凝膠成像及QuantityOne使用說明

1、GelDoc TM XRThe Discovery Series Quantity One ? 1-D Analysis Software使用說明書昆明友寧科技有限公司2008年9月儀器各組成部分介紹I Universal Hood （正面 大體）5 / 19II控制面板鏡頭及濾光片位控制面板V Universal Hood 內(nèi)頂部圖像采集用成像儀自帶的熒光標(biāo)尺和帶刻度的透明塑料板， 參照后文 GelDoc XR 成像的方法， 按紫外透射、 白光透射以及側(cè)面白光三種模式分別采集一次圖像。要求成像清晰、明暗適中。凝膠切割將抽屜式紫外透射平臺完全拉開至最大，將待切割的樣品放置其上。安裝上有機玻璃保

2、護屏，打開“ Trans UV ”和“ Prep UV ”。操作者戴上手套，站在保護屏后進行切膠操作。注意事項：1 安裝 ChemiDoc XRS 的圖像采集卡時，要先安裝其驅(qū)動程序，再將圖像采集卡插入；2 如果軟件的密碼狗不能被正常識別， 請安裝帶補丁的驅(qū)動程序或向 Bio-Rad 安裝工程師求助；3 在給用戶安裝圖像儀和軟件前，先提醒用戶保存好申請來的密碼、軟件序列號和密碼狗。4 培訓(xùn)儀器時，提醒用戶不要將潮濕的樣品長期放在暗箱內(nèi)，以防腐蝕濾光片，更不要將液體濺到暗箱底板上，以免燒壞主板。5 提醒用戶儀器用完，及時關(guān)上電源，特別是ChemiDoc XRS 的 CCD 電源；6 提醒用戶勿用

3、控制成像儀的電腦上網(wǎng)，也不要自行重裝電腦操作系統(tǒng)或給操作系統(tǒng)升級。第二部分 儀器及Quantity One軟件分析操作簡介凝膠電泳是每個做分子生物學(xué)的研究者天天都要打交道的基本技術(shù)。電泳之后的信息處理與電泳本身同樣重要。目前有大量軟件可以用于分析電泳結(jié)果，今天要向大家介紹的是Bio-Rad公司的1D凝膠分析軟件 Quantity One ( Bio-Rad還有一個做2D凝膠分析的軟件 PDQuest)。QuantityOne軟件是常用1D凝膠分析軟件中功能最強大，自動化程度最高的軟件。這個軟件的最新版本 可以在Bio-Rad的網(wǎng)站()免費下載，以供試用或用戶升級之用。Quantity One軟

4、件的主要功能包括定量分析(Volumes Quick Guide),電泳條帶分析 (BandAnalysis),差顯分析(Differential Display Analysis),克隆計數(shù)(Colony Counting Analysis)等，此外， 還可以直接控制 Bio-Rad公司的各類圖像儀和ExQuest自動切膠儀，使您的凝膠分析工作變得極為輕松。Quantity One軟件擁有與windows操作系統(tǒng)下絕大多數(shù)應(yīng)用軟件相同的友好界面。插入密碼狗，打開 Quantity One軟件，可以看到最上緣藍(lán)色橫條幅是標(biāo)題欄，往下依次是菜 單欄和工具欄。每個菜單的主要功能如下:File圖像打

5、開、保存、引入、打印等操作Match分子量估算、條帶匹配分析Edit圖像普通編輯操作Volumn定量分析View圖像縮放、三維視圖、看光密度值等操作Analysis濃度估算、克隆計數(shù)等分析Image圖像旋轉(zhuǎn)、翻轉(zhuǎn)、裁切等操作Reports分析結(jié)果輸出Lane泳道分析Window窗口分析Band條帶分析Help幫助、快捷菜單、軟件注冊等往下一行是工具欄，上面每個按鈕的功能見下表:打開文件圖像顯示控制蠡條帶分析工具IK麗管保存操作0顯示條帶匹配工具魯打印圖像四去除分析標(biāo)記rrEi輪廓修改工具看全圖1 EH詆圖像工具每打印快捷指南冤局部放大HE文字工具畸定量分析快捷指南拖曳氏生縣丁日 /E里工具源條

6、帶分析快捷指南念放大并居中|QQ| 1山1灰度分析工具克隆計數(shù)快捷指南1縮小并居中EHTX5J5H泳道分析工具Quantity One軟彳Help Quick Guide快捷指南提示如何實現(xiàn)一個功能，如定量分析(VolumesQuick Guide),電泳條帶分析(Band Analysis),差顯分析(Differential Display Analysis),克隆計數(shù) (Colony Counting Analysis)等?？旖葜改舷掠?1, 2, 3步驟,根據(jù)提示完成。使用Quantity One軟件進行電泳結(jié)果分析，通常包括圖像獲取、圖像優(yōu)化、分析、結(jié)果輸出 四部分，參考下圖：Acq

7、uire knagcOptinxzt ImageLane and Bard Ana 心席 7a ume A/ia 丫片區(qū)CountingRep art ReiulxF 1 1-2. Quantity One v;oitflow.圖像獲取就是通過軟件控制掃描儀（GS-800、PharosFX等）或凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc、ChemiDoc、VersaDoc等）獲取圖像的過程。圖像優(yōu)化就是將掃描或拍照獲得的原始圖像進行初步處理，以便 更好地進行后續(xù)分析。接下來是分析過程，根據(jù)分析的方法和目的不同，又可以分為定量分析、 條帶分析、克隆計數(shù)、差異（聚類）分析等等。不管如何分析，最終我們都必須通過軟件

8、的輸出 功能，得到我們想要的結(jié)果。Quantity One軟件提供了多種結(jié)果輸出方式。在接下來的幾章里，我們將按照這個思路，一步步引導(dǎo)您使用這一軟件。圖像獲取Quantity One 4.44.6版本可以控制 Bio-Rad目前幾乎所有的圖像儀， 如GelDoc XR、ChemiDoc XRS 等。這些圖像儀采集到的圖像，可以直接保存成軟件可直接分析的圖像，即擴展名1sc的原始圖像文件。下面將具體介紹如何通過 Quantity One軟件從GelDoc XR獲取圖像。GelDoc XR是Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中最常用，操作最簡便的儀器，它可以用來拍攝 EB、SYBR Green等染料染的核

9、酸電泳凝膠；Sypro Ruby、銀染、考馬斯亮藍(lán)等方法染的蛋白電泳凝膠；以及化學(xué)顯色的印記膜等。使用GelDoc XR之前，先接通電源，打開位于儀器背面右下角的電源開關(guān)；然后根據(jù)具體的應(yīng)用 選擇合適的照明和濾光片位置。原則如下：模式1模式2模式3照明 回紫外透射白光透射側(cè)面白光適用 樣品EB、SYBR Green、Sypro Ruby 等需要紫外激發(fā)的透明樣品金屬銀、考馬斯亮藍(lán)等染料染 色，直接可見的透明樣品化學(xué)顯色等非透明可見樣 品載物 平臺抽屜式紫外透射平臺白光轉(zhuǎn)換屏（170-8001）或白光 板（170-7950）抽屜式紫外透射平臺光源 按鈕Trans UV”白光板：Trans UV白

10、光轉(zhuǎn)換屏白光轉(zhuǎn)換屏有自己的電源開關(guān)，位于屏下方，打開后不必每次都關(guān)閉這個開關(guān)。7 / 19: Trans WhiteEpi White”濾光 片位IIO不管使用何種模式，基本的操作過程都是這樣的：1 .將樣品置于適當(dāng)?shù)妮d物平臺上2 .關(guān)閉暗箱門3 .調(diào)整濾光片4 .打開相應(yīng)光源5 .接下來打開 Quantity One軟件，選擇 XR ,按以下順序操作:67按下Live/Focus ,成像儀進入實時成像；選擇照明模式，一般熒光樣品選擇UV,普通透射或反射樣品選擇White模式 注意：該選項對圖像數(shù)據(jù)格式有影響，但不能代替光源選擇。此功能有三個上下鍵按鈕：IRIS （光圈），ZOOM （縮放），

11、FOCUS （聚焦），您可在軟件上直接調(diào)節(jié)或在儀器面板上手工調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)步驟：a調(diào)大IRIS,以看到圖像b點ZOOM,將膠適當(dāng)放大因為小光圈景深大，圖像更清晰c調(diào)節(jié)IRIS至合適大?。ㄒ话闱闆r下盡量選擇小光圈,d調(diào)節(jié)FOCUS,至圖像最清晰 單擊Auto Expose,系統(tǒng)將自動選擇曝光時間成像（系統(tǒng)默認(rèn) 0.15%的像素飽和的成像時間 為最佳時間，在 Options對話 框中可以修改該項設(shè)置），如 不滿意，單擊Manual Expose , 并輸入曝光時間（秒）Clitlk or Auto Expose button ap Dears- depressedCan see E*posuri& T

12、ime jijtonotica ly changing3怔中障Epasurc TimCl FieezeStep III. Acquire InnageAutoExposeMariual .AcquireManual Expose a ctive; burton ao peats sei actedExposure Time field active; Gdju&t ntrnberof secondsEKpo?ijreTime(&cj* 乙 1白- * | Q Fieeze圖像曝光滿意后，按下“Freeze”按鈕。 按下“Analyze”按鈕，將彈出一個新窗口顯示圖像，以供分析。 第5步結(jié)束后，

13、也可以按下“ Save”鍵，保存圖像?；緢D像優(yōu)化通過圖像儀采集的圖像，可能會有偏斜、對比度不佳、數(shù)據(jù)關(guān)系錯誤等問題影響分析。所以 新采集的圖像應(yīng)經(jīng)過優(yōu)化后再進行分析。優(yōu)化的基本過程是：Rotate （旋轉(zhuǎn)）Crop （裁剪）Transform （轉(zhuǎn)化）。另外，當(dāng)數(shù)據(jù)關(guān)系錯誤的時候，需要改變之。詳細(xì)步驟見下。1.旋轉(zhuǎn)（Rotate） 在ImageRotate菜單中選擇適當(dāng)?shù)男D(zhuǎn)角度，其中 Custom Rotation” 工具可以實現(xiàn)任意角度的旋轉(zhuǎn)，點擊后，圖像上出現(xiàn)如下圖所示的情況：(Rav IT I-泣名e, Kodified)otate Cri teri o. . 醫(yī)|ilota，底j二

14、,ssiizH cjfruvs 口疝yth nwMt*&la 曲&恬 AK.Angle-16.1 degiees-Q. 31 rdin?Rolflte Cancel圖中出現(xiàn)一個白圈和 黃色十字，鼠標(biāo)靠近 黃色箭頭，可以任意 角度拖動這個箭頭。 旁邊有個小窗口顯示 所需要旋轉(zhuǎn)的角度和 弧度，點擊“ Rotate” 按鈕旋轉(zhuǎn)即可完成， 請保存旋轉(zhuǎn)后圖像。2.裁剪（Crop）TrmaliT 巾 FirtHighLaw9 / 19.J.Fikwhi咽D闡物5GFul算* plLoHigh UgGonmG加d哼S3i005口ln*il： B DK3, Tan$fcirni.4 Voutc Red To&

15、J5- Vobm Fr(?r hmc TwlE Voure Ccmfiawr Tool7. 5eiaci laolB Prinl liTiflgr.B VMm Ar t RLKexiflid cuErnds:Clri oick 力。加 h vouine b：Shft-cick - relate a mine b*1 .選擇成像系統(tǒng)或打開已保存的文件（軟件可以控制Bio-Rad所有的成像系統(tǒng)如 GelDoc,ChemiDoc,VersaDoc,GS-800,FX,如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff 3文件格式，軟件也可進行分析處理 ）2 . Zoom Box ,縮放，

16、對圖象進行放大觀察3 .選擇待分析區(qū)域：Volumn Contour Tool等高線勾勒區(qū)域，自動連接濃度濃度相同的點，如 U1Volume Free hand Tool自由畫筆選擇區(qū)域，可以勾勒出無規(guī)則形狀，如U2Volume Rect Tool矩形區(qū)域選擇，如 U3Volumn Circle Tool圓形選擇區(qū)域，如 U4按上面4種方法選擇需要定量的區(qū)域。5.雙擊所選區(qū)域，出現(xiàn)如下窗口，定義樣品類型，如未知樣品Unkonwn（U1,U2即待計算樣品），背景Background（B1,B2，軟件在算濃度時會將此區(qū)域的濃度自動扣除）或標(biāo)準(zhǔn)樣品Standard （Std1,Std2,如果該樣品是

17、濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品，即定量標(biāo)準(zhǔn)，需在濃度concentration 一欄輸入該樣品的濃度）。3必須是8位（bit）或16位（bit）無壓縮的tiff文件11 / 196. Select Tool選擇不同區(qū)域7. Print Image打印圖像 8. Volume AnalysisReport定量報告結(jié) 果。打開出現(xiàn)如下窗 口，選擇要報告的參 數(shù)，主要有2個參數(shù) Volume、adj. Vol.(即 adjusted volume)和 Concentration。Volume 為定量值， adj. Vol. 為扣除背景后的定量 值，如有濃度標(biāo)準(zhǔn)樣 品(Std),軟件可報 告 Concentration

18、 絕對 濃度。參數(shù)選好后， 按下按鈕done。7.軟件報告如上圖所示：按右側(cè)輸出按鈕，可將表格保存成txt文件，按左側(cè)打印按鈕，可將報告打印出來。條帶分析(Band Analysis )條帶分析是Quantity One最基本的分析工具，它可以自動識別電泳泳道和識別條帶，依據(jù)泳 道的平均光密度和條帶寬度對每個條帶進行模式化定量。這種分析方式雖然不如定量分析來得方 便，但這樣可以實現(xiàn)非常復(fù)雜的電泳分析，滿足各種不同的結(jié)果需要。這種方式的最大優(yōu)點在于 它可以完全拋棄人為主觀因素而進行全自動定量。21 / 19Average intensityBand ProfileOpen.2. Zdemti B

19、 dm3- TranaforrrL., d Fiinw Lirwt.5- Sketch Frames Add/Adju?t ftnchoi?7. Lahwe BackercfLThJ.3. Detect Eand條，.9號哈rid利g ；10. HandAthibutca.11 March1 己 Fiird 卜naju .13- Al Lanes Report.用條帶分析的方法進行定量的結(jié)果叫Trace Quantity （Trace Qty）,計算方法是：首先軟件自動計算條帶上每一橫排像素的平均光密度和平均光密度分布曲線，然后每個具體條帶的定量值是 平均光密度曲線的線下面積的積分，即：Tra

20、ce Quantity =平均光密度x條帶上下邊界的距離Trace Quantity 的單位：OD*mmAverage pixel inien&ityacross sample width aintegrate curve to baselinefor band quantitation (intensity x mm). |條帶分析中的條帶定量模型卜面介紹用此功能對泳道內(nèi)的所有條帶進行分子量確定，相對濃度分析1 .打開已保存的文件（如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff 必須是8位（bit）或16位（bit）無壓縮的tiff文件文件格式,軟件也可進行分析處理）2 .

21、Zoom Box,縮放，對圖象進行放大觀察3 . Transform轉(zhuǎn)化）調(diào)下圖象的對比度黑白4 .確定泳道（lane）,并對泳道進行各種調(diào)整（實際實驗中泳道往往不是垂直的而出現(xiàn)各種變形）。按下圖所示在軟件的I具欄中有Lane Tool圖標(biāo)，包含有更多泳道編輯工具。Vu3 ari 3.J/w i. II ilffEffi-1 *】Lane Tool泳道編輯工具包DHr-d RsiMfcCreate GordAdjjst 3andRgi。，B Md J Rtfi Oat-idBlinds n Lsn? 7|Bind削iiitu。j=1Fiamw Law .Slieich Rd rs 4dM阜工t

22、 An小al工 Bcm卷 irlicri?|Obs.Ib Lane?|Adjua L-舊 Lhnazjud IListe ReEowLonc1 2 LaiiaWidih.Lai&IBackgiourd,. ?| Pol L areCort Lores J細(xì)皿蛇到圜Id司|1趙SI圜 1 al - - ,1. I-71叁3:|3|因到利Band Tool條帶編輯工具包5. 選擇Frame Lanes,輸入圖像實際泳道（lane）數(shù)并確認(rèn)。此時圖像上泳道的位置上會出現(xiàn)一 條條紅線，每條紅線就代表一根泳道。6. 選擇 Add/Adjust Anchors,此時泳道紅線上會出現(xiàn)一些小圓圈。這些小圓圈稱

23、為錨定點 （anchor）,錨定點規(guī)定了泳道走向。當(dāng)泳道不直時，點擊出現(xiàn)彎曲的泳道部位，就可以增加錨定點。 鼠標(biāo)按住錨定點，可以拖動錨定點，讓每根紅線始終位于泳道的中間線上。7. Lane Background去除泳道背景。點擊該按鈕，選擇一條適當(dāng)?shù)挠镜傈c擊之，然后在彈出 的對話框中選All Lane On ，在Rolling Disk Size ”中填入適當(dāng)?shù)臄?shù)值數(shù)值代表背景扣除數(shù)，值越大則背景扣除越少，被計入條帶定量值越多，反之則背景扣除越多。從經(jīng)驗來看, 該數(shù)彳！以2 40之間為宜。8. Detect Band ,檢測泳道內(nèi)的條帶，打開出現(xiàn)如下窗口。通過調(diào)節(jié)sensitivity靈敏度可

24、調(diào)節(jié)檢測出的條帶數(shù)，調(diào)節(jié)Lane Width使代表表帶的紅色橫線與條帶寬度差不多寬。中間一行人工編輯按鈕可以用來增加/減少條帶、調(diào)節(jié)條帶的上、下邊界等。打開工具欄中Band Tool條帶編輯工具包可看到更多編輯工具（如上圖）人工編輯按鈕9. Standard輸入分子量標(biāo)準(zhǔn)，軟件自帶有許多Bio-Rad的分子量標(biāo)準(zhǔn)，如你用的是自己的標(biāo)準(zhǔn)，進入New Standard建立新的分子量標(biāo)準(zhǔn)，軟件可以選擇標(biāo)準(zhǔn)單位是MW （蛋白質(zhì)）還是 BP（核酸）等（左下圖）。在 Protein-Standard對話框中輸入分子量數(shù)值，完成后單擊賦值圖標(biāo)（右下圖），回到圖象文件上單擊標(biāo)準(zhǔn)樣品的泳道，軟件自動將所輸?shù)姆肿?/p>

25、量數(shù)值和泳道內(nèi)的條帶對應(yīng)。10. Band Attribute條帶屬性，在完成第9步以后,賦值圖標(biāo)：告訴軟件哪條是分子 標(biāo)準(zhǔn)樣品的泳道輸入分子量數(shù)值軟件已自動計算出了其他未知條帶的分子量，打開band attribute選擇要報告的參數(shù)，這里我們選擇Molecular Weight,圖象上可以看到所有條帶的分子量（紅顏色標(biāo)記），標(biāo)準(zhǔn)分子量為藍(lán)色標(biāo)記。W 皆當(dāng) 口 、。A1 di 0 0 苜提=. ts 營 TT *!*1 -& A -LMw MdNainp 電hot*荷 Moi uma EiBm4r了&i.p 看P IimOjir_ swm1口*盧修.，（ 修 ipani尸*叫口，um g! C Ciriu QtyP Edn-Jau “ Mi廣產(chǎn) KgVlHKl44KrrBind ilypvrL IWwii r b CMi4!縣*JBliArchax ?IIW acfcBWl!|&tWlMMh2lQjint恒VWeht|I2hwiinwjjISiM 1,49* flwl|1 Bpm .=ZjwrCh3 if Eh0祖皿* nr |_h*_|11. Print Image 打印圖象12. All Lane Report所有泳道條帶結(jié)果報告。打開窗口，選擇要報告的參數(shù)， 如Mol.Wt.（分子量，如左下圖