基因編輯方法CRISPR-Cas9

1、CRISPR-Cas9一種新型基因編輯一種新型基因編輯方法方法 又稱基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)，通過在某些物種基因組中進(jìn)行靶向特異性的突變，從而解答并提出更多精確的生物學(xué)問題。方法包括：鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）技術(shù)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技術(shù) Cas9/gRNA 系統(tǒng)系統(tǒng)(CRISPR-cas9技術(shù)技術(shù))基因組編輯技術(shù)基因組編輯技術(shù)Cell 2014 157,1262-1278 Figure2B 不論是TALEN技術(shù)還是ZFN技術(shù)，其定向打靶都依賴于DNA

2、序列特異性結(jié)合蛋白模塊的合成,將蛋白模塊與限制性內(nèi)切酶 (Fok) 的DNA切割域融合而得到。由蛋白特異結(jié)合域定位，DNA切割域剪切。鋅指核酸酶（鋅指核酸酶（ZFN）轉(zhuǎn)錄激活因子）轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）技術(shù)）技術(shù)Cell 2014 157,1262-1278 Figure2A CRISPR-Cas9 技術(shù)技術(shù) 原理：規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs） CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在不斷進(jìn)化的過程中獲得一種適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，研究者

3、根據(jù) CRISPR-Cas 系統(tǒng)的特性對此系統(tǒng)進(jìn)行改造產(chǎn)生了第 3 代人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)CRISPR-Cas9技術(shù)。該技術(shù)通過小片段的 RNA 介導(dǎo)對入侵的核酸進(jìn)行靶向定位并通過Cas酶對核酸進(jìn)行酶切、 降解。 CRISPR-Cas9 技術(shù)是一種多物種適應(yīng)性的，位點(diǎn)特異性的有效基因組編碼工具。Cell 2014 157,1262-1278 Figure4 CRISPR-Cas9 技術(shù)技術(shù)從已知的序從已知的序列中通過列中通過 PAM 進(jìn)行進(jìn)行定位尋找合定位尋找合適的靶位點(diǎn)適的靶位點(diǎn)并合成并合成 gRNA構(gòu)建構(gòu)建gRNA 與與/Cas9 重重組質(zhì)粒。組質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒對重組質(zhì)粒進(jìn)行活性檢進(jìn)行活性檢

4、測，敲除活測，敲除活性的計(jì)算性的計(jì)算挑選活性較挑選活性較高的敲除質(zhì)高的敲除質(zhì)粒導(dǎo)入培養(yǎng)粒導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞或者的細(xì)胞或者生物體內(nèi)進(jìn)生物體內(nèi)進(jìn)行基因組定行基因組定點(diǎn)編輯操作點(diǎn)編輯操作利用測序、利用測序、RFLP 等方等方法檢測基因法檢測基因組定點(diǎn)修飾組定點(diǎn)修飾結(jié)果結(jié)果 sgRNA 的設(shè)計(jì)的設(shè)計(jì) 選擇 PAM（NGG）5端的一段堿基序列20nt作為原間隔序列，即敲除的靶位點(diǎn)。(PAM，Protospacer adjacent motifs 原間隔序列臨近基序。一般形式為 NGG，其作用是將間隔序列定位于入侵的噬菌體或質(zhì)粒的 DNA 序列中)原則： 選擇的序列必須在全基因組中進(jìn)行比對，原間隔序列必須唯一

5、，否則會對其他基因進(jìn)行敲除而出現(xiàn)錯誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 優(yōu)先選擇 DSB 位點(diǎn)的側(cè)翼存在重復(fù)序列（如果 DSB 的側(cè)翼存在重復(fù)序列，在進(jìn)行非同源末端重組時能夠精確的介導(dǎo)斷裂位點(diǎn)堿基的缺失）。 PAM 的5端盡量存在酶切位點(diǎn)。（有利于后期的活性檢測）構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建方案 ： 1.一是將gRNA 與 Cas9 連入同一個質(zhì)粒載體中并以雙啟動子啟動，載體中攜帶熒光報告基因（用于流式細(xì)胞儀篩選）或抗性基因（用于藥物篩選） 。2.二是將 gRNA與 Cas9 分別連載不同的載體上，兩個載體攜帶有不同的熒光報告基因或抗性基因載體選擇：慢病毒載體 以HIV-1的主要功能元件為基礎(chǔ)構(gòu)建起來的轉(zhuǎn)基因和基因

6、治療載體。區(qū)別于腺病毒載體，可實(shí)現(xiàn)外源基因在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的傳代表達(dá)。gRNA的活性檢測的活性檢測限制性內(nèi)切酶法限制性內(nèi)切酶法 當(dāng) Cas9/sgRNA靶點(diǎn)位置中間序列存在限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)時，如果通過 Cas9/sgRNA 發(fā)生突變，這個位點(diǎn)將可能被破壞，而不能被 內(nèi)切酶酶切。可采用電泳的方法估計(jì)突變效率， 以突變效率的高低來衡量sgRNA 的活性。非配對內(nèi)切酶法非配對內(nèi)切酶法 T7 核 酸 內(nèi) 切 酶 I（T7 endonuclease I，T7E1） 能夠識別不完全配對 DNA 并對其進(jìn)行切割，如果通過 Cas9/sgRNA 發(fā)生突變，將基因組DNA 做 PCR，將相對應(yīng)的 PCR 產(chǎn)物

7、與野生型 DNA的 PCR 產(chǎn)物等量混合，并退火雜交，將產(chǎn)生非配對DNA 片段，將能被非配對內(nèi)切酶 T7E1 剪切。用電泳的方法估計(jì)突變效率，以突變效率的高低來衡量 sgRNA 的活性。SSA 活性檢測活性檢測 一個終止子插入 luciferase（GFP）的編碼區(qū)中央，luciferase（GFP）就會失去活性。為檢測 Cas9/sgRNA 剪切活性，將一個 Cas9/sgRNA的靶點(diǎn)位置序列插在終止子后。在Cas9/ sgRNA 的作用下，靶點(diǎn)位置產(chǎn)生 DSB，細(xì)胞通過同源重組方式修復(fù) DNA，形成一個有活性的luciferase。通過與對照組的比值變化就可反應(yīng) Cas9/sgRNA 剪切

8、的活性水平。降低降低sgRNA/Cas9脫靶率的方法脫靶率的方法 Cas9的兩個內(nèi)切酶活性域?yàn)镽uvC和HNH,兩個亞基分別負(fù)責(zé)對一條DNA單鏈的切割。任一亞基的失活都將形成DNA單鏈斷裂（nicked DNA）。 當(dāng)結(jié)合于兩條互補(bǔ)的 DNA 鏈上相鄰位置的一對 sgRNA 同 時引 導(dǎo)Cas9 D10A 識別并切割靶位點(diǎn)時才能造成 DSB，從而加大了識別的長度，有效的提高了 Cas9-sgRNA 技術(shù)的特異性。Cell 2014 157,1262-1278 Figure6A,B重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞/生物體生物體C、將編碼Cas9和sgRNA的表達(dá)質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染至細(xì)胞系中。D、將純化

9、的Cas9和體外表達(dá)的sgRNA顯微注射至受精卵，快速得到轉(zhuǎn)基因動物模型。E、將編碼CRISPR組分的高效價的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至組織或細(xì)胞，完成特定時間，組織的基因編輯。Cell 2014 157,1262-1278 Figure6C,D,ECRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展1. CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以作為一種位點(diǎn)特異性基因編輯平臺系統(tǒng)可以作為一種位點(diǎn)特異性基因編輯平臺 Cas9-sgRNA 在靶位點(diǎn)切割產(chǎn)生DSB后， 細(xì)胞可以通過兩種方式對DNA 進(jìn)行修復(fù)， 非同源末端連接 （non-homologous endjoining，NHEJ）修復(fù)方式和同源重組方式（homol

10、ogy-directed repair，HDR）。 NHEJ 往往使得核酸鏈被剪切的區(qū)域發(fā)生基因突變，導(dǎo)致編碼的基因Knockdown。 而HDR往往通過供體 DNA 與基因組 DNA 之間的同源重組造成靶位點(diǎn)的糾正或者靶向插入外源基因Knockin。Cell 2014 157,1262-1278 Figure2ACRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展2. 利用利用 Cas9 系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平對基因表達(dá)的調(diào)節(jié) 通過點(diǎn)突變使 Cas9 蛋白的兩個核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域活性全部喪失獲得 dCas9，將 dCas9-sgRNA 作為與 DNA 特異性識別的平臺，令轉(zhuǎn)

11、錄因子或表觀調(diào)控酶與dCas9-sgRNA 融合表達(dá)，即可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。Cell 2014 157,1262-1278 Figure6G CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展3. 利用利用 Cas9 系統(tǒng)對目標(biāo)系統(tǒng)對目標(biāo) RNA 序列進(jìn)行操縱序列進(jìn)行操縱 CRISPR/Cas 蛋白亞型（型）被證明可以靶向消化 RNA 底物。預(yù)示著該技術(shù)的發(fā)展將會代替shRNA/siRNA 等傳統(tǒng) RNAi技術(shù)成為一種新型的 RNA 干擾物而對不同種類的細(xì)胞及動物模型中特定的基因的下游產(chǎn)物進(jìn)行RNA 干擾。Cell 2014 157,1262-1278 Figure4截圖 CRIS

12、PR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展4. 利用利用 Cas9 系統(tǒng)對基因組功能進(jìn)行篩查系統(tǒng)對基因組功能進(jìn)行篩查 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6F CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展5. Cas9 系統(tǒng)作為系統(tǒng)作為DNA特定位點(diǎn)標(biāo)簽特定位點(diǎn)標(biāo)簽 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6H Cas9和GFP融合表達(dá)，可動態(tài)記錄胞內(nèi)DNA特定位點(diǎn)的染色體結(jié)構(gòu)狀態(tài) 。CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展6.利用利用 Cas9 系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)對基因的誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)對基因的誘導(dǎo)調(diào)控 Cell 2014 157,126

13、2-1278 Figure6I 通過化學(xué)或可控因素誘導(dǎo)Cas9肽片段的重建，實(shí)現(xiàn)對基因的誘導(dǎo)調(diào)控。展望展望 到目前為止對 CRISPR/Cas9 技術(shù)的開發(fā)尚屬初步。雖然 Cas9 系統(tǒng)會被 sgRNA 引導(dǎo)從而識別出靶序列，但脫靶效應(yīng)依然存在，特異性仍待提高。 與成熟的 ZFN 和 TALEN 等遺傳物質(zhì)靶向編輯系統(tǒng)相比，CRISPR/Cas9 核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)具有構(gòu)建簡單方便快捷、安全性高、毒性小等得天獨(dú)厚的優(yōu)越性，勢必將在臨床治療、基礎(chǔ)理論研究和農(nóng)牧漁業(yè)等領(lǐng)域發(fā)揮巨大的作用，并且將會對分子生物學(xué)研究和基因治療領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)1 Patrick D. Hsu, Eric S. Lander,and Feng Zhang.Development and Applications ofCRISPR-Cas9 for Genome Engineering. Cell .2014 (157):1262-1278.2 左其生等. CRISPR-Cas 介