第二章+遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)DNA2

1、第二章第二章 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)一一遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)The transforming principle is DNA.The genetic material of phage T2 is DNA.二核酸的結(jié)構(gòu)及理化特性二核酸的結(jié)構(gòu)及理化特性以四種堿基構(gòu)成的脫氧核以四種堿基構(gòu)成的脫氧核苷酸或核苷酸為基本單位苷酸或核苷酸為基本單位通過通過3 3，5-5-磷酸二酯鍵連磷酸二酯鍵連接成鏈狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成其一級接成鏈狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成其一級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)DNADNA的一級結(jié)構(gòu)中，有一些堿基可以通過加上的一級結(jié)構(gòu)中，有一些堿基可以通過加上一個甲基而被修飾，稱為一個甲基而被修飾，稱為DNADNA的甲基

2、化的甲基化(mythylation of DNA)(mythylation of DNA)。 1 1）原核生物（細菌）有）原核生物（細菌）有限制一修飾限制一修飾系統(tǒng)系統(tǒng) 對自身對自身DNADNA產(chǎn)生保護作用。產(chǎn)生保護作用。 抵御外源抵御外源DNADNA（噬菌體）的入侵。（噬菌體）的入侵。 2 2）真核生物中的）真核生物中的DNADNA甲基化在甲基化在基因表達調(diào)控基因表達調(diào)控中中有重要作用有重要作用Nucleic Acid StructureDNA double helixWatson and Crick , 1953.Two separate strands Antiparellel (53

3、direction)Complementary (sequence)Base pairing: hydrogen bonding that holds two strands togetherEssential for replicating DNA and transcribing RNA Sugar-phosphate backbones (negatively charged): outside Planner bases (stack one above the other): inside三級結(jié)構(gòu)：即超螺旋結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)：即超螺旋結(jié)構(gòu)（Supercoiling）三鏈、四鏈結(jié)構(gòu)：三鏈三鏈

4、、四鏈結(jié)構(gòu)：三鏈DNA、端粒、端粒RNA 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu): 許多許多RNA分子以一單鏈狀態(tài)存在分子以一單鏈狀態(tài)存在, 其通過分子其通過分子內(nèi)堿基的配對和相互之間的氫鍵結(jié)合，內(nèi)堿基的配對和相互之間的氫鍵結(jié)合， 形成復(fù)雜構(gòu)像，而形成復(fù)雜構(gòu)像，而這種復(fù)雜性反映在細胞中這種復(fù)雜性反映在細胞中RNA分子呈現(xiàn)不同角色的變化中。分子呈現(xiàn)不同角色的變化中。tRNARibozyme RNArRNA核酸的理化性質(zhì)核酸的理化性質(zhì)物理性質(zhì)：物理性質(zhì)：a.核酸具有高度的粘性，這主要是因為其有高螺旋率和相對僵核酸具有高度的粘性，這主要是因為其有高螺旋率和相對僵硬的緣故；硬的緣故；b.其浮力密度為其浮力密度為1.7 g/cm-3

5、，可通過密度梯度離心獲得，可通過密度梯度離心獲得DNA；c.核酸具有旋光性和熱特性，核酸具有旋光性和熱特性，DNA和和RNA的最大吸收波長均為的最大吸收波長均為260nm（用于定性定量檢測核酸，測定核酸純度），（用于定性定量檢測核酸，測定核酸純度），減色現(xiàn)象：減色現(xiàn)象：雙鏈雙鏈DNA與單鏈與單鏈DNA或或RNA以及單個核苷酸相比，表現(xiàn)為著以及單個核苷酸相比，表現(xiàn)為著色不足，因此對紫外線吸收的程度是色不足，因此對紫外線吸收的程度是dsDNAssDNA/RNAnucleotide.ssDNA/RNAnucleotide.在加熱的情況下在加熱的情況下DNA會發(fā)生變會發(fā)生變性成單鏈，溫度降低又可復(fù)性（

6、回復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu)）。性成單鏈，溫度降低又可復(fù)性（回復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu)）。d. 超螺旋：非正常的螺旋狀態(tài)，其中負超螺旋是進行復(fù)制和轉(zhuǎn)超螺旋：非正常的螺旋狀態(tài)，其中負超螺旋是進行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)，約占整個錄的基礎(chǔ)，約占整個DNA的的5%。化學(xué)性質(zhì)：化學(xué)性質(zhì)：在在pH4-11范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，過酸或過堿都會使其變性。范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，過酸或過堿都會使其變性。堿變性提取細菌質(zhì)粒堿變性提取細菌質(zhì)粒DNA即是基于此原理。即是基于此原理。（一）（一）核酸擴增、雜交核酸擴增、雜交變性，復(fù)性變性，復(fù)性PCR的依據(jù)的依據(jù) 解鏈溫度解鏈溫度雜交雜交southern，northern，而而western blot雖與上述雜交相似，但

7、雖與上述雜交相似，但所依據(jù)原理不同所依據(jù)原理不同C0t1/2是指什么?三、核酸擴增雜交基礎(chǔ)及測序三、核酸擴增雜交基礎(chǔ)及測序核酸核酸分子雜交分子雜交的基本原理的基本原理 具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下 按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。 雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列稱核酸序列稱探針探針。探針帶有供反應(yīng)后檢測的合。探針帶有供反應(yīng)后檢測的合適標記物，并僅與特異靶分子反應(yīng)。適標記物，并僅與特異靶分子反應(yīng)。 雜交有雜交有固液相雜交固液相雜交和和液相液相

8、雜交。雜交。 DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子DNA變性與復(fù)性變性與復(fù)性 1、DNA變性變性 （1）定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條）定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性變性（2）變性的方法：）變性的方法： a. 熱變性：溫度升高到熱變性：溫度升高到90100時，雙鏈核酸時，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。分子鏈間的氫鍵完全斷裂。 b. 酸堿變性：酸堿變性：pH值低于值低于3或高于或高于10時，雙鏈核時，雙鏈核 酸分子鏈酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。間的氫鍵斷裂。 c. 化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使化學(xué)試劑變性：如尿素

9、、甲酰胺、甲醛等使 雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。(3) 變性后的理化性質(zhì)變化：變性后的理化性質(zhì)變化： 粘度降低粘度降低 密度增加密度增加 紫外吸收值增加紫外吸收值增加(4)DNA變性曲線變性曲線 AT區(qū)先解鏈區(qū)先解鏈 GC區(qū)后解鏈區(qū)后解鏈 階梯式曲線階梯式曲線(5) GC含量與含量與Tm值之間的關(guān)系值之間的關(guān)系 （G+C）%=（Tm-69.3) 2.44 Tm =(G+C)%0.41+69.32、復(fù)性、復(fù)性 （1）定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下）定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過

10、程，稱復(fù)性或雜交。性或雜交。具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈：具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸和寡核苷酸/RNA。（2）復(fù)性過程）復(fù)性過程A.單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈B.局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離C.局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列D.形成完整的雙鏈分子形成完整的雙鏈分子3、核酸變性后的復(fù)性速度取決于核酸分子的復(fù)雜性：、核酸變性后的復(fù)性速度取決于核酸分子的復(fù)

11、雜性： （1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長度的總長度 （2）Cot與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成正比與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成正比 （3）兩個）兩個DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于雜交率取決于DNA的相對復(fù)雜性的相對復(fù)雜性 Southern印跡雜交印跡雜交1、待測核酸樣品的制備、待測核酸樣品的制備 （1）裂解或破碎細胞）裂解或破碎細胞 （2）抽取純化基因組）抽取純化基因組DNA （3）限制酶消化）限制酶消化DNA為大小不同的為大小不同的DNA片段片段雜交舉例雜交舉例2、待測、待測DNA樣品的電

12、泳分離樣品的電泳分離 （1）瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠）瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠 分離小片段用高濃度膠分離小片段用高濃度膠 （2）凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子）凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子 DNA泳動慢泳動慢,小分子小分子DNA泳動快，泳動快， 大小大小 相同的分子處于同一條帶相同的分子處于同一條帶 （3）分子量標準：經(jīng)）分子量標準：經(jīng)Hind消化的消化的DNA，雜，雜交所用分子量標準可用核素標記交所用分子量標準可用核素標記 3、凝膠中核酸的變性（堿變性）、凝膠中核酸的變性（堿變性） 凝膠置于凝膠置于NaOH溶液中使溶液中使DNA變性斷裂為較短的變性斷裂為較短的

13、單鏈單鏈 DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液 4、印跡印跡（a）（b）（c）（d）（e）基因組基因組DNADNA限制片段限制片段硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜同探針同源雜同探針同源雜交的基因交的基因DNA片段片段X光底片光底片 5、Southern雜交雜交 （1）預(yù)雜交：封閉膜上能與）預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點結(jié)合的位點 預(yù)雜交液為不含預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液探針的雜交液 （2）雜交：液相中的）雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測探針與膜上的待測DNA雜交雙鏈雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交探針需加熱變性為單鏈，再雜交 （3）洗膜：去除游

14、離的放射性探針或非特異結(jié)）洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的合的DNA 6、雜交結(jié)果檢測、雜交結(jié)果檢測 （1）放射自顯影：適用于放射性核素標）放射自顯影：適用于放射性核素標記的探針記的探針 （2）比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素）比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標記的探針標記的探針Southern雜交分析示例 A. DNA體外重組實驗 B. 抗生素篩選轉(zhuǎn)化子細胞 C. 培養(yǎng)突變株細胞 D. Southern雜交實驗結(jié)果顯示，外源目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入突變株細胞中 1973年，由美國斯坦福大學(xué)教授Cohn和美國加州大學(xué)教授Boyer帶領(lǐng)各自的研究組幾乎同時分別完成了DNA體外重組，一舉打開了基因工程

15、學(xué)大門。Northern印跡雜交印跡雜交 1、基本原理和基本過程與、基本原理和基本過程與Southern blot基本相同基本相同 2、鑒別、鑒別RNA 3、探針可用、探針可用DNA或或RNA片段片段 4、待測樣品為總、待測樣品為總RNA或或mRNANorthern印跡與印跡與Southern 印跡的不同點印跡的不同點 1、變性：、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保 持持RNA處于變性狀態(tài)，處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳電泳前和電泳 中不變性中不變性 2、轉(zhuǎn)膜：、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern 印跡時，

16、印跡時，DNA轉(zhuǎn)膜前需進行堿變性及中和處理轉(zhuǎn)膜前需進行堿變性及中和處理 3、靶核酸為、靶核酸為RNADNA芯片（基因芯片） DNA芯片（DNA chip）技術(shù)，實際上就是利用核酸雜交的原理，將不同序列的DNA片段（探針）印記到小玻片或相應(yīng)介質(zhì)上，然后將待檢測DNA（帶有標記）液與之孵育，經(jīng)洗脫后，檢測最終能夠發(fā)生結(jié)合的DNA，從而判定待檢測DNA序列的技術(shù)。（二）（二） 核酸測序核酸測序 Sanger的酶學(xué)測序原理的酶學(xué)測序原理 Gilbert的化學(xué)測序法的化學(xué)測序法 自動測序儀的發(fā)明自動測序儀的發(fā)明1、末端終止法、末端終止法2、化學(xué)裂解法、化學(xué)裂解法3、DNA測序自動化測序自動化使用特異性引

17、物與單使用特異性引物與單鏈模板鏈模板DNA退火，退火，在在DNA聚合酶作用聚合酶作用下進行延伸反應(yīng)，用下進行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用終止，用PAGE區(qū)分長度僅相區(qū)分長度僅相差差1個核苷酸的個核苷酸的ssDNA，從而完成，從而完成測序的方法。測序的方法。用化學(xué)試劑在用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)各種長度的短鏈，經(jīng)過過PAGE放射自顯影可放射自顯影可直讀直讀DNA順序。順序。類似末端終止法，所不類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標記，同的是用熒光染料標記，計算機自動讀出。計算機自動讀出。優(yōu)點優(yōu)點簡便、迅速、應(yīng)用廣簡便、

18、迅速、應(yīng)用廣泛。泛。不需酶促反應(yīng)，可以不需酶促反應(yīng)，可以對寡核苷酸測序。對寡核苷酸測序。1、高負荷，、高負荷，1塊膠可測塊膠可測16個樣品；個樣品；2、機讀不、機讀不需放射自顯影；需放射自顯影；3、安、安全不用同位素；全不用同位素；4、簡、簡單迅速單迅速8-10h。測序過程（末端終止法）： DNA聚合酶復(fù)制DNA鏈，還包括DNA模板和單核苷酸A,C,T,G，還需要修飾過的所謂的“終止核苷酸”，每一種終止核苷酸的堿基被標記上不同的顏色的熒光染料；在DNA復(fù)制過程中，由于加入了終止核苷酸，因此會產(chǎn)生不同長度的片段，而這些片段具有共同的起點，所以只有最后一個核苷酸有差異；通過電泳將DNA片段按大小分

19、離開，其結(jié)果將顯示為由不同顏色組成的梯度；由計算機解讀每個色帶，最后得出片段的堿基序列。Leroy HoodMike HunkapillerReplicating a DNA strand in the presence of dideoxy-T An Automated sequencing gel: A Scan of one gel lane: We dont even have to read the sequence from the gel - the computer does that for us! 人神經(jīng)生長因子 cDNA序列 不管是上述哪一種方法，測序基本過程如下：不管是

20、上述哪一種方法，測序基本過程如下：1 1、制備待測、制備待測DNADNA序列模板；序列模板； 2 2、酶促或化學(xué)反應(yīng)將其轉(zhuǎn)變、酶促或化學(xué)反應(yīng)將其轉(zhuǎn)變“等差數(shù)列等差數(shù)列”（n=1n=1）；）； 3 3、PAGEPAGE； 4 4、讀序。、讀序。 分析基因組核苷酸排列序列分析基因組核苷酸排列序列 分析基因序列分析基因序列 基因定點誘變的基礎(chǔ)基因定點誘變的基礎(chǔ) 基因工程載體構(gòu)建中基因工程載體構(gòu)建中DNA序列定位和排序的基礎(chǔ)序列定位和排序的基礎(chǔ) 確定確定DNA序列中蛋白質(zhì)的編碼區(qū)序列中蛋白質(zhì)的編碼區(qū)Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法 （直讀，（直讀，Sanger雙脫氧末端法也是直讀法）法雙

21、脫氧末端法也是直讀法）法是是Maxam和和Gilbert等人等人1977年創(chuàng)建的，用來測定年創(chuàng)建的，用來測定DNA序列。序列?；瘜W(xué)法是用化學(xué)試劑在化學(xué)法是用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定地裂解處特定地裂解DNA片段，片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈（等差數(shù)列產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈（等差數(shù)列 n=1），經(jīng)過），經(jīng)過PAGE和放和放射自顯影后，可以直接讀出射自顯影后，可以直接讀出DNA的順序。的順序。 某些試劑能修飾或破壞某些試劑能修飾或破壞DNA鏈上特定核苷酸的堿基進而使鏈上特定核苷酸的堿基進而使N-糖苷鍵斷糖苷鍵斷裂，暴露出的糖環(huán)以裂，暴露出的糖環(huán)以-消除反應(yīng)，在消除反應(yīng)，在3和和5位上斷裂磷酸二

22、酯鍵。使戊糖脫位上斷裂磷酸二酯鍵。使戊糖脫落，用于嘌呤環(huán)的試劑是硫酸二甲酯，而聯(lián)氨可用于肼解嘧啶環(huán)。落，用于嘌呤環(huán)的試劑是硫酸二甲酯，而聯(lián)氨可用于肼解嘧啶環(huán)?；瘜W(xué)裂解法測序的原理化學(xué)裂解法測序的原理1 1、用放射性核素標記待測、用放射性核素標記待測DNADNA一側(cè)末端一側(cè)末端2 2、將標記、將標記DNADNA分為分為G G、A+GA+G、C+TC+T、C 4C 4個反應(yīng)體系個反應(yīng)體系3 3、用不同的化學(xué)試劑處理不同反應(yīng)體系，隨機斷裂、用不同的化學(xué)試劑處理不同反應(yīng)體系，隨機斷裂DNADNA片段某種堿基中的片段某種堿基中的任何一個，產(chǎn)生一組一端為放射線標記的末端，另一端為不同大小的任何一個，產(chǎn)生一

23、組一端為放射線標記的末端，另一端為不同大小的DNADNA片段的混合物片段的混合物4 4、電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖譜，即可讀出、電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖譜，即可讀出DNADNA序列序列作用的堿基作用的堿基試劑與反應(yīng)試劑與反應(yīng)堿基釋放堿基釋放DNA斷裂斷裂強強G/弱弱A稀釋稀釋250倍硫酸二甲酯，在倍硫酸二甲酯，在50mM卡可酸（卡可酸（PH8.0）10MMgCl2、0.1MEDTA20060分鐘，分鐘，DNAG的的N7和和A的的N3甲基化甲基化甲基化嘌呤不穩(wěn)定，甲基化嘌呤不穩(wěn)定，在中型在中型PH加熱被破加熱被破壞壞在在0.1M堿中，堿中，9015分鐘，分鐘，戊糖脫

24、落，戊糖脫落，DNA鏈斷裂，鏈斷裂，G斷裂比斷裂比A快快5倍倍A同上同上0.2NHCl、0、60分鐘，堿基被破壞分鐘，堿基被破壞同上，同上，A斷裂比斷裂比G快快C+T15-18M聯(lián)苯胺、聯(lián)苯胺、2050分鐘，嘧啶環(huán)被破壞釋放分鐘，嘧啶環(huán)被破壞釋放0.5M哌啶處理，斷裂哌啶處理，斷裂DNA鍵，鍵，C與與T有同樣速率有同樣速率C2MNaCl，聯(lián)氨處理方法同上，聯(lián)氨處理方法同上，100分鐘，此時，分鐘，此時，T的的破壞被抑制，只有破壞被抑制，只有C被破壞釋放被破壞釋放同上，只在同上，只在C處斷裂處斷裂DNA鏈鏈 G反應(yīng)反應(yīng)-硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMS）使）使GN7甲基化，其后斷開了甲基化，其后斷開了C8-C9間的間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合?；瘜W(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。 G+A反應(yīng)反應(yīng)-（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。 T+C反應(yīng)反應(yīng)-肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。 C反應(yīng)反應(yīng)-在在NaCl存在時，只有存在時，只有C才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，被修飾的才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌