PCR試驗(yàn)室檢查要點(diǎn)2016

1、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢查要點(diǎn)指南（2016版）聚合酶鏈反應(yīng)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室是指通過(guò)基因擴(kuò)增的方式檢測(cè)特定的DNA或RNA的檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室。聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）是一種在體外特異性擴(kuò)增靶DNA序列的技術(shù)，其基本過(guò)程為模板雙鏈DNA的變性、引物與模板DNA的退火和在DNA聚合酶引導(dǎo)下的鏈延伸反應(yīng)三個(gè)階段的多次循環(huán)。每一次循環(huán)后的擴(kuò)增產(chǎn)物均可作為下一輪循環(huán)的模板，理論上，擴(kuò)增產(chǎn)物量呈指數(shù)形式上升，即經(jīng)過(guò)n個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)物量增加到2n倍。PCR試劑操作簡(jiǎn)單，短時(shí)間內(nèi)在體外可獲得數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異靶DNA序列的復(fù)制，為臨床疾病的診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估提供了一種

2、極有幫助的實(shí)驗(yàn)室輔助手段。PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室是PCR試劑生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品檢驗(yàn)過(guò)程中不可缺少的工作環(huán)境，具環(huán)境控制水平和質(zhì)量管理水平直接影響著最終產(chǎn)品是否合格，能否放行。由于該產(chǎn)品本身的特殊性，醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑、醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范體外診斷試劑現(xiàn)場(chǎng)檢查指導(dǎo)原則條款中，明確對(duì)PCR試劑的生產(chǎn)和檢驗(yàn)環(huán)境做出規(guī)定。此外現(xiàn)行衛(wèi)生行業(yè)的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)以及相關(guān)文獻(xiàn)中對(duì)于PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室均作出規(guī)定，主要涉及全國(guó)臨床檢驗(yàn)規(guī)程（第三版）、醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)2010194號(hào)）、醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則及臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的應(yīng)用（WS/T230

3、-2002）等行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求。本檢查指南旨在幫助北京市醫(yī)療器械監(jiān)管人員增強(qiáng)對(duì)PCR檢驗(yàn)相關(guān)過(guò)程的認(rèn)知和把握，指導(dǎo)全市醫(yī)療器械監(jiān)管人員對(duì)PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建設(shè)與質(zhì)量控制的監(jiān)督檢查工作。同時(shí)，為PCR試劑生產(chǎn)企業(yè)在PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)建造和管理要求提供參考。當(dāng)國(guó)家相關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)、檢查要求發(fā)生變化時(shí)，應(yīng)當(dāng)重新討論以確保本檢查指南持續(xù)符合要求。一、適用范圍本檢查指南可作為北京市食品藥品監(jiān)督管理局組織、實(shí)施的體外診斷試劑產(chǎn)品注冊(cè)質(zhì)量管理體系現(xiàn)場(chǎng)核查、醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證現(xiàn)場(chǎng)核查、醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)督檢查等各項(xiàng)涉及PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢查的參考資料。基因測(cè)序檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室等涉及PCR試劑的相關(guān)部分應(yīng)當(dāng)參照本檢查

4、指南執(zhí)行。二、檢查要點(diǎn)（一）現(xiàn)場(chǎng)查看生產(chǎn)企業(yè)PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室布局生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)提供PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)方案和/或平面設(shè)計(jì)圖（應(yīng)當(dāng)標(biāo)明風(fēng)向或壓差梯度）。1 .PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室與PCR試劑生產(chǎn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)在各自獨(dú)立的建筑物或空間內(nèi)，保證空氣不直接聯(lián)通，防止擴(kuò)增時(shí)形成的氣溶膠造成交叉污染。2 .原則上PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域：試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并。若使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀且不需要進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)物分析工作，擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。若使用樣本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測(cè)為一體的自動(dòng)化分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。

5、3 .各區(qū)域在物理空間上應(yīng)當(dāng)完全相互獨(dú)立，各區(qū)域無(wú)論是在空間上還是在使用中，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)。不應(yīng)當(dāng)只是形式上的分區(qū)，不應(yīng)當(dāng)是一個(gè)區(qū)域嵌套一個(gè)區(qū)域。4 .各區(qū)域不應(yīng)當(dāng)有空氣的直接相通。擴(kuò)增區(qū)與擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)各區(qū)域宜采用獨(dú)立直排方式出風(fēng)。采用空調(diào)機(jī)組方式的，PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)具備獨(dú)立空調(diào)機(jī)組；同時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮停機(jī)后各房間空氣連通的可能性，采取必要的控制措施。5 .按照試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)一標(biāo)本制備區(qū)一擴(kuò)增區(qū)一擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力應(yīng)當(dāng)以遞減的方式進(jìn)行，使得PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向應(yīng)當(dāng)按照試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)一標(biāo)本制備區(qū)一擴(kuò)增區(qū)一擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)方向進(jìn)行，防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域

6、?？諝饬飨驊?yīng)當(dāng)為單向，禁止下游污染上游。應(yīng)當(dāng)設(shè)置合理的壓差梯度，并安裝壓差監(jiān)測(cè)裝置，以有效證明空氣流向，壓差梯度不宜低于5帕。6 .設(shè)置緩沖間的，緩沖間內(nèi)通向內(nèi)實(shí)驗(yàn)室和走廊的門(mén)應(yīng)當(dāng)安裝連鎖裝置或采取相應(yīng)措施，避免出現(xiàn)兩個(gè)門(mén)同時(shí)打開(kāi)的情況7 .各區(qū)間若設(shè)置傳遞窗，應(yīng)當(dāng)為雙側(cè)開(kāi)門(mén)，要求密封嚴(yán)實(shí)，并且兩側(cè)的門(mén)應(yīng)當(dāng)為互鎖裝置或采取相應(yīng)措施保證兩側(cè)門(mén)不會(huì)同時(shí)開(kāi)啟。(二)現(xiàn)場(chǎng)查看儀器設(shè)施配置1.試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)的功能：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：(1)溫度調(diào)控范圍為2c8c和(或)-20C以下冰箱；(2)混勻器；(3)微量加

7、樣器；(4)紫外消毒設(shè)備；(5)消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭；(6)專(zhuān)用工作服和工作鞋(套)；(7)專(zhuān)用辦公用品。2 .標(biāo)本制備區(qū)的功能：核酸(RNA、DNA)提取、貯存及加樣配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：(1)溫度調(diào)控范圍為2c8c和(或)-20C以下冰箱；(2)高速離心機(jī)；(3)混勻器；(4)水浴箱或加熱模塊；(5)微量加樣器；(6)紫外消毒設(shè)備；(7)生物安全柜；(8)消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯)；(9)專(zhuān)用工作服和工作鞋(套)；(10)專(zhuān)用辦公用品；(11)如需處理大分子DNA,應(yīng)當(dāng)具有超聲波儀。3 .擴(kuò)增區(qū)的功能：cDNA合成、DNA擴(kuò)增

8、及檢測(cè)。配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：(1)核酸擴(kuò)增儀；(2)微量加樣器；(3)紫外消毒設(shè)備；(4)消耗品：一次性手套、一次性帽子、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯)；(5)專(zhuān)用工作服和工作鞋；(6)專(zhuān)用辦公用品。4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的功能：擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測(cè)定。視檢驗(yàn)方法不同而定，基本配置如下：(1)微量加樣器；(2)紫外消毒設(shè)備；(3)消耗品：一次性手套、一次性帽子、加樣器吸頭(帶濾芯)；(4)專(zhuān)用工作服和工作鞋；(5)專(zhuān)用辦公用品。5.設(shè)備的維護(hù)保養(yǎng)應(yīng)當(dāng)建立設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)規(guī)程，計(jì)量設(shè)備應(yīng)當(dāng)定期檢定。例如核酸擴(kuò)增儀、微量加樣器、生物安全柜、離心機(jī)應(yīng)當(dāng)每年進(jìn)行檢定或校準(zhǔn)工作。（三）現(xiàn)場(chǎng)檢查工作

9、流程及注意事項(xiàng)1 .進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)一標(biāo)本制備區(qū)一擴(kuò)增區(qū)一擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。2 .各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。3 .不同工作區(qū)域的工作服應(yīng)當(dāng)加以區(qū)分，不得混用（例如可以采用不同顏色）。4 .實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)當(dāng)按照試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)一標(biāo)本制備區(qū)一擴(kuò)增區(qū)一擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具并防止交叉污染。實(shí)驗(yàn)垃圾屬于醫(yī)療廢物的應(yīng)當(dāng)按照醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例相關(guān)規(guī)定進(jìn)行處理。5 .工作結(jié)束后，應(yīng)當(dāng)立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔及消毒。6 .貯存試劑和用于標(biāo)本制備的消耗品等材料應(yīng)當(dāng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過(guò)擴(kuò)

10、增檢測(cè)區(qū)。應(yīng)當(dāng)對(duì)加樣吸頭、PCR反應(yīng)管等消耗品處理，防止污染。試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照品及質(zhì)控品應(yīng)當(dāng)保存在標(biāo)本處理區(qū)。試劑應(yīng)當(dāng)使用分子生物學(xué)級(jí)別試劑，使用的純化水應(yīng)當(dāng)高壓滅菌。質(zhì)檢用于原輔料、半成品、成品檢驗(yàn)用的PCR反應(yīng)試劑應(yīng)當(dāng)有相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及操作程序7 .為避免樣本間的交叉污染，加入待測(cè)核酸后，應(yīng)當(dāng)蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。應(yīng)當(dāng)注意PCR反應(yīng)液加樣的順序，應(yīng)當(dāng)為空白樣品一陰性對(duì)照一樣品一陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，應(yīng)當(dāng)在生物安全柜內(nèi)開(kāi)蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。8 .應(yīng)當(dāng)避免氣溶膠所致的污染，盡量減少在擴(kuò)增區(qū)內(nèi)的走動(dòng)，擴(kuò)增反應(yīng)管不得在擴(kuò)增區(qū)打開(kāi)。9 .擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)有可能存在某

11、些可致基因突變和有毒物質(zhì)如澳化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，應(yīng)當(dāng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。（四）現(xiàn)場(chǎng)檢查人員培訓(xùn)情況參與PCR檢驗(yàn)的工作人員應(yīng)當(dāng)具備相應(yīng)的專(zhuān)業(yè)知識(shí)和技能，包括能熟練操作相關(guān)設(shè)備，明確整個(gè)工作的流程，掌握出現(xiàn)污染情況的處理方法以及實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制方法和檢測(cè)結(jié)果的解釋。檢查人員可以通過(guò)詢(xún)問(wèn)或要求人員實(shí)際操作對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，也可以通過(guò)查閱人員培訓(xùn)記錄，對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。（五）現(xiàn)場(chǎng)檢查文件情況在檢查過(guò)程中應(yīng)當(dāng)特別注意現(xiàn)場(chǎng)查看、詢(xún)問(wèn)、記錄的實(shí)際情況與生產(chǎn)企業(yè)的文件規(guī)定、記錄的符合性。附件:理想的PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)產(chǎn)物分析區(qū)擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向?qū)Ｓ米呃?

12、fl緩沖間緩沖問(wèn)緩沖間匚作流向O圖A緩沖間為負(fù)壓的理想PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置模式產(chǎn)物分析區(qū)擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制各區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)空氣流向二KIWI空氣流向緩沖間r二空氣流向空氣流向緩沖問(wèn)緩沖間專(zhuān)用走廊4P1二作流向-0-圖B緩沖間為正壓的理想PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置模式圖A和圖B所給出的PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置圖是較為理想的設(shè)置模式，建議企業(yè)參照此種模式設(shè)計(jì)并建立實(shí)驗(yàn)室參考資料：1 .關(guān)于發(fā)布醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的公告（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第64號(hào)）2 .«關(guān)于發(fā)布醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑的公告（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2015年第103號(hào)）3 .關(guān)于印發(fā)醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范現(xiàn)場(chǎng)檢查指導(dǎo)原則等4個(gè)指導(dǎo)原則的通知（食藥監(jiān)械監(jiān)2015218號(hào)）4 .生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范（GB50346-2004）5 .實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求（GB19489-2008）6 .臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的應(yīng)用（WS/T203-2002）7 .全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程第3版,中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司，2006年11月2日8 .