可見分光光度法與紫外分光光度法

1、1Visible Spectrophotometry and Ultraviolet Spectrophotometry內(nèi)容提要1. 物質(zhì)的吸收光譜2. 分光光度法基本原理 透光率和吸光度 LambertBeer定律3. 可見分光光度法 分光光度計(jì) 測定方法4. 提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法5. 紫外分光光度法簡介教學(xué)基本要求1. 掌握分光光度法的基本原理，LambertBeer定律以及透光率、吸光度、摩爾吸光系數(shù)等基本概念及相互關(guān)系。2. 熟悉物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收，吸收光譜的意義；可見分光光度法的測定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法。 3. 了解光的基本性質(zhì)，光的加和性；分光光度計(jì)的基本構(gòu)造；提高

2、測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法；紫外分光光度法的一般概念。第一節(jié) 物質(zhì)的吸收光譜一、物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收n光照射某物質(zhì)，物質(zhì)能夠吸收光，使原有的基態(tài)轉(zhuǎn)為激發(fā)態(tài)，只有當(dāng)分子的能量(h)與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差(E)相等時(shí)才能被吸收。M(基態(tài))+ h M*(激發(fā)態(tài))n物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇性，若溶液選擇性地吸收了某種顏色的光，則溶液呈吸收光的互補(bǔ)光。 第一節(jié) 物質(zhì)的吸收光譜 互補(bǔ)色光示意圖互補(bǔ)色光示意圖 第一節(jié) 物質(zhì)的吸收光譜二、物質(zhì)的吸收光譜n將不同波長的單色光依次通過有色溶液，測量溶液的吸光度A(absorbance)。n以波長為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)作圖，得吸收曲線，或稱吸收光譜。

3、n吸收光譜中，吸光度最大處的波長為最大吸收波長，用max表示。n一般，max是定性鑒別物質(zhì)的基礎(chǔ) 。n不同濃度的溶液，max不變，濃度與峰值成正比，這是進(jìn)行定量分析的依據(jù)。 第一節(jié) 物質(zhì)的吸收光譜 三(鄰二氮菲)合鐵(II)離子的吸 收光譜圖（absorptionspectrum) max=510nm 不同濃度的溶液，max不變，濃度與峰值成正比。第二節(jié) 分光光度法基本原理一、透光率 (transmittance)和 吸光度(absorbance) n入射光強(qiáng)度I0，吸收光強(qiáng)度Ia，透過光強(qiáng)度It， 反射光強(qiáng)度為IrI0 Ia + It + Irn被測溶液和參比溶液的吸收池同樣材料和厚度，反射

4、光強(qiáng)度影響相互抵消，上式簡化為I0 Ia + It一、透光率和吸光度n透射光的強(qiáng)度It與入射光強(qiáng)度I0之比稱為透光率(transmittance)，用T表示n透光率的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度，用符號(hào)A表示。A愈大，溶液對(duì)光的吸收愈多。0tII=Tt0lglgII=T-=A第二節(jié) 分光光度法基本原理二、LambertBeer定律nLambert- Beer定律：A =bc 溶液厚度b，單位cm；濃度c，單位molL-1； 摩爾吸光系數(shù)(molar absorptivity ) 單位:Lmol -1cm-1 n若用質(zhì)量濃度代替cA ab 質(zhì)量吸光系數(shù)(apercentange absorptivity)

5、單位:Lg -1cm-1 na和可通過下式相互換算 aM 第二節(jié) 分光光度法基本原理當(dāng)溶液組成表度為10 gL-1時(shí)，吸光系數(shù)可用比吸光系數(shù) 表示， 與和a的關(guān)系分別為：%cmE11%cmE11MEcm10%11%111 . 0cmE第二節(jié) 分光光度法基本原理 透光率T與溶液濃度c (或液層厚度b)之間的關(guān)系也可以以指數(shù)函數(shù)關(guān)系來表示：- lgT bc T 10-bc 第二節(jié) 分光光度法基本原理應(yīng)用LambertBeer定律時(shí)，需注意以下幾點(diǎn)：LambertBeer定律僅適用于單一波長的單色光。入射光的波長范圍越寬，則測定結(jié)果越容易偏離LambertBeer定律。 吸收過程中各物質(zhì)間無相互作用

6、，但各物質(zhì)的吸光度具有加和性。即A Aa+ Ab + Ac + 入射光波長不同時(shí)，摩爾吸光系數(shù)也不同。摩爾吸光系數(shù)越大，溶液對(duì)入射光的吸收就越強(qiáng)，測定的靈敏度就越高。 分光光度法僅適用于微量組分的測定。(或a)確定是在低濃度下測定吸光度A，通過計(jì)算求出。第二節(jié) 分光光度法基本原理例13-1 已知某化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為251，將 此 化 合 物 用 乙 醇 作 溶 劑 配 成 濃 度 為0.150mmolL-1的溶液，在480nm波長處用2.00cm吸收池測得透光率為39.8%，求該化合物在上述條件下的摩爾吸光系數(shù)及質(zhì)量吸光系數(shù)a。第二節(jié) 分光光度法基本原理解： 由LambertBeer定律可

7、得 已知 c 0.15010-3molL-1，b 2.00cm，T 0.398代入 cbTcbAlg11314cmmolL101.33 2.00cmLmol101.50lg0.398)(480nmcbA111113cmg5.30Lmol251gcmmolL101.33 (480nm)(480nm)Ma第二節(jié) 分光光度法基本原理例 測試酶與腺苷酸(AMP)體系的吸光度 如下：A(280nm) 0.46， A(260nm) 0.58 試計(jì)算每一組分的濃度。 已知：酶的(280nm) 2.96104Lmol-1cm-1 (260nm) 1.52104Lmol-1cm-1 AMP的(280nm) 2.

8、4103Lmol-1cm-1 (260nm) 1.5104Lmol-1cm-1 吸收池厚度為1.00cm。 第二節(jié) 分光光度法基本原理解：設(shè)酶和AMP的濃度分別為y和z 因吸收光的加和性 為260nm 0.58 1.521041.00 y+1.51041.00 z 為280nm 0.46 2.961041.00 y+2.41031.00 z 解方程得：y 1.410-5 （molL1） z 2.510-5 （molL-1）即 酶的濃度為1.410-5 molL1， AMP的濃度為2.510-5 molL-1 。 第二節(jié) 分光光度法基本原理第三節(jié) 可見分光光度法 一、分光光度計(jì) (spectro

9、photomete )n主要部件 光源 單色器 檢測器 吸收池 指示器光源：鎢燈，發(fā)出3203200nm的連續(xù)光譜，單色器：以棱鏡或光柵分光，提供單色光。吸收池：分光光度計(jì)中用來盛放溶液的容器。檢測器：通過吸收池的光轉(zhuǎn)換為光電流，再經(jīng)放大輸入指示器，然后顯示。指示器：顯示A或T 。(a)自準(zhǔn)式單色器示意圖 (b)棱鏡對(duì)光的色散作用(c)平面反射光柵第三節(jié) 可見分光光度法 二、測定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法 n取系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定吸光度A，作吸光度A對(duì)溶液濃度c的圖，得過坐標(biāo)原點(diǎn)的直線。1.在相同條件下，測量被測溶液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得溶液度。維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)曲線 第三節(jié) 可見分光光度法 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)

10、照法 n預(yù)先配制一個(gè)與待測液濃度相接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液(其濃度用cs表示)，測得其吸光度為As，再測定待測液的吸光度Ax，則待測液濃度cs可從下式求得 sscAAcxx第三節(jié) 可見分光光度法 第四節(jié) 提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法一、分光光度法的誤差儀器測定誤差 n光電管靈敏性差、光源不穩(wěn)定及讀數(shù)不準(zhǔn)。n透光率誤差T引起濃度誤差c：1.透光率20% 65%，A為0.20.7時(shí)，濃度相對(duì)誤差較小。 測量誤差和透光率的關(guān)系 TTTcclg0.434溶液偏離Beer定律 偏離Beer定律，A-c曲線彎曲。主要原因：化學(xué)因素 吸光物質(zhì)發(fā)生解離、締合、溶劑化等現(xiàn)象；光學(xué)因素 復(fù)色光引起對(duì)Beer定律的偏離。主觀

11、誤差 兩種不同吸光系數(shù)的混合光對(duì)Beer定律的偏離 第四節(jié) 提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法二、提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法選擇適當(dāng)?shù)娘@色劑靈敏度高 選擇性好顯色劑在測定波長處無明顯吸收反應(yīng)生成的有色化合物組成恒定。 第四節(jié) 提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法選擇合適的測定條件入射光波長的選擇 顯色劑的用量溶液的酸度顯色時(shí)間和溫度空白溶液的選擇溶劑空白 試劑空白 試樣空白共存離子的干擾及其消除 控制顯色反應(yīng)的酸度 加入掩蔽劑 分離干擾離子第四節(jié) 提高測量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法第五節(jié) 紫外分光光度法簡介 一、752型分光光度計(jì)n紫外分光光度法適用測定在近紫外區(qū)(200380nm)有特征吸收的物質(zhì)。 n752型分光光度計(jì)裝有可轉(zhuǎn)換的適用于可見分光光度法的鎢燈光源和適用于紫外分光光度法的氫燈光源(發(fā)射200400nm