環(huán)境生物修復(fù)中高效基因工程菌的構(gòu)建策略_劉和

1、浙江大學(xué)學(xué)報(bào) (農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版 28(2 :208212, 2002Journal of Zhej i ang Un iversity (A gric 1&L ife Sci 1 收稿日期 :2001204202基金項(xiàng)目 :浙江省科學(xué)技術(shù)廳重點(diǎn)資助項(xiàng)目 (001103258 作者簡介 :劉 和 (1974- , 男 , 江西吉安人 , 博士生 , 主要 從事環(huán)境生物技術(shù)的研究 .文章編號(hào) :100829209(2002 0220208205環(huán)境生物修復(fù)中高效基因工程菌的構(gòu)建策略劉 和 , 陳英旭(浙江大學(xué) 環(huán)境工程系 , 浙江 杭州 310029摘要 :通過對(duì)環(huán)境污染物的生物降解機(jī)制及妨礙污

2、染物降解的因素進(jìn)行分析 , 提出了幾種高效基因 工程降解菌的構(gòu)建策略 , 包括重組污染物降解基因以優(yōu)化污染物降解途徑 、 重組污染物攝入相關(guān)基因以 改善對(duì)污染物的生物可利用性和重組環(huán)境不利因子抵抗基因以增強(qiáng)其環(huán)境適應(yīng)性等 關(guān)鍵詞 :生物修復(fù) ; 基因工程菌 ; 污染物降解基因 ; 中圖分類號(hào) :X 502 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :AL I U H e , CH EN Y ing 2(t . E ng ineering , Z hej iang U niv . , H ang z hou 310029, Ch ina Con ies genetically eng i neered bacter i a

3、for env ironm en t biore m edi ation . Journal of Zhejiang U (A gric 1&L ife Sci 1 , 2002, 28(2 :2082212Abstract :Genetically engineered bacteria ho ld p rom ising po tential in the future app licati ons of bi o rem e 2diati on . T h is paper p resents several constructi on strategies of genetically

4、 engineered bacteria fo r the bi o rem ediati on purpo se th rough analyzing the bi odegradati on m echanis m s of po llutants and encum ber 2ing facto rs fo r efficacy of bi odegradati on . T hese strategies include op ti m izati on of the degradati on path 2w ays , i m p rovem ent of the bi oavail

5、ability to po llutants and enhancem ent of the abilities of to lerance to the environm ental hazardous facto rs .Key words :bi o rem ediati on ; genetically engineered bacterium ; po llutant catabo lic gene ; environm entalbi o techno logy受污染環(huán)境的生物修復(fù)技術(shù)是一項(xiàng)蓬勃發(fā)展的環(huán)境污染治理技術(shù) , 因其對(duì)受污染環(huán)境的 生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)小 、 費(fèi)用低廉而日益引起各國政

6、府部 門和環(huán)境科學(xué)研究者的關(guān)注 微生物豐富的生 物多樣性決定了其代謝類型與污染物降解途徑 的廣泛多樣 , 因此在實(shí)際中得到了更多的應(yīng)用 然而受微生物對(duì)污染物特別是難降解污染物的 降解能力所限 , 生物修復(fù)技術(shù)具有修復(fù)周期長 的明顯缺點(diǎn) , 阻礙了這一技術(shù)在現(xiàn)實(shí)中的發(fā)展 和應(yīng)用 構(gòu)建高效的基因工程菌可以顯著提高污染 物的降解效率 1, 它為解決生物修復(fù)周期長等 問題提供了嶄新的途徑 環(huán)境微生物尤其是細(xì) 菌中的污染物降解基因 、 降解途徑等許多污染 物降解機(jī)制的闡明為構(gòu)建具有高效降解性能的 污染物降解基因工程菌提供了可能 2本文通 過對(duì)污染物生物降解機(jī)制以及阻礙污染物降解 的相關(guān)因素進(jìn)行分析 ,

7、提出幾種高效基因工程 菌的構(gòu)建策略 1優(yōu)化污染物的降解途徑1. 1重組互補(bǔ)代謝途徑有機(jī)污染物在降解菌編碼的一系列酶催化 作用下 , 逐步從復(fù)雜大分子化合物降解成簡單 的無機(jī)小分子化合物 一些難降解有機(jī)污染物 特別是人工合成化合物 (xenob i o tics 還需要不 同降解菌之間的協(xié)同代謝或經(jīng)共代謝等復(fù)雜機(jī) 制才能最終得以降解 , 這無疑降低了污染物的 降解效率 因?yàn)槲廴疚锎x產(chǎn)物在不同降解菌 間的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是耗能過程 , 對(duì)細(xì)菌來說這是一 種不經(jīng)濟(jì)的營養(yǎng)方式 另外 , 某些污染物的中間 代謝產(chǎn)物可能具有毒性或?qū)Υx活性有抑制作 用 , 如不能被迅速代謝利用 ,謝過程產(chǎn)生抑制作用 菌降解污染

8、物的種類 、在顯著差異 ,重組 ,途徑組合起來以構(gòu)建具有特殊降解功能的超級(jí) 降解菌 , 可以有效地提高微生物的降解能力 , 從 而提高生物修復(fù)效率 近年來 , 隨著對(duì)污染物降解機(jī)理的逐步闡 明及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段的飛速發(fā)展 , 運(yùn)用污 染物互補(bǔ)降解途徑重組策略已構(gòu)建出越來越多 的超級(jí)降解工程菌 多氯聯(lián)苯 (PCB s 是自然環(huán) 境中廣泛存在的一類難降解污染物 PCB s 在 好氧條件下通過細(xì)菌 bp h A 基因編碼的聯(lián)苯雙 加氧酶催化聯(lián)苯裂解 , 生成氯代苯甲酸 (CBA 以及異 戊 二 烯 酸 后 者 最 終 降 解 成 CO 2和 H 2O , 但細(xì)菌對(duì) CBA 因缺乏相應(yīng)的降解基因而

9、不能繼續(xù)降解 由于 CBA 對(duì)聯(lián)苯雙加氧酶具有 強(qiáng)烈的抑制作用 , 使整個(gè) PCB s 的降解效率顯 著降低 與此同時(shí) , 某些細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的脫鹵素基 因 , 如 P seud o m onas aerug inosa 142中的 ohb 以 及 A rth robacter g lobif or m is KZT 1中 的 f cb 等 , 它們能迅速脫除 CBA 上的氯 , 使 CBA 順利 進(jìn)入后續(xù)降解步驟 , 同時(shí)也解除了 CBA 對(duì)整個(gè) 降解途徑的抑制作用 因此用脫鹵素基因和bp h 基因構(gòu)建的重組體 bp h ohb 彌補(bǔ)了 PCB 的代謝缺陷 實(shí)際上 , 自然界細(xì)菌在污染物的選擇壓

10、力 下相互間的同源基因也存在著遺傳交換和重 組 , 以形成新的污染物降解途徑 , 但是概率極 低 運(yùn)用互補(bǔ)代謝途徑重組策略可以極大地?cái)U(kuò) 展細(xì)菌的污染物降解范圍以及增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)污染 物特別是難降解污染物的降解能力 , 這對(duì)于提 高生物修復(fù)的效率無疑具有重要意義 1. 2改變污染物代謝產(chǎn)物流向污染物降解過程中由于抑制性中間代謝產(chǎn)(end 2p p, 使抑制性中間產(chǎn)物不 生成或盡快轉(zhuǎn)化 , 從而提高污染物降解效率 例 如 , 苯 、 甲苯 、 二甲苯 (B TX 是環(huán)境中常見的石 油化工污染物 , 它們單獨(dú)存在時(shí)被細(xì)菌通過 TOL 或 TOD 兩種途徑降解 , 但兩種途徑都存 在缺陷 :TOD 途徑中

11、 , 二甲苯降解產(chǎn)生的中間 產(chǎn)物 3, 62二甲基鄰苯二酚是一截止式代謝產(chǎn) 物 (dead 2end p roduct , 因不能被后續(xù)的加氧酶 識(shí)別而導(dǎo)致二甲苯降解不完全 而在 TOL 途 徑中 , 降解 B TX 的 P . p u tid a m t 22菌體內(nèi)不 存在識(shí)別苯的加氧酶 , 致使苯不能被降解而在 環(huán)境中積累 然而研究發(fā)現(xiàn) , P . p u tid a m t 22菌 體內(nèi)的對(duì)甲基苯甲酸脫氫酶能識(shí)別 TOD 途徑 中經(jīng)甲苯雙加氧酶催化苯降解產(chǎn)生的二羥基二 氫對(duì)二甲苯 , 使之得以完全降解 因此 , 可以通 過將 TOD 途徑中編碼甲苯雙加氧酶的基因轉(zhuǎn) 移到 P . p u

12、tid a 的 TOL 途徑中 , 利用 TOL 途 徑中的脫氫酶來催化 TOD 途徑中生成的二羥 基二氫對(duì)甲苯 , 使二甲苯不再進(jìn)入 3, 62二甲基 鄰苯二酚途徑 這樣通過 TOL 和 TOD 途徑整 合到一起 , 污染物降解前段利用 TOD 途徑 , 后 段利用 TOL 途徑 , 通過改變污染物的代謝流 向而將 B TX 完全降解 (見圖 1所示 902第 2期 劉 和 , 陳英旭環(huán)境生物修復(fù)中高效基因工程菌的構(gòu)建策略 圖中實(shí)線表示 TOL 途徑 , 虛線表示 TOD 途徑 , 箭頭上的橫截線分別表示 TOL 和 TOD 縮寫說明 :TDO :甲苯雙加氧酶 ; BCG :順式 21, 2

13、2二羥基 21, 22二氫苯 ; XCG :順式 21, 22二羥基 21, 22XO :二甲苯氧化酶 ; BADH :苯甲醇脫氫酶 ; BALDH :苯甲醛脫氫酶 ; BA :苯甲酸 ; :; ; BA CG:順式 22, 32二羥基 22, 32二氫苯甲酸 ; TA CG:順式 22, 322TA CGDH:順式 22, 32二羥基 22, 32二氫對(duì)甲基苯甲酸脫氫酶 ; CTL :鄰苯二酚 ; 42M :22, 32雙加氧酶圖 F ig . BTX degradati on pathw ay1. 3 DNA (DNA shuffling 最早 是由 Stemm er 提出的一項(xiàng)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)

14、行人工 體外快速定向進(jìn)化的方法 3常規(guī)的 PCR 中 , 需要設(shè)計(jì)特定的引物對(duì)選定的 DNA 片段進(jìn)行 擴(kuò)增 然而 , DNA 體外隨機(jī)拼接技術(shù)既依賴于 PCR , 又不同于傳統(tǒng)的 PCR 技術(shù) 這一 DNA構(gòu)建策略可以簡單概括為重組 、 擴(kuò)增 、 篩選三個(gè) 階段 , 以上步驟反復(fù)進(jìn)行直至得到所希望的重 組酶蛋白 其一般過程是將一組不同來源的基 因 DNA 或來自同一基因不同突變體的 DNA 經(jīng) DNA 酶 隨機(jī)切割消化 , 獲得 DNA 隨機(jī)酶 切片段混合體 , 以此混合體在不加引物的情況 下進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 DNA 酶 切割的 DNA 片 段因相互間的同源性進(jìn)行隨機(jī)互補(bǔ) , 并以此為 引

15、物 , 經(jīng) PCR 擴(kuò)增 , DNA 分子復(fù)制 , 從而獲得 大量 DNA 不同區(qū)域間的隨機(jī)重組的新 DNA 突變體 完成這一 PCR 隨機(jī)擴(kuò)增后 , 再加入特 定引物進(jìn)行最后的 PCR 擴(kuò)增 , 便可獲得全長基 因的 PCR 產(chǎn)物 將 PCR 產(chǎn)物在寄主細(xì)胞中表 達(dá) , 篩選出理想的突變體 , 如此多次循環(huán) 由于 同源基因 DNA 體外隨機(jī)拼接是一項(xiàng)效率極高的 DNA 重組技術(shù) , 它能夠在極短的時(shí)間內(nèi)篩 選出所需要的 DNA 重組蛋白 , 因此這一技術(shù)又被稱為蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù) 這一先進(jìn)的 DNA 重組策略可以運(yùn)用于污染物降解基因的 重組 雙加氧酶是細(xì)菌體內(nèi)廣泛存在的一類多 組分復(fù)合酶 ,

16、 它們通過將兩個(gè)氧原子激活 、 加合 到苯環(huán)上的方式活化苯環(huán) , 使其進(jìn)入后續(xù)的裂 解開環(huán)步驟 由于雙加氧酶是催化芳香化合物 降解的一系列酶中最重要的酶之一 , 它對(duì)底物 的選擇特異性決定了細(xì)菌對(duì)污染物的降解范 圍 , 它對(duì)底物的降解效率很大程度上決定了芳 香化合物的降解速率 因此 , 雙加氧酶編碼基因 應(yīng) 該 是 DNA 隨 機(jī) 拼 接 技 術(shù) 的 理 想 材 料 B u rkhord eria cep acia LB 400和 P . p seud oa l 2ca lig enes KF 707是兩株降解性能迥異的 PCB 降解菌 , 前者的污染物選擇范圍寬于后者 , 而后 者則對(duì) PC

17、B 同系物中的某些污染物具有更高 的降解效率 盡管如此 , 它們的 PCB 雙加氧酶 編碼基因 bp h A 1卻具有極高的同源性 , 運(yùn)用 DNA 隨機(jī)拼接策略將兩株菌的 bp h A 1基因重 組 , 篩選后得到的雙加氧酶重組體不但具有更 高的降解活性 , 而且還能降解一些其親本雙加012 浙 江 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) (農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版 第 28卷氧酶所不能降解的苯和甲苯類單環(huán)芳香化 合物 42提高污染物生物可利用性2. 1重組表面活性劑編碼基因污染物的生物可利用性與生物修復(fù)效果密 切相關(guān) Bo s m a 等人認(rèn)為污染物的生物可利用 性在多數(shù)情況下決定了生物修復(fù)的可行性及修 復(fù)效率 5盡管目

18、前的研究結(jié)果不盡一致 , 但是 普遍認(rèn)為 , 表面活性劑能通過改善疏水性化合 物的水溶性和表面張力等理化性質(zhì)而提高其生 物可利用性 而生物表面活性劑由于具有高表 面活性 、 對(duì)熱和 pH 值波動(dòng)的穩(wěn)定性好 、 低毒性 和生物可降解性而比化學(xué)表面活性劑有著更廣 泛的應(yīng)有優(yōu)勢(shì) 但由于生物表面活性劑的生產(chǎn) 得率較低 , 因此現(xiàn)在的趨勢(shì)是利用基因工程的量 , 這些工程 而提高 污染物生物可利用性的另一途徑是直接對(duì)污染 物降解基因和表面活性劑編碼基因進(jìn)行重組 , 然 后轉(zhuǎn)化到合適的宿 主 菌 中 表 達(dá) 如 將 從 R hod ococcus ery th rop olis IGT S 8分離得到的脫

19、硫基因 d sz 轉(zhuǎn)化到產(chǎn)生鼠李糖脂的假單胞菌中 可 使 構(gòu) 建 的 工 程 菌 的 生 物 脫 硫 效 率 明 顯 提高 62. 2重組污染物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因污染物降解速度還與微生物細(xì)胞對(duì)污染物 的攝取速率有關(guān) , 提高污染物的攝取速度有助 于提高污染物的降解速度 例如 , 許多芳香烴類 化合物進(jìn)入降解細(xì)菌內(nèi)部需要依靠細(xì)胞膜上的 透性酶載體蛋白 , 這類酶蛋白不但對(duì)不同的底 物具有特異性 , 甚至對(duì)化合物分子的空間構(gòu)象 也有選擇性 因此將這些膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因 重組到污染物降解菌中可以提高其對(duì)污染物的 攝取效率 另外 , P . p u tid a 的 42羥基苯甲酸轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白 Pcak 還具有

20、生物趨化作用 某些降解細(xì) 菌中質(zhì)粒編碼的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 N ahY 對(duì)細(xì)菌的降 解底物萘也有趨化作用 7這些特殊的生物學(xué) 現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其機(jī)理的闡明將為構(gòu)建此類基因 工程菌提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ) 3增強(qiáng)細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)性3. 1增強(qiáng)細(xì)菌的抗毒能力污染物降解菌在生物修復(fù)應(yīng)用中要充分發(fā) 揮降解性能就必須提高其對(duì)環(huán)境毒物的抵抗能 力 許多芳香烴類污染物由于具有高度的疏水 性而易在細(xì)菌細(xì)胞膜的脂質(zhì)層積累 , 對(duì)細(xì)菌產(chǎn) 生毒性 通過對(duì)此類化合物具有高度耐受性的 細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn) , 構(gòu)成細(xì)胞膜 脂質(zhì)雙層的脂肪酸空間構(gòu)象全部由順式轉(zhuǎn)變成 反式結(jié)構(gòu) , , :細(xì)胞內(nèi)這些耐受機(jī)制促使細(xì)菌在高濃度芳香烴類 污染

21、環(huán)境下得以生存 由于以上抗毒機(jī)制的相 關(guān)編碼基因已經(jīng)得到分離 , 因此將污染物降解 基因轉(zhuǎn)入到此類細(xì)菌中可構(gòu)建出對(duì)有毒污染物 具有更強(qiáng)耐受力的基因工程菌 , 這將是提高細(xì) 菌降解能力的有效途徑 3. 2增強(qiáng)細(xì)菌的放射線耐受性許多微生物對(duì)放射線具有耐受性 , 但目前 分離到的放射線耐受菌多屬產(chǎn)芽孢菌 , 而且很 多 還是致病菌 , 因而限制了它們的應(yīng)用 對(duì)D einococcaceae 屬細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn) , 它們具有一 些與眾不同的特性 , 如繁殖體也具有高活度放 射線耐受性 , 基因在不發(fā)生突變的前提下可完 整地表達(dá) , 無致病性 , 易分離培養(yǎng)等 , 這些特性 使其成為最有希望用于放射性環(huán)境

22、下進(jìn)行生物 修復(fù)的細(xì)菌 因此 , 將污染物降解基因轉(zhuǎn)化到這 類菌體中便有可能構(gòu)建出耐受放射環(huán)境的污染 物降解菌 將 P . p u tid a 中分離得到的甲苯雙 加氧酶基因 tod C 1C 2A 轉(zhuǎn)移到 D . rad iod u rans 中 , 構(gòu)建的工程菌能在高放射性壓力下降解甲 苯 、 氯苯以及 3, 42二氯丁烯 8另外 , 將編碼汞 離子還原酶的 m er A 基因轉(zhuǎn)化 D . rad iod u rans 得到的細(xì)菌可在 6000rad h 的放射環(huán)境下將 濃度極高的 (3050m o l L H g 2+轉(zhuǎn)化成無 112第 2期 劉 和 , 陳英旭環(huán)境生物修復(fù)中高效基因工程

23、菌的構(gòu)建策略 毒 、 易揮發(fā)性的 H g 0+9與此類似 , 一些其它的 耐受重金屬環(huán)境及極寒或極熱環(huán)境條件的相關(guān) 編碼基因也被克隆分離出來 , 將這些基因與污 染物降解基因重組可得到耐極端環(huán)境條件的污 染物降解菌 , 這一構(gòu)建策略為極端環(huán)境條件下 的生物修復(fù)提供了可能 致謝 :感謝白曉慧博士在本文完成過程中提供的 幫助 References :1 L aw rence P W , N eil C B . Environm ental bi o techno lo 2 gy tow ards sustainability J . Cu rr . Op in . B iotechnol , 20

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