《核酸的生物化學(xué)》ppt課件

1、核酸的生物化學(xué)核酸的生物化學(xué)李金明 衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心核酸核酸(Nucleic acid)?l愚笨的分子愚笨的分子? ?l核苷酸的簡(jiǎn)單陳列核苷酸的簡(jiǎn)單陳列蛋白質(zhì)的豐富多彩蛋白質(zhì)的豐富多彩A是是B的的DNAl這里這里B不是生物體不是生物體lA不是不是DNAl這句話想說的是這句話想說的是:A是是B的本質(zhì)、的本質(zhì)、精華精華核酸研討的歷史核酸研討的歷史核酸研討的歷史核酸研討的歷史 不久，科塞爾不久，科塞爾Albrecht Kossel發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)“核素核素是蛋白和核酸的復(fù)合物，并明確了核酸各組是蛋白和核酸的復(fù)合物，并明確了核酸各組成成分的比例成成分的比例(核酸化學(xué)領(lǐng)域的第一縷曙光核酸化學(xué)領(lǐng)域的第一縷曙光)

2、 Friedrich Miescher Albrecht Kossel (獲獲1910年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng))1869 米舍爾米舍爾Friedrich Miescher 從膿球分別出細(xì)胞核，從膿球分別出細(xì)胞核，不受蛋白酶分解，磷含量高，不受蛋白酶分解，磷含量高，命名為命名為“核素核素 (nuclein)核酸研討的歷史核酸研討的歷史1911 科塞爾的學(xué)生萊文科塞爾的學(xué)生萊文(P.A.T. Levine證明核酸中所含的證明核酸中所含的糖由糖由5個(gè)碳原子所組成，命名為核糖闡明了胸腺組織和個(gè)碳原子所組成，命名為核糖闡明了胸腺組織和酵母中分別到的核酸的不同酵母中分別到的核酸的不同,前者

3、為脫氧核糖核酸前者為脫氧核糖核酸(DNA), 后者為核糖核酸后者為核糖核酸RNA。 核酸研討的歷史核酸研討的歷史1934 萊文發(fā)現(xiàn)核酸可被分解成含有一個(gè)嘌萊文發(fā)現(xiàn)核酸可被分解成含有一個(gè)嘌 呤或嘧啶、一個(gè)核糖或脫氧核糖和一個(gè)磷酸呤或嘧啶、一個(gè)核糖或脫氧核糖和一個(gè)磷酸的片段，這樣的組合叫的片段，這樣的組合叫“核苷酸。核苷酸。 他們根據(jù)當(dāng)時(shí)比較粗糙的分析以為，他們根據(jù)當(dāng)時(shí)比較粗糙的分析以為，4種堿基種堿基 在核酸中的量相等，從而錯(cuò)誤地推導(dǎo)出核酸在核酸中的量相等，從而錯(cuò)誤地推導(dǎo)出核酸的根本構(gòu)造是由的根本構(gòu)造是由4個(gè)含不同堿基的核苷酸銜接個(gè)含不同堿基的核苷酸銜接成四核苷酸，以此為根底聚合成核酸，這就成四

4、核苷酸，以此為根底聚合成核酸，這就是較著名的是較著名的“四核苷酸假說。四核苷酸假說。核酸研討的歷史核酸研討的歷史 1944 美國(guó)微生物學(xué)家埃弗里美國(guó)微生物學(xué)家埃弗里O.T. Avery 等的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)等的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) O.T. AVERY核酸研討的歷史核酸研討的歷史Erwin Chargaff1950 查伽夫查伽夫Erwin Chargaff et al- Chargaff法那么法那么 核酸研討的歷史核酸研討的歷史1952 赫爾希和蔡斯赫爾希和蔡斯HERSHEY, CHASE-噬菌體標(biāo)志實(shí)驗(yàn)噬菌體標(biāo)志實(shí)驗(yàn) Alfred Hershey and Martha Chase核酸研討的歷史核

5、酸研討的歷史l1953 沃森和克里克沃森和克里克WATSON，CRICK-DNA雙螺旋雙螺旋Francis Crick and James Watson (獲獲1962年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng))Maurice Hugh Frederick WilkinsRosalind Franklin為什么是這兩個(gè)年輕人？為什么是這兩個(gè)年輕人？l沃森：生物學(xué)，研討噬菌體l克里克：物理學(xué)、化學(xué)l不是由于勤勞成果平平，而是由于其獨(dú)有的想像力。沃森和克里克卻是“站在巨人的腳趾上 -布拉格在為寫序時(shí)，戲稱他們。 我之所以可以看得更遠(yuǎn)，是由于我站在巨人的肩膀上。 - 牛頓“由于他們連跑上巨人的肩膀上功

6、夫都沒花核酸研討的歷史核酸研討的歷史l1955 托德托德(Alexander Robertus Todd)用用磷酸三酯法合成了二磷酸三酯法合成了二核苷酸核苷酸TpTl 這是人工合成這是人工合成DNA大分子的前奏大分子的前奏Alexander Robertus Todd(獲獲1957年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))核酸研討的歷史核酸研討的歷史 1960年代中期年代中期 桑格桑格(Sanger)的的DNA測(cè)序法測(cè)序法 Frederick Sanger(獲1958和1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))核酸研討的歷史核酸研討的歷史1972 伯格伯格(Paul Berg) 重組重組DNA技術(shù)技術(shù) 引起人腫瘤的猴病毒基

7、因與引起人腫瘤的猴病毒基因與噬菌體噬菌體lambda的重組的重組 1973 博耶博耶Herbert Boyer和科和科恩恩Stanley Cohen-運(yùn)用重運(yùn)用重組組DNA技術(shù)初次得到了重組技術(shù)初次得到了重組DNA微生物微生物(基因工程技術(shù)基因工程技術(shù)) Paul Berg (獲獲1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))Herbert Boyer and Stanley Cohen核酸研討的歷史核酸研討的歷史1983 穆利斯穆利斯Kary Mullis) PCR技術(shù)技術(shù)核酸研討的歷史核酸研討的歷史l1990 Human Genome Project 后基因組時(shí)代后基因組時(shí)代-基因組學(xué)基因組學(xué)l功

8、能基因組學(xué)功能基因組學(xué)l 研討的中心問題有：研討的中心問題有：基因組的多樣性基因組的多樣性SNP、藥物基因組學(xué)；基因藥物基因組學(xué)；基因組的表達(dá)及其時(shí)空調(diào)理組的表達(dá)及其時(shí)空調(diào)理基因芯片、蛋白質(zhì)組基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)等；方式生物基因?qū)W等；方式生物基因組研討基因剔除等組研討基因剔除等后基因組時(shí)代后基因組時(shí)代-基因組學(xué)基因組學(xué)l構(gòu)造基因組學(xué)構(gòu)造基因組學(xué)l 構(gòu)造基因組學(xué)，是由構(gòu)造生物學(xué)與構(gòu)造基因組學(xué)，是由構(gòu)造生物學(xué)與功能基因組學(xué)嚴(yán)密結(jié)合所產(chǎn)生的，其功能基因組學(xué)嚴(yán)密結(jié)合所產(chǎn)生的，其科學(xué)目的就是要規(guī)?；販y(cè)定蛋白質(zhì)、科學(xué)目的就是要規(guī)?；販y(cè)定蛋白質(zhì)、RNA及其它生物大分子的三維構(gòu)造。及其它生物大分子的三維構(gòu)

9、造。 核酸的種類核酸的種類 DEOXYRIBONUCLEIC ACIDDNA RIBONUCLEIC ACIDRNA ribosome RNA(rRNA) transfer RNA(tRNA) messenger RNA(mRNA)核酸的分布核酸的分布 DNA RNA 核核% 98 90核酸的含量核酸的含量lDNA恒定恒定lRNA與細(xì)胞生長(zhǎng)形狀有關(guān)與細(xì)胞生長(zhǎng)形狀有關(guān)核酸的功能核酸的功能lDNA-遺傳遺傳lRNA-參與蛋白質(zhì)合成參與蛋白質(zhì)合成核酸的分子組成核酸的分子組成l元素組成元素組成l C H O N P 恒定，恒定，910%l根本構(gòu)造單位根本構(gòu)造單位核苷酸核苷酸l n核苷酸核苷酸nucle

10、otide) 核酸核酸多聚核苷酸多聚核苷酸polynucleotides)磷酸磷酸核苷核苷nucleoside) 戊糖戊糖-ribose(R) deoxyribose(dR) 堿基堿基 A G U C A G T CDNA、RNA組成異同組成異同RNADNA 戊糖核糖脫氧核糖Adenine (A)Adenine (A) 堿基 Cytosine (C)Cytosine (C)Uracil (U)Thymine (T)Guanine (G)Guanine (G) 鏈的數(shù)量常為單鏈雙鏈 熱穩(wěn)定性?不穩(wěn)定穩(wěn)定核糖和磷酸核糖和磷酸DeoxyribosePhosphoric AcidO核苷、核苷酸核苷、核

11、苷酸其它核苷酸其它核苷酸:NAD(輔酶輔酶I)、FAD(黃黃素腺嘌呤二核苷酸素腺嘌呤二核苷酸)、cAMP、cGMP、5-FU、6-MPl2、3、5NMP(一磷酸核苷一磷酸核苷)， 3、5dNMP， 主要是主要是5NMP、dNMP，DNARNA組成組成l NTPdNTP NDPdNDP 多磷酸核苷酸，能多磷酸核苷酸，能量代謝量代謝l環(huán)核苷酸環(huán)核苷酸 cAMP、cGMP 第二信使第二信使lNADNADP FADFMN 輔酶，生物氧化輔酶，生物氧化l抗代謝藥物抗代謝藥物 6MP，5-FU核酸的分子構(gòu)造核酸的分子構(gòu)造核酸的一級(jí)構(gòu)造核酸的一級(jí)構(gòu)造5 end3 end核苷酸的銜接核苷酸的銜接3,5磷酸二酯

12、磷酸二酯鍵鍵表示法表示法 pCpCpA pC-C-A 5-CCA-3DNA的分子構(gòu)造的分子構(gòu)造lDNA的堿基組成的堿基組成CHARGAFF法那么法那么l 有種屬特異性有種屬特異性l 無組織、器官特異性無組織、器官特異性l 不受年齡、營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境的影響不受年齡、營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境的影響l 不論種屬、組織來源，一切不論種屬、組織來源，一切DNA分子分子l A T、G Cl A/T G/C 1l A + G T + CDNA 的分子構(gòu)造的分子構(gòu)造Hydrogen BondsCytosineAdenineThymineGuanineDeoxyribose(Sugar molecule)Phosphoric Ac

13、id(Phosphate molecule)DNA的二級(jí)構(gòu)造的二級(jí)構(gòu)造雙螺旋構(gòu)造雙螺旋構(gòu)造lWatson, Crick 1953在在Chargaff法那么及法那么及Wilkins,Franklin的的X線衍射任務(wù)根底上提出線衍射任務(wù)根底上提出DNA的的double helix構(gòu)造模型構(gòu)造模型lDNA分子由相互平行、走向相反、堿基互補(bǔ)的兩條分子由相互平行、走向相反、堿基互補(bǔ)的兩條脫氧核糖核苷酸鏈圍繞同一中心軸，環(huán)繞成雙螺旋脫氧核糖核苷酸鏈圍繞同一中心軸，環(huán)繞成雙螺旋構(gòu)造，螺旋的一側(cè)為大溝，另一側(cè)為小溝。構(gòu)造，螺旋的一側(cè)為大溝，另一側(cè)為小溝。l 磷酸磷酸脫氧核糖構(gòu)成的長(zhǎng)鏈骨架在外，堿基在脫氧核糖構(gòu)

14、成的長(zhǎng)鏈骨架在外，堿基在內(nèi)，兩平行鏈對(duì)應(yīng)堿基間以氫鍵相連；對(duì)應(yīng)堿基總內(nèi)，兩平行鏈對(duì)應(yīng)堿基間以氫鍵相連；對(duì)應(yīng)堿基總是是A=T、G = C配對(duì)配對(duì)base pairing)或互補(bǔ)，構(gòu)或互補(bǔ)，構(gòu)成穩(wěn)定聯(lián)絡(luò)。成穩(wěn)定聯(lián)絡(luò)。l 各堿基平面垂直或根本垂直于雙螺旋中心軸，鏈各堿基平面垂直或根本垂直于雙螺旋中心軸，鏈內(nèi)堿基間構(gòu)成縱向內(nèi)堿基間構(gòu)成縱向Vander Waals力與長(zhǎng)軸平行，使力與長(zhǎng)軸平行，使雙螺旋更穩(wěn)定。雙螺旋更穩(wěn)定。l 相臨堿基對(duì)間間隔為相臨堿基對(duì)間間隔為0.34nm,每周螺距為每周螺距為3.4nm (10bp), d為為 2nm (B型型DNA double helix類型類型 helix ty

15、pe bp/turn rotation/bp vertical rise/bp helical d A 11 +34.7 2.56A 23A B 10 +34.0 3.38A 19A C 9.33 +38.6 3.32A 19A Z 12 -30.0 5.71A 18ADNA的高級(jí)構(gòu)造的高級(jí)構(gòu)造l超螺旋超螺旋 如線粒體如線粒體DNAl細(xì)菌質(zhì)粒細(xì)菌質(zhì)粒DNAl病毒病毒DNAl l DNA的高級(jí)構(gòu)造的高級(jí)構(gòu)造l 核小體構(gòu)造：由核小體構(gòu)造：由DNA和和組蛋白共同構(gòu)成組蛋白共同構(gòu)成 2 (H2AH2B H3 H4 )/DNA(146bp) =中心顆中心顆粒粒l超螺線管超螺線管染色質(zhì)：染色質(zhì)：由中心顆粒

16、與銜接區(qū)構(gòu)由中心顆粒與銜接區(qū)構(gòu)成的核小體彼此串聯(lián)，成的核小體彼此串聯(lián)，成串珠狀，再進(jìn)一步卷成串珠狀，再進(jìn)一步卷曲，構(gòu)成超螺線管構(gòu)造曲，構(gòu)成超螺線管構(gòu)造。RNA的分子構(gòu)造的分子構(gòu)造lRNA的種類：的種類：tRNA、rRNA、mRNAlRNA的堿基組成：的堿基組成： A U G C 稀有堿基假稀有堿基假尿嘧啶、甲基化堿基尿嘧啶、甲基化堿基 lRNA的一級(jí)構(gòu)造：核苷酸序列的一級(jí)構(gòu)造：核苷酸序列 3,5磷酸二磷酸二酯鍵銜接酯鍵銜接lRNA高級(jí)構(gòu)造高級(jí)構(gòu)造 tRNA的構(gòu)造的構(gòu)造 一級(jí)構(gòu)造一級(jí)構(gòu)造 7090 nt 二級(jí)構(gòu)造二級(jí)構(gòu)造 三葉草外形：三葉草外形： 特點(diǎn)特點(diǎn)1氨基酸臂：氨基酸臂：3CCA-OH構(gòu)造

17、可與活化構(gòu)造可與活化的氨基酸結(jié)合。的氨基酸結(jié)合。2DHU環(huán)二氫尿嘧啶。環(huán)二氫尿嘧啶。3反密碼環(huán)：可與反密碼環(huán)：可與mRNA中三聯(lián)體構(gòu)成反密中三聯(lián)體構(gòu)成反密碼子，在蛋白合成中起解碼子，在蛋白合成中起解讀密碼子，將對(duì)應(yīng)氨基酸讀密碼子，將對(duì)應(yīng)氨基酸引入合成位點(diǎn)的作用。引入合成位點(diǎn)的作用。4 T環(huán)：含胸腺嘧環(huán)：含胸腺嘧啶核苷和假尿嘧啶核苷為啶核苷和假尿嘧啶核苷為特征。特征。5額外環(huán)：是額外環(huán)：是tRNA分類的標(biāo)志分類的標(biāo)志 三級(jí)構(gòu)造三級(jí)構(gòu)造 倒倒“L形形ACCDHU環(huán)環(huán)T環(huán)環(huán)反密碼環(huán)反密碼環(huán)5額外環(huán)額外環(huán)mRNA的構(gòu)造的構(gòu)造l3-poly A(30200)，為，為mRNA的的“尾尾l5-7甲基鳥苷三磷

18、酸，為甲基鳥苷三磷酸，為mRNA的的“帽帽l分子中有編碼區(qū)和非編碼區(qū)。中間為密碼子分子中有編碼區(qū)和非編碼區(qū)。中間為密碼子 Codon。這些三聯(lián)體密碼子決議蛋白質(zhì)的一級(jí)。這些三聯(lián)體密碼子決議蛋白質(zhì)的一級(jí)構(gòu)造構(gòu)造核酸的理化性質(zhì)：含量和分子大核酸的理化性質(zhì)：含量和分子大小小l細(xì)胞中核酸含量依種屬及組織而定，如酵母含細(xì)胞中核酸含量依種屬及組織而定，如酵母含0.1%，肌肉組織及細(xì)菌含，肌肉組織及細(xì)菌含0.5% 1%，在胸腺，在胸腺及精細(xì)胞中，含量高達(dá)及精細(xì)胞中，含量高達(dá)1540%。l分子大小可用長(zhǎng)度、鹼基對(duì)數(shù)目及分子量表示。分子大小可用長(zhǎng)度、鹼基對(duì)數(shù)目及分子量表示。長(zhǎng)長(zhǎng)1m的的DNA含含3000鹼基對(duì)，

19、相當(dāng)于分子量鹼基對(duì)，相當(dāng)于分子量為為2106 daltons。lDNA分子大小測(cè)定的經(jīng)典方法：超速離心測(cè)分子大小測(cè)定的經(jīng)典方法：超速離心測(cè)沉降系數(shù)沉降系數(shù)S核酸的理化性質(zhì)：酸性化合物核酸的理化性質(zhì)：酸性化合物l兩性兩性但酸性強(qiáng)：但酸性強(qiáng)：DNA、RNA在其多核苷酸鏈內(nèi)既有酸性在其多核苷酸鏈內(nèi)既有酸性的磷酸基又有堿性的含氮雜環(huán)堿，因此核酸與蛋白質(zhì)一樣，的磷酸基又有堿性的含氮雜環(huán)堿，因此核酸與蛋白質(zhì)一樣，也是兩性電解質(zhì)。因磷酸基的酸性較強(qiáng)故通常核酸表現(xiàn)也是兩性電解質(zhì)。因磷酸基的酸性較強(qiáng)故通常核酸表現(xiàn)為酸性。為酸性。l電泳行為電泳行為泳向正極泳向正極pH7-8：在中性或堿性溶液中，：在中性或堿性溶液

20、中，核酸帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向陽極挪動(dòng)。核酸帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向陽極挪動(dòng)。 l沉淀行為沉淀行為加鹽中和電荷加鹽中和電荷 M+與磷酸與磷酸“-中和；乙中和；乙醇：帶負(fù)電荷的核酸可與金屬離子成鹽。當(dāng)向核酸溶液中醇：帶負(fù)電荷的核酸可與金屬離子成鹽。當(dāng)向核酸溶液中參與適當(dāng)鹽溶液后，帶正電荷的金屬離子即可將核酸的負(fù)參與適當(dāng)鹽溶液后，帶正電荷的金屬離子即可將核酸的負(fù)離子中和，在有乙醇或異丙醇存在時(shí)核酸即可從溶液中沉離子中和，在有乙醇或異丙醇存在時(shí)核酸即可從溶液中沉淀析出。制備核酸時(shí)常用的鹽溶液有氯化鈉、醋酸鈉、醋淀析出。制備核酸時(shí)常用的鹽溶液有氯化鈉、醋酸鈉、醋酸鉀或醋酸銨。酸鉀或醋酸銨。核

21、酸的理化性質(zhì)：降解核酸的理化性質(zhì)：降解l酸水解：酸水解：DNA較較RNA更敏感，更敏感，N糖苷鍵斷裂，糖苷鍵斷裂，嘌呤鹼比嘧啶鹼更不穩(wěn)定嘌呤鹼比嘧啶鹼更不穩(wěn)定l鹼水解：鹼水解：DNA對(duì)鹼穩(wěn)定，鹼水解多用于對(duì)鹼穩(wěn)定，鹼水解多用于RNA。鹼使鹼使RNA分子中磷酸二酯鍵的磷酸與分子中磷酸二酯鍵的磷酸與C-5酯酯鍵水解斷裂，生成鍵水解斷裂，生成2核苷酸與核苷酸與3核苷酸的混核苷酸的混合物。合物。l酶降解：內(nèi)切酶胰酶降解：內(nèi)切酶胰DNase I)、外切酶蛇毒、外切酶蛇毒磷酸二酯酶磷酸二酯酶核酸的理化性質(zhì)：高分子性質(zhì)核酸的理化性質(zhì)：高分子性質(zhì)l粘度粘度 DNARNAl 核酸的分子量很大，核酸溶液具有較大的

22、核酸的分子量很大，核酸溶液具有較大的粘性。粘性。DNA分子的長(zhǎng)度與其直徑之比可達(dá)分子的長(zhǎng)度與其直徑之比可達(dá)107，因此即使極稀的因此即使極稀的DNA溶液也有較大的粘度。溶液也有較大的粘度。RNA溶液的粘度較溶液的粘度較DNA為小。當(dāng)核酸溶液受熱為小。當(dāng)核酸溶液受熱或酸堿等要素作用下發(fā)生變性時(shí)，分子長(zhǎng)度與或酸堿等要素作用下發(fā)生變性時(shí)，分子長(zhǎng)度與直徑比例減小，分子不對(duì)稱性變小，溶液粘度直徑比例減小，分子不對(duì)稱性變小，溶液粘度下降。下降。l 粘度測(cè)定可用作粘度測(cè)定可用作DNA變性的目的。變性的目的。 核酸的理化性質(zhì)：高分子性質(zhì)核酸的理化性質(zhì)：高分子性質(zhì)l超離心沉降超離心沉降l 不同種類核酸分子的大小

23、不同。核酸分子大小表不同種類核酸分子的大小不同。核酸分子大小表示方法有以下幾種：即千道爾頓示方法有以下幾種：即千道爾頓(kD)、堿基對(duì)、堿基對(duì)(bp)或千堿基對(duì)或千堿基對(duì)(kb)數(shù)目、離心沉降常數(shù)數(shù)目、離心沉降常數(shù)(s)。離心沉降。離心沉降常數(shù)是利用高分子的核酸分子大小不同，分子外形常數(shù)是利用高分子的核酸分子大小不同，分子外形不同，在超離心力場(chǎng)作用下的沉降行為也各不一樣不同，在超離心力場(chǎng)作用下的沉降行為也各不一樣而測(cè)得。如真核生物核糖體小亞基中含的而測(cè)得。如真核生物核糖體小亞基中含的rRNA分分子大小為子大小為18S，大亞基中的，大亞基中的rRNA有有28S、5S和和5.8S三種分子。三種分子

24、。 核酸的理化性質(zhì)：高分子性質(zhì)核酸的理化性質(zhì)：高分子性質(zhì)l凝膠過濾凝膠過濾l 高分子的核酸還高分子的核酸還表現(xiàn)為特異的凝膠表現(xiàn)為特異的凝膠過濾過濾(如葡聚糖凝膠如葡聚糖凝膠)洗脫行為，洗脫時(shí)洗脫行為，洗脫時(shí)分子量大的先被洗分子量大的先被洗出，分子量小的后出，分子量小的后洗出。洗出。核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收l核酸中的嘌呤鹼、嘧啶鹼及其組成的核苷、核苷酸及核酸對(duì)紫核酸中的嘌呤鹼、嘧啶鹼及其組成的核苷、核苷酸及核酸對(duì)紫外光都有強(qiáng)吸收作用。其共同特點(diǎn)是對(duì)在外光都有強(qiáng)吸收作用。其共同特點(diǎn)是對(duì)在260nm處的紫外光有處的紫外光有最大的吸收值。最大的吸收值。l低色效應(yīng)低色效應(yīng)Hypochromic ef

25、fect：DNA雙螺旋松散后，所得的雙螺旋松散后，所得的光吸收值幾乎是其組成中一切核苷酸光吸收值的總和。雙螺旋光吸收值幾乎是其組成中一切核苷酸光吸收值的總和。雙螺旋重新構(gòu)成時(shí)，鹼基間氫鍵的連系及鹼基對(duì)間的萬德華氏力作用，重新構(gòu)成時(shí)，鹼基間氫鍵的連系及鹼基對(duì)間的萬德華氏力作用，可使可使260nm處的紫外光吸收值下降。處的紫外光吸收值下降。l核酸分子中鹼基的克分子數(shù)與磷的克原子數(shù)相等，可根據(jù)核酸核酸分子中鹼基的克分子數(shù)與磷的克原子數(shù)相等，可根據(jù)核酸溶液中的磷含量及紫外光的吸收值來測(cè)定核酸量。溶液中的磷含量及紫外光的吸收值來測(cè)定核酸量。l換算：換算：1 OD260nm 雙鏈雙鏈DNA = 50 g/

26、ml l 1 OD260nm 單鏈單鏈DNA = 37 g/mll 1 OD260nm 單鏈單鏈RNA = 40 g/mll 變性、復(fù)性與雜交變性、復(fù)性與雜交 核酸在理、化要素作用核酸在理、化要素作用下，雙螺旋構(gòu)造破壞稱下，雙螺旋構(gòu)造破壞稱核酸變性。核酸變性。 根據(jù)變性要素區(qū)分為堿根據(jù)變性要素區(qū)分為堿變性、熱變性等。變性、熱變性等。 如如DNADNA的堿變性、的堿變性、DNADNA的的熱變性，其中以熱變性，其中以DNADNA的熱的熱變性更具典型意義變性更具典型意義 DNA的熱變性的熱變性 粘度改動(dòng)，鋼性線性分子變得無序，粘度下降粘度改動(dòng)，鋼性線性分子變得無序，粘度下降 UV吸收加強(qiáng)，其規(guī)律如下

27、： 80 90 100 100%50%OD260254 Tm 變性溫度范圍變性溫度范圍高色效應(yīng)高色效應(yīng) hyperchromic effect 核酸變性后、氫鍵破壞，雙螺旋構(gòu)造破壞，堿基暴露，核酸變性后、氫鍵破壞，雙螺旋構(gòu)造破壞，堿基暴露，紫外吸收紫外吸收260nm加強(qiáng)，謂高色效應(yīng)加強(qiáng)，謂高色效應(yīng) 解鏈溫度解鏈溫度融解溫度融解溫度 melting temperature，TmUV吸收增值到達(dá)最大吸收增值吸收增值到達(dá)最大吸收增值50%時(shí)的溫度，稱時(shí)的溫度，稱Tm Tm值與值與 DNA G+C含量有關(guān)，含量有關(guān)，G+C含量愈大，含量愈大，Tm愈高，反之那么低。愈高，反之那么低。 與核酸分子長(zhǎng)度有關(guān)

28、，分子愈長(zhǎng)，與核酸分子長(zhǎng)度有關(guān)，分子愈長(zhǎng)，Tm愈高。愈高。 變性溫度范圍與變性溫度范圍與DNA樣品均一性有關(guān)，分子種類愈純樣品均一性有關(guān)，分子種類愈純單一，長(zhǎng)度愈一致，其變性范圍愈窄，反之那么變性單一，長(zhǎng)度愈一致，其變性范圍愈窄，反之那么變性溫度范圍愈寬。溫度范圍愈寬。 DNA變性的復(fù)性變性的復(fù)性 renaturationDNA發(fā)生熱變性后，經(jīng)緩慢降溫，如放置室發(fā)生熱變性后，經(jīng)緩慢降溫，如放置室溫逐漸冷卻，解開的互補(bǔ)鏈之間對(duì)應(yīng)的堿基溫逐漸冷卻，解開的互補(bǔ)鏈之間對(duì)應(yīng)的堿基對(duì)再構(gòu)成氫鍵，恢復(fù)完好的雙螺旋構(gòu)造，稱對(duì)再構(gòu)成氫鍵，恢復(fù)完好的雙螺旋構(gòu)造，稱DNA熱變性的復(fù)性。熱變性的復(fù)性。核酸復(fù)性時(shí)核酸復(fù)

29、性時(shí)UV下降，此稱低色效應(yīng)下降，此稱低色效應(yīng) hypochromic effectDNA熱變性后緩慢冷卻處置過程稱退火熱變性后緩慢冷卻處置過程稱退火 annealing DNA加熱變性后，假設(shè)經(jīng)驟然降溫，互補(bǔ)鏈堿基之間來不及配對(duì)互補(bǔ)，構(gòu)成氫鍵聯(lián)絡(luò)，兩鏈維持分別形狀。慢慢驟驟 核酸分子雜交核酸分子雜交 hybridization 當(dāng)不同來源的核酸變性后一同復(fù)性時(shí)，只需這些核酸分子中含有一樣序列的片段，即可構(gòu)成堿基配對(duì)，出現(xiàn)復(fù)性景象，構(gòu)成雜種核酸分子，或稱雜化雙鏈，稱核酸分子雜交。核酸分子雜交核酸分子雜交膜上固相雜交膜上固相雜交雜交探針技術(shù)雜交探針技術(shù) l采用一小段知序列的單鏈采用一小段知序列的單

30、鏈(含數(shù)十個(gè)核含數(shù)十個(gè)核苷酸苷酸)核酸，經(jīng)同位素或其它小分子或核酸，經(jīng)同位素或其它小分子或發(fā)光物質(zhì)標(biāo)志其末端或全鏈，即為核發(fā)光物質(zhì)標(biāo)志其末端或全鏈，即為核酸探針?biāo)崽结?probe)。l在適當(dāng)條件或環(huán)境中與待測(cè)核酸樣品在適當(dāng)條件或環(huán)境中與待測(cè)核酸樣品雜交，經(jīng)過放射性同位素自顯影、顯雜交，經(jīng)過放射性同位素自顯影、顯色、發(fā)光或熒光檢測(cè)，判別待測(cè)的核色、發(fā)光或熒光檢測(cè)，判別待測(cè)的核酸分子能否含有與探針同源的核酸序酸分子能否含有與探針同源的核酸序列。列。l探針技術(shù)已廣泛用于分子生物學(xué)、分探針技術(shù)已廣泛用于分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)基因分析及臨床醫(yī)學(xué)診斷，子遺傳學(xué)基因分析及臨床醫(yī)學(xué)診斷，后者已開展為一門獨(dú)立的

31、新型學(xué)科后者已開展為一門獨(dú)立的新型學(xué)科DNA診斷學(xué)，又稱基因診斷。診斷學(xué)，又稱基因診斷。DNA的生物合成的生物合成lDNA生物合成的概念生物合成的概念l 生物體內(nèi)由生物體內(nèi)由DNAP催化合成催化合成DNA的過程，包的過程，包括括l DDDP指點(diǎn)的指點(diǎn)的DNA合成合成復(fù)制復(fù)制l RDDP指點(diǎn)的指點(diǎn)的DNA合成合成反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄l DDDP、重組酶或、重組酶或SOS系統(tǒng)酶參與的系統(tǒng)酶參與的DNA修修復(fù)復(fù)DNA的復(fù)制合成的復(fù)制合成l半保管復(fù)制概念半保管復(fù)制概念l 復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)ori和方向和方向5 3l 復(fù)制體系復(fù)制體系E.coli為例為例l DnaB識(shí)別識(shí)別ori、解旋酶、解旋酶(Topo)、解鏈蛋、解鏈蛋白白(Rep蛋白蛋白)、引發(fā)酶、引發(fā)酶/前體、前體、DNAPIII、DNAPI、DNA銜接酶銜接酶半保管復(fù)制半保管復(fù)制DNA合成進(jìn)展時(shí)，以兩條親代合成進(jìn)展時(shí)，以兩條親代DNA鏈鏈中的每中的每條鏈為模板，在條鏈為模板，在DNA指點(diǎn)下指點(diǎn)下的的DNA聚合酶催化下