含量的不同，有低苯基（含苯基25%），中苯基（含苯基

6、50%）及高苯基硅酮之分。OV-17屬中苯基硅酮。此類固定液適合于分離甾體化合物、生物堿、醇類、糖類等化合物。3、 氰烷基硅酮 XE-60、OV-225 這類固定液含有電負(fù)性的氰基，對(duì)極性組分有較強(qiáng)的定向力，對(duì)易極化組分可使之產(chǎn)生誘導(dǎo)偶極。適用于分離糖類、醇類、酚類、甾體化合物、脂肪酸等。4、 氟烷基硅酮QF-1含三氟丙基，對(duì)硝基化合物和酮類有顯著的選擇性保留。而對(duì)芳烴和醇類則否。對(duì)于酮-芳烴，酮-醇能很好地分離。5、 聚乙二醇 PEG20M、PEG6000、PEG400 這類固定液含有醚基及羥基，是氫鍵型固定液。在氫鍵的形成中，既是氫鍵的質(zhì)子接受體又是質(zhì)子給予體。它們能與羥基化合物、堿性含氮

7、化合物、酮類等形成氫鍵。組分在這類固定液上的保留主要取決于氫鍵力的大小。適合于分離醇類、醛類、脂肪酸類、酚類、生物堿、酯類等化合物。6、 聚酯 DEGA、DEGS等為線性脂肪族聚酯，酯基中的氧原子有未用電子對(duì)，有親核性，能與帶部分正電荷的氫形成氫鍵。另外，由于誘導(dǎo)效應(yīng)（酯基的），存在著活潑氫原子，所以有親電性，對(duì)烯烴、芳烴、雜環(huán)化合物有較大的作用力。適用于分離醇類、酚類、脂肪酸類、酯類、胺類等化合物。（5） 氣相色譜中如何選擇固定液1、 相似相溶：分離極性大的組分，則選用極性大的固定液。分離非極性的組分，則可選用非極性或弱極性固定液。無論采用非極性或極性固定液，一般沸點(diǎn)小的先出峰（對(duì)同系物而言

8、）2、 若樣品中的待測(cè)成分一個(gè)是極性組分，另一個(gè)是非極性組分，則采用極性固定液比非極性固定液有利。 3、 若樣品中的待測(cè)組分容易形成氫鍵，則采用氫鍵型固定液（如PEG-20M）較為有利。4、 混合固定液：混合固定液的保留值具有加和性。因此，在同一條件下分別測(cè)出被分離組分在單一固定液柱上的調(diào)整保留時(shí)間（tR）后，可用圖解法求出混合固定液的最佳配比。 （6） 擔(dān)體一、 擔(dān)體的作用是支持固定液，使成均勻薄膜，以利氣液平衡。有以下要求1、 顆粒均勻 2、比表面積大3、化學(xué)惰性4、熱穩(wěn)定性好5、機(jī)械強(qiáng)度好 藥物分析中常用擔(dān)體為硅藻土擔(dān)體。紅色擔(dān)體：天然硅藻土燒結(jié)而成，含氧化鐵而成紅色，結(jié)構(gòu)緊密，機(jī)械強(qiáng)度

9、好，表面有氫鍵及酸堿活性作用點(diǎn)。主要用于非極性固定液（樣品）。 白色擔(dān)體：硅藻土+助熔劑（Na2SO4）煅燒而成，其中氧化鐵變成無色的鐵硅酸鈉配合物。結(jié)構(gòu)疏松，機(jī)械強(qiáng)度較前者差，易碎而產(chǎn)生結(jié)粉，極性中心較紅色擔(dān)體少。2、 擔(dān)體的表面處理 ：酸洗、堿洗、釉化、硅烷化酸洗法：酸洗水洗烘干硅烷化目的：除去擔(dān)體表面的鐵等金屬氧化物雜質(zhì)。酸洗擔(dān)體主要用于分離酸和酯類化合物。3、 釉化目的：釉化可以堵塞擔(dān)體表面的微孔、改善表面性質(zhì)、屏蔽或惰化擔(dān)體表面的活性中心，增加機(jī)械強(qiáng)度，用于分離醇、和酸類極性強(qiáng)的物質(zhì)，甲酸和甲醇會(huì)不可逆吸附，非極性物質(zhì)柱效低。（7） 色譜柱的制備過程：固定液的涂布柱管預(yù)處理柱子填裝及

10、老化老化的目的：除去填料中殘余溶劑及固定液中帶來的低分子聚合物。（8） 填充柱操作條件的選擇載氣：GC中的載氣有氮?dú)?、氦氣、氬氣、氫氣。FID檢測(cè)器時(shí)：普氮。ECD檢測(cè)器時(shí)：高純氮、氦氣。TCD檢測(cè)器時(shí)：氫氣及氦氣均可達(dá)到較高靈敏度。MSD檢測(cè)器時(shí)：氦氣。溫度:1、檢測(cè)器溫度至少比柱溫高30。以防柱中流出物在檢測(cè)器上凝結(jié)，污染檢測(cè)器。2、柱溫至少比固定液的最高使用溫度低30。以防固定液流失。3、柱溫降低，保留時(shí)間延長(zhǎng)，容量因子增加，分離可得到改善。4、氣化室溫度一般與檢測(cè)器溫度相同，若待測(cè)物不穩(wěn)定，則氣化室溫度應(yīng)設(shè)低一點(diǎn)。 5、柱溫一般比樣品中各組分平均沸點(diǎn)稍微低一些。3、氣-液色譜柱氣相色譜

11、法（1）氣-液色譜柱氣相色譜法中對(duì)擔(dān)體的要求；（2）使用前擔(dān)體的表面處理的原因及方法，其中擔(dān)體表面處理時(shí)釉化的目的是什么？（3）了解填充柱的制備過程，掌握填充柱的老化的目的、方法及注意事項(xiàng)。（4）掌握填充柱氣相色譜條件的選擇，重點(diǎn)是載氣和溫度的選擇。4.氣-固色譜與氣-液色譜的特點(diǎn)比較5. 毛細(xì)管柱氣相色譜法（1）掌握毛細(xì)管氣相色譜儀的流程示意圖（P47圖3-6，會(huì)畫出主要流程和標(biāo)出主要部件）（1）毛細(xì)管柱的柱管使用聚酰亞胺涂層的原因及作用。（2）交聯(lián)毛細(xì)管柱的特點(diǎn)及常用交聯(lián)方法，毛細(xì)管氣相色譜柱交聯(lián)引發(fā)劑主要有哪些？（3）毛細(xì)管柱進(jìn)樣方式，掌握分流及吹尾氣目的。（4）分流比及測(cè)定方法；線性分

12、流與非線性分流及影響樣品失真的因素。（5）分流進(jìn)樣法的優(yōu)缺點(diǎn)。第四章 氣相色譜檢測(cè)器FID 火焰離子化檢測(cè)器 是以氫氣在空氣(或氧氣)中燃燒生成的火焰為能源, 因而得名。為通用型檢測(cè)器。原理：通常在發(fā)射極上加+150V300V的電壓,則在噴口附近形成一個(gè)電場(chǎng)。來自色譜柱的載氣與氫氣與氧氣混合后，自噴口流出，與空氣相遇，為點(diǎn)火極(槍)所引燃。當(dāng)樣品組分出現(xiàn)在載氣中時(shí)，為氫火焰之高溫所離子化，形成正離子和負(fù)離子(或電子)。在電場(chǎng)作用下，正離子移向收集極，從而產(chǎn)生微電流信號(hào)，經(jīng)微電流放大器放大，由記錄儀記錄下來。也可在極化極加負(fù)電壓，則收集極收集為負(fù)離子流。性能特點(diǎn)：對(duì)含碳有機(jī)物有很高靈敏度。線型范

13、圍寬，達(dá)107。檢測(cè)器耐用，噪聲小，基線穩(wěn)定性好。死體積小，響應(yīng)快。對(duì)溫度變化不敏感。ECD電子捕獲檢測(cè)器為選擇型高靈敏度檢測(cè)器，它對(duì)具有高電負(fù)性的組分具有高靈敏度。主要用于檢測(cè)含鹵素的有機(jī)物及含硝基的有機(jī)物。對(duì)于含氧、硫、氮、磷、金屬的有機(jī)物也有信號(hào)。原理：3H放射源的使用溫度在220以下，63Ni放射源的使用溫度350以下。放射源產(chǎn)生射線，使載氣解離，由陽極收集電子，形成穩(wěn)定的基流。當(dāng)電負(fù)性組分進(jìn)入檢測(cè)器，捕獲了電子，從而使基流下降，產(chǎn)生信號(hào)。要求：載氣純度要高，不能用普氮。載氣需經(jīng)脫氧處理，以提高靈敏度。TCD熱導(dǎo)檢測(cè)器原理：基于載氣和樣品的導(dǎo)熱系數(shù)的差異，并用惠斯登電橋檢測(cè)。特點(diǎn)：為濃

14、度型通用檢測(cè)器。不破壞樣品，可串聯(lián)其它檢測(cè)器。載氣的熱導(dǎo)系數(shù)與被測(cè)物的熱導(dǎo)系數(shù)相差越大，靈敏度越高。靈敏度H2HeN2,故常用H2及He作載氣。熱敏元件的電阻值越大，靈敏度越高。熱絲與池體的溫度差值越大，越利于熱傳導(dǎo)，故采用低的池體溫度為好，但要以樣品不被冷凝沾污池體為限。橋電流越大越靈敏，但不同的載氣和不同的熱敏元件有不同的最高允許橋流，操作時(shí)要嚴(yán)格遵照儀器說明書。一般H2作載氣時(shí)用120180mA，N2 用80 mA。第五章 氣相色譜相關(guān)技術(shù)1.程序升溫色譜法 (Programmed temperature gas chromatography) 是指在一個(gè)分析周期里，色譜柱溫按預(yù)定的加熱

15、速度，隨時(shí)間線性或非線性的增加，則混合物中所有組分將在其最佳柱溫下流出色譜柱。（1）特點(diǎn)：可使低沸點(diǎn)組分與高沸點(diǎn)組分同時(shí)得到檢測(cè)；峰形尖銳，提高檢測(cè)靈敏度 ；省時(shí)；較快的趕走柱中雜質(zhì)峰，便于下一次分析。（2）主要方式及適用對(duì)象方式：線性升溫、非線性升溫。線型恒溫加熱、恒溫線性加熱、恒溫線性恒溫加熱、多階程序升溫加熱。適用：在分離多個(gè)性質(zhì)相差較大的待測(cè)組分時(shí)，用程序升溫GC法來分析樣品。當(dāng)柱溫較低時(shí)，低沸點(diǎn)組分最早流出并能得到良好分離，隨著柱溫的逐步升高，高沸點(diǎn)組分逐個(gè)流出，并能和低沸點(diǎn)組分一樣也能得到良好的尖峰保留溫度：在程序升溫中，某一樣品組分的濃度極大值流出色譜柱時(shí)的柱溫，稱為該組分的保留

16、溫度，以TR 表示。 2.頂空氣相色譜法是對(duì)液體或固體中的揮發(fā)性成分進(jìn)行氣相色譜分析的一種間接測(cè)定法。特點(diǎn)：樣品處理簡(jiǎn)單，取氣相部分進(jìn)行分析，大大減少了樣品基質(zhì)對(duì)于分析的干擾。頂空進(jìn)樣技術(shù)與氣相色譜定量分析相結(jié)合，能準(zhǔn)確進(jìn)行定量分析。通過優(yōu)化操作參數(shù)，提高靈敏度，可達(dá)到分析測(cè)試的要求。應(yīng)用范圍廣泛，適用于絕大多數(shù)揮發(fā)性氣體的分析。分類：靜態(tài)頂空氣相色譜：平衡頂空氣相色譜；動(dòng)態(tài)頂空氣相色譜：吹掃捕集法（2） 靜態(tài)頂空分析的原理及影響靜態(tài)頂空氣相色譜分析的因素將液體或固體樣品置于一個(gè)恒溫密閉的樣品容器中，使其中的揮發(fā)性成分逸出，在達(dá)到氣液或氣固平衡后，采集蒸氣相進(jìn)行氣相色譜分析。其基本理論依據(jù)是在

17、一定條件下氣相和凝聚相（液相或固相）之間存在著分配平衡，因此氣相的組成能反映凝聚相的組成。通過測(cè)定樣品基質(zhì)上方的氣體成分來測(cè)定這些組分在原樣品中的含量。影響因素：樣品的性質(zhì)、分配常數(shù)和平衡溫度、平衡時(shí)間、樣品瓶、（3） 動(dòng)態(tài)頂空分析的原理及動(dòng)態(tài)頂空法操作條件選擇把液體或者固體樣品置于樣品管中，向樣品管中通入惰性氣體(N2)，將待測(cè)組分吹掃出來，并使其通過裝有吸附劑的捕集管，被吸附劑吸附，然后將吸附劑加熱，使被測(cè)組分脫附，再用載氣將脫附的樣品氣體帶入氣相色譜儀中進(jìn)行分析。條件選擇：樣品吹掃溫度、捕集器溫度、連接管路的溫度、吹掃流速、吹掃氣的類型。比較：靜態(tài)頂空：儀器較簡(jiǎn)單，無需吸附裝置樣品基質(zhì)干

18、擾小揮發(fā)性樣品組分不會(huì)丟失可連續(xù)取樣分析靈敏度稍低對(duì)于較高沸點(diǎn)的組分較難分析動(dòng)態(tài)頂空：可將揮發(fā)性組分全部萃取出來，并在捕集裝置濃縮后進(jìn)行分析靈敏度較高應(yīng)用更廣泛，可分析沸點(diǎn)較高的組分樣品基質(zhì)可能干擾分析吸附和解吸可能造成樣品組分的丟失第六章 GC在藥物分析中的應(yīng)用1. 如何判斷待測(cè)物是否可以直接進(jìn)行GC分析A、對(duì)于分子量小于500的藥物，分子結(jié)構(gòu)中不含具有活潑氫的OH，NH2，NH，COOH，SO3H，SH，NHR ，CONH2，CONH，SO2NH2，SO2NH等極性官能團(tuán),并且對(duì)熱穩(wěn)定，一般均可采用GC法進(jìn)行分析。B、對(duì)于分子量小于200的小分子化合物，若分子結(jié)構(gòu)中含有以下五種極性官能團(tuán)：

19、 OH，NH2， SH，NHR，CONH2 ，但分子結(jié)構(gòu)中總的極性官能團(tuán)數(shù)目不超過兩個(gè)，并且對(duì)熱穩(wěn)定，則一般均可采用GC法進(jìn)行分析。 C、分子量小于500的中等極性化合物往往可以直接進(jìn)行GC分析。如硝苯地平、尼莫地平、尼群地平、尼索地平等地平類降壓藥、地西泮、硝西泮等西泮類安眠藥。2. 哪些化合物經(jīng)過衍生化后可以進(jìn)行GC分析含有羥基、羧基、氨基或酰胺基等極性基團(tuán)，糖類和氨基酸類化合物一般經(jīng)衍生化后可以進(jìn)行氣相色譜分析。目的：使難氣化的待測(cè)物變成一種新的具有一定揮發(fā)性的化合物，以適應(yīng)GC分離的要求。例如單糖的GC分析。降低待測(cè)物的極性，減小拖尾和吸附，改善其色譜性能。例如通過衍生化反應(yīng)來封閉羧基

20、等基團(tuán)，以消除待測(cè)物的拖尾現(xiàn)象。使待測(cè)物在特定檢測(cè)器上具備或提高檢測(cè)特性，以達(dá)到痕量分析的目的。例如引入氟原子，增加待測(cè)物的電子捕獲能力，提高電子捕獲檢測(cè)靈敏度等。如關(guān)附甲素的三氟乙?；?。改變樣品中被測(cè)組分或干擾組分的理化性質(zhì)，以改進(jìn)分離特性。在與其它儀器聯(lián)用技術(shù)中(如GC-MS)利用各類衍生化反應(yīng)以獲得更明確或特定的結(jié)構(gòu)信息。3. 當(dāng)待測(cè)物用GC法和HPLC法均可分析時(shí)應(yīng)如何選擇由于HPLC法的進(jìn)樣準(zhǔn)確度和精密度一般比GC法好，通常選擇準(zhǔn)確度和精密度較好的HPLC法。GC法則主要用于測(cè)定那些以沒有紫外吸收的或紫外吸收很弱的揮發(fā)油類成分為主成分或輔料的藥物制劑。在化學(xué)藥品、中成藥、中藥中間體和

21、中藥制品中的殘留溶劑的檢測(cè)方面一般采用GC法，因?yàn)镚C法中的FID和ECD檢測(cè)器對(duì)殘留溶劑的檢測(cè)響應(yīng)（靈敏度）要優(yōu)于HPLC的檢測(cè)器。1、 高效液相色譜儀的組成：流動(dòng)相及貯液罐、高壓輸液泵及梯度洗脫裝置、進(jìn)樣裝置、色譜柱、檢測(cè)器。 高效液相色譜儀組成 流動(dòng)相及貯液罐：1貯液罐 1材料應(yīng)耐腐蝕2容積約0.52.0L3使用過程中應(yīng)密閉4吸濾頭 2流動(dòng)相脫氣 1低壓脫氣法2吹氮脫氣法3超聲波脫氣法4真空脫氣法 高壓輸液泵及梯度洗脫裝置 進(jìn)樣裝置：注射器進(jìn)樣，六通閥進(jìn)樣，自動(dòng)進(jìn)樣器2、 高效液相色譜法與其他色譜法優(yōu)缺點(diǎn)比較；氣相色譜法：只能分析揮發(fā)性物質(zhì)或高溫可氣化的物質(zhì)、不適合于分析熱不穩(wěn)定的物質(zhì)、

22、用毛細(xì)管柱色譜可得到很高的柱效、載氣不影響分配，一般靠改變固定相或色譜柱溫度來改變選擇性、流動(dòng)相為氣體，無毒、樣品回收困難經(jīng)典液相色譜的比較：1高分離效能2快速，省時(shí)，省材料3靈敏度高，準(zhǔn)確度高氣象色譜比較：1幾乎可以分析各種物質(zhì)2實(shí)用與分析熱不穩(wěn)定物質(zhì)3色譜柱不如氣象色譜長(zhǎng)，柱效不如氣象色譜的毛細(xì)管高4固定相不如氣相色譜柱種類繁多，主要靠改變流動(dòng)相來改變選擇性5流動(dòng)相位有機(jī)溶劑，有毒6樣品可定量回收，也可用于制備4、 液固吸附色譜法的保留規(guī)律和主要應(yīng)用；一 液固吸附色譜法 液固吸附色譜法的分離原理：色譜分離基于吸附效應(yīng)的色譜法稱為吸附色譜，以固體吸附劑為固定相，以液體為流動(dòng)相的色譜法稱為液固

23、吸附色譜法。當(dāng)流動(dòng)相流過固定相時(shí)，樣品組分分子與流動(dòng)相分子競(jìng)爭(zhēng)吸附劑表面活性吸附中心，樣品中不同組分也競(jìng)爭(zhēng)吸附中心 液固吸附色譜法的固定相：1表面具有極性活性基團(tuán)2形狀適宜且粒徑分布均勻3多孔性且比表面積較大，載樣量大4化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定5機(jī)械強(qiáng)度高6價(jià)格合理 液固吸附色譜法的流動(dòng)相：主要為有機(jī)溶劑（如己烷，庚烷），某些有機(jī)溶劑（如甲醇，三乙胺）作為緩沖劑加入其中以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的溶劑強(qiáng)度，極性及PH值。流動(dòng)相極性越大，洗脫越強(qiáng)，溶質(zhì)保留越小。 二 液液分配色譜基于樣品組分在固定液和流動(dòng)相之間分配系數(shù)不同而分離的色譜法叫液液分配色譜。流動(dòng)相極性小于固定相的叫正相液液色譜，流動(dòng)相極性大于固定相的叫做反相液

24、液色譜一般規(guī)律： F化物Cl化物Br化物I化物； 順式幾何異構(gòu)體比反式幾何異構(gòu)體保留值大； 官能團(tuán)之間的分子內(nèi)氫鍵將使保留值減小； 極性基團(tuán)旁邊有龐大烷基存在時(shí)，保留值減??； 環(huán)己烷衍生物和甾體化合物的中位取代基比軸端取代基有更強(qiáng)的保留。 應(yīng)用：異構(gòu)體的分離、樣品預(yù)處理、制備色譜5、 化學(xué)鍵合相色譜的特點(diǎn)、分類和主要制備程序；一 化學(xué)鍵合相的特點(diǎn)和分類 特點(diǎn);1與液液分配色譜相比，使用過程中固定相不流失，耐溶劑沖洗2與液固吸附色譜相比，消除了擔(dān)體上的表面活性作用特點(diǎn)，清除了某些可能的催化活性3表面改性靈活，容易獲得重復(fù)性產(chǎn)品4化學(xué)性能穩(wěn)定，耐受范圍為PH28 5熱穩(wěn)定性好，一般在70 一下穩(wěn)定

25、6載樣量大7梯度洗脫平衡快 分類：1按鍵和相的表面結(jié)構(gòu)：?jiǎn)畏肿渔I合和聚合鍵合2按鍵合有機(jī)硅烷的官能團(tuán)：極性鍵和相，非極性鍵和相和離子交換鍵和相二 固定相的制備與性能評(píng)價(jià)制備：1所用的擔(dān)體材料應(yīng)有某種化學(xué)反應(yīng)活性2有機(jī)分子應(yīng)含有能與擔(dān)體表面發(fā)生反應(yīng)的官能團(tuán)性能評(píng)價(jià)：1微量元素分析或熱失重法：本法直接測(cè)定鍵和相的碳含量，表示方法 表面鍵合官能團(tuán)濃度，表面碳覆蓋率，有機(jī)官能團(tuán)的表面覆蓋率 2色譜法3光譜法三 非極性鍵合相 疏溶劑作用理論：1分子毛：非極性烷基鍵合相是在硅膠表面蒙覆了一層以Si-C鍵化學(xué)鍵合的十八烷基（或其他烴基）的分子毛2溶質(zhì)分子：溶質(zhì)分子=非極性部分+極性官能團(tuán)部分3疏溶劑效應(yīng)：當(dāng)

26、溶質(zhì)分子的非極性部分與極性溶劑接觸式，相互間產(chǎn)生斥力叫做“疏溶劑”。當(dāng)鍵合相表面的烷基與極性溶劑接觸時(shí)，相互間也產(chǎn)生斥力。當(dāng)溶質(zhì)分子的非極性部分與鍵合相表面的烷基接觸時(shí)，相互之間產(chǎn)生締合作用。這種締合是可逆的，其強(qiáng)弱決定了溶質(zhì)分子色譜保留的強(qiáng)弱。溶質(zhì)分子的極性部分與極性溶劑具有親和力。4溶質(zhì)保留值的影響因素：溶質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，烷基鍵合固定相特性，流動(dòng)相性質(zhì)，溫度 親硅醇基效應(yīng)：烷基鍵合相表面往往還有殘留硅醇基，這是一種微量酸性的基團(tuán)，可與溶質(zhì)陽離子或氫鍵基團(tuán)相互作用。 流動(dòng)相的設(shè)計(jì)：1首選原則2多元溶劑3洗脫能力的選擇4替代溶劑5離子抑制色譜法。四 非極性鍵合相填料的新進(jìn)展 空間保護(hù)鍵合相：由于在

27、C18烷基側(cè)鏈引入較大的官能團(tuán)以及立體效應(yīng)，阻礙了硅烷基于分析物的相互作用，他在PH=7時(shí)對(duì)堿性化合物的分離，呈現(xiàn)對(duì)稱峰形并有很好的柱效，在低PH值時(shí)有較高水解穩(wěn)定性 雙齒鍵合固定相：其環(huán)狀結(jié)構(gòu)無論在低PH值還是高PH值條件下均顯示了較高穩(wěn)定性，滿意的柱效和色譜行為 內(nèi)嵌極性基團(tuán)鍵合固定相：極性官能團(tuán)嵌入鍵合相的技術(shù)是改善固定相和水溶液兼容能力的一個(gè)途徑，對(duì)堿性化合物展現(xiàn)出良好的對(duì)稱峰形，有時(shí)可以表現(xiàn)不同的選擇性。 硅碳雜化硅膠：這種填料發(fā)揮了硅膠與聚合物基質(zhì)填料的優(yōu)勢(shì)，為研究者優(yōu)化分離速度，分離度，PH選擇性，色譜柱壽命及上樣量提供了強(qiáng)有力的工具。 其他：以氧化鋯為基質(zhì)的鍵和相，聚合物包覆法

28、五 極性鍵和相 將極性官能團(tuán)鍵合到載體上，構(gòu)成極性鍵和相。以極性鍵合相為固定相的色譜法稱作極性鍵和相色譜法。適用于分離極性和強(qiáng)極性的化合物。六 離子交換鍵合相 分離機(jī)理：陽離子交換，陰離子交換 保留規(guī)律：1陰離子交換分離有機(jī)酸，陽離子交換分離有機(jī)堿2離子強(qiáng)度增加，k'減少。原因是離子交換平衡的移動(dòng)3有機(jī)改性劑對(duì)保留的影響 如果洗脫液中加入極性有機(jī)組分則抑制離子交換，并且產(chǎn)生按分配機(jī)理進(jìn)行的分離。6、 非極性鍵合相色譜的保留機(jī)制和保留規(guī)律；雙保留機(jī)理：溶質(zhì)的保留值應(yīng)包括兩部分的貢獻(xiàn)，即疏溶劑效應(yīng)和親硅醇基效應(yīng)。親硅醇基效應(yīng)：烷基鍵合相表面往往還有殘余硅醇基，這是一種微量酸性的基團(tuán)，可與溶

29、質(zhì)陽離子或氫鍵基團(tuán)相互作用，主要影響含氮類藥物的分離，造成色譜峰拖尾，柱效下降。7、 離子對(duì)色譜法的保留機(jī)制和應(yīng)用；在化學(xué)鍵合的有機(jī)硅烷分子中帶上固定的離子交換基團(tuán)，便成了離子交換鍵合相。保留規(guī)律：陰離子交換劑分離有機(jī)酸，pH越小，酸的解離被抑制，保留越小。在用強(qiáng)陰離子交換鍵合相分離酸性藥物時(shí)，pka值越小，保留時(shí)間陽離子交換劑分離有機(jī)堿：在用強(qiáng)陽離子交換鍵合相分離堿性藥物時(shí)，pH游離堿，保留時(shí)間。pH高，堿以分子形式存在，保留值很小。8、 分離極性化合物可供選擇的主要分離模式；9、 分子排阻色譜法的分離原理；分析：多肽、蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子、高聚物。原理：具有不同分子大小的樣品通過柱時(shí)，

30、溶質(zhì)分子能夠被柱填料的孔徑分類。10、 超高效液相色譜分離的主要優(yōu)勢(shì)；比HPLC更高的分離度、比HPLC更高的分析速度、比HPLC更高的靈敏度、應(yīng)用：體內(nèi)藥物分析、中藥分析、代謝組學(xué)分析及其它一些生化領(lǐng)域 先導(dǎo)化合物的篩選 蛋白質(zhì)組學(xué)研究 天然產(chǎn)物的分析第十章，手性高效液相色譜法1 手性藥物的定義（名詞解釋類）；手性藥物是指由具有藥理活性的手性化合物組成的藥物，其中只含有效對(duì)映體或者以含有效的對(duì)映體為主。 2 手性衍生化試劑拆分原理及衍生化反應(yīng)的要求（簡(jiǎn)答類）；光學(xué)活性藥物與有高光學(xué)純度的手性試劑于分離前衍生化，在藥物對(duì)映體中引入另外一個(gè)手性，形成非對(duì)映異構(gòu)體，再以HPLC分析。衍生化要求：胺

31、基類手性藥物 ：運(yùn)用異硫氰酸酯（ITC）、異氰酸酯（IC）類、手性酰氯、磺酰氯類試劑，將其衍生化為酰胺、氨基甲酸酯、脲、硫脲和磺酰胺 。羧基類手性藥物 ：運(yùn)用手性胺類衍生化試劑，將其衍生化為酯和酰胺 。醇類手性藥物 ：運(yùn)用手性酰氯、磺酰氯類試劑 ，將其衍生化成酯 。烯類手性藥物 ：衍生化成水性鉑復(fù)合物 。3 簡(jiǎn)述常見手性固定相的種類；（簡(jiǎn)答類）；吸附性：蛋白質(zhì)類反向，防止有機(jī)溶劑、多糖衍生物類正向防水、環(huán)糊精類正反均可電荷轉(zhuǎn)移型第十二章，高效液相色譜檢測(cè)器4 理想檢測(cè)器應(yīng)具備的特點(diǎn)（填空類）適用范圍廣、線性范圍寬、靈敏度高、響應(yīng)快，能精確將流出物轉(zhuǎn)換成電信號(hào)、對(duì)樣品無破壞性、死體積小，不引起柱

32、外譜帶擴(kuò)展、可靠、重現(xiàn)性好，不受溫度和流動(dòng)相流速變化、噪音低、漂移小，對(duì)流動(dòng)相組成變化不敏感。5 列舉常見的高效液相檢測(cè)器的種類及其特點(diǎn)（簡(jiǎn)答類）紫外吸收檢測(cè)器UVD:濃度型、靈敏度高噪音低、選擇性型、不受溫度和流動(dòng)相組成的影響、非破壞型。熒光檢測(cè)器FD：高靈敏度、高選擇性、應(yīng)用沒有紫外廣泛、干擾因素多，如熒光淬滅、背景熒光。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ELSD：通用型檢測(cè)器、對(duì)流動(dòng)相組成變化不敏感，適合梯度洗脫。、流動(dòng)相組成應(yīng)是揮發(fā)性的、靈敏度比紫外檢測(cè)器要低、色譜響應(yīng)與其質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成正比。電化學(xué)檢測(cè)器ECD：靈敏度高F選擇性高、線性范圍寬示差折光檢測(cè)器RID：通用型檢測(cè)器、濃度型檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)

33、器的檢測(cè)限一般為10-6 g/ml 10-7 g/ml，線性范圍一般都小于105、靈敏度低、對(duì)外界環(huán)境變化很敏感，溫度、壓力、濃度、流速等，不能用于梯度洗脫。6 光電二極管陣列檢測(cè)器的主要應(yīng)用和原理（簡(jiǎn)答或填空類）光電二極管陣列紫外檢測(cè)器DAD、PDA、PDAD：主要特點(diǎn)是用光電二極管陣列同時(shí)接受來自流通池的全光譜透過光。特點(diǎn):同時(shí)得到多個(gè)波長(zhǎng)的色譜圖，因此可以計(jì)算不同波長(zhǎng)處相對(duì)吸光度比?？梢赃x擇整個(gè)波長(zhǎng)范圍的寬譜帶檢測(cè)，僅需一次進(jìn)樣，將所有組分檢測(cè)出來。在色譜運(yùn)行期間可以對(duì)每個(gè)色譜峰的指定位置實(shí)時(shí)記錄吸收光譜圖，并計(jì)算其最大吸收波長(zhǎng)。同時(shí)逐點(diǎn)進(jìn)行光譜掃描，得到時(shí)間-波長(zhǎng)-吸光度三維圖形。應(yīng)用

34、：1. 色譜峰的純度檢查、2. 色譜峰的鑒別、3. 譜帶寬度檢測(cè)4.峰抑制5. 選擇最佳波長(zhǎng)7 分子熒光原理和熒光檢測(cè)器的特點(diǎn)（簡(jiǎn)答或填空類）原理：利用某些溶質(zhì)在受紫外光激發(fā)后，能發(fā)射可見光（熒光）的性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。特點(diǎn)：1）高靈敏度：最小檢測(cè)限比紫外檢測(cè)法低一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。2）高選擇性：優(yōu)于紫外檢測(cè)法或至少一樣不足：應(yīng)用沒有紫外廣泛，措施：與熒光試劑反應(yīng)生成熒光衍生物；干擾因素多，如熒光淬滅、背景熒光8 常見電化學(xué)檢測(cè)器的特點(diǎn)安培檢測(cè)器、極譜檢測(cè)器、庫侖檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器特點(diǎn)：工作電壓對(duì)檢測(cè)靈敏度影響最為關(guān)鍵。靈敏度高，最小檢測(cè)限可達(dá)10-910-12g；選擇性高，一般只對(duì)電活性物質(zhì)有響應(yīng)，可

35、氧化化合物包括酚、二羥基、過氧化物等；可還原化合物包括酮、醛、共軛不飽和化合物等，線性范圍寬，一般104 105。十三章 高效液相色譜法相關(guān)操作技術(shù)一、藥物的衍生化高效液相色譜法（一）藥物衍生化的目的：1、減小前處理難度或增減穩(wěn)定性2、改善色譜分離3、提高檢測(cè)性能4、擴(kuò)大色譜分析的應(yīng)用范圍 意義：衍生化技術(shù)在高效液相色譜中應(yīng)用較多，尤其在生物樣品中的藥物及其代謝物或內(nèi)源性物質(zhì)的色譜分析中，由于樣品機(jī)制復(fù)雜，待測(cè)組分含量很低，因此化學(xué)衍生化具有更重要的意義。許多化合物經(jīng)過衍生化反應(yīng)后才能進(jìn)行紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)或?qū)崿F(xiàn)光學(xué)異構(gòu)體分離（二）HPLC方法建立的步驟：1、樣品的性質(zhì)和分離目的2、樣品的

36、前處理方法的選擇3、檢測(cè)器的選擇4、選擇優(yōu)化色譜分析條件5衍化物質(zhì)一定量分析一定性分析6、方法學(xué)的引用證明 衍生化HPLC方式：1、柱前衍生化：改善色譜分離，復(fù)雜樣品衍生化難度大2、柱后衍生化：有利于復(fù)雜樣品的衍生化分析，不改善色譜分離，反而可能造成峰展寬3、紫外衍生化反應(yīng)：氨基酸的紫外衍生化試劑，熒光衍生化反應(yīng)：胺類和氨基酸的熒光衍生化試劑常用衍生化反應(yīng)的種類及試劑 及優(yōu)缺點(diǎn) 一 紫外衍生化標(biāo)記反應(yīng)：異硫氰酸苯酯（PITC）優(yōu)點(diǎn)：與一、二級(jí)氨基酸都可以反應(yīng)，穩(wěn)定，衍生副產(chǎn)物對(duì)測(cè)定無干擾，紫外檢測(cè)。缺點(diǎn)須去除衍生試劑，樣品制備需較長(zhǎng)時(shí)間，PITC毒性大，靈敏度較低 丹酰氯（DNSCI）優(yōu)點(diǎn)：反

37、應(yīng)迅速可檢測(cè)形式多，剩余衍生試劑不需除去可與二級(jí)氨基酸反應(yīng)衍生物較穩(wěn)定，缺點(diǎn)水解產(chǎn)物也可以發(fā)射強(qiáng)熒光，干擾測(cè)定反應(yīng)要在避光條件下進(jìn)行，專屬性差；二 熒光衍生化標(biāo)記反應(yīng)：鄰苯二甲醛（OPA）優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)迅速，可檢測(cè)形式多，試劑不發(fā)熒光，缺點(diǎn)：不能與二級(jí)氨基酸直接反應(yīng)，衍生物不穩(wěn)定；三電化學(xué)二、梯度洗脫定義：色譜分離過程中，流動(dòng)相中有機(jī)相比例或離子強(qiáng)度、PH值不斷改變的洗脫方式 目的：適用于保留范圍寬的多組分復(fù)雜樣品 應(yīng)用特點(diǎn)1）解決組分k值差距過大對(duì)分離帶來的困難2）解決組分在色譜柱上殘留問題3）進(jìn)樣量體積較大時(shí)產(chǎn)生峰展寬4）改善峰形 洗脫的方式：1）線性梯度2）曲線梯度3）分段梯度，在開始一段時(shí)

38、間內(nèi)，使用洗脫能力較弱的流動(dòng)相，隨著流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度增加，色譜保留較強(qiáng)的組分較快被洗脫 梯度洗脫方法的建立步驟：預(yù)實(shí)驗(yàn)方式選擇梯度范圍調(diào)整分離度十四章 毛細(xì)管電泳法CE基本裝置：毛細(xì)管及溫度系統(tǒng)、控制系統(tǒng)、電路系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)等基本原理：電泳和電滲 電泳：在電解質(zhì)溶液中，帶電離子在電場(chǎng)中的定向移動(dòng) 影響電滲流因素：1、電場(chǎng)強(qiáng)度的影響，其速度和電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長(zhǎng)度一定時(shí)，電滲流速度正比于工作電壓2、毛細(xì)管材料的影響3、緩沖溶液的影響 加大緩沖液濃度，溶液離子強(qiáng)度增大，使溶液的粘度增大，電滲流速度減小4、溫度十六章 定性定量分析方法及其驗(yàn)證一） 準(zhǔn)確度（accuracy）是指測(cè)定值與真實(shí)值或參考值接近的程度二） 精密度（precision）是指在規(guī)定的測(cè)試條件下同一均勻樣本多次進(jìn)樣測(cè)定所得一系列測(cè)定