銅(II)離子對生物廢水處理系統(tǒng)中微生物的毒性

1、銅（II）離子對生物廢水處理系統(tǒng)中微生物的毒性摘要銅是一種重要的元素，但是，這種重金屬在相對較低的濃度下是微生物活性的抑制劑。這項研究的目的是評估銅（II）對廢物處理過程中負責去除有機成分和營養(yǎng)物的各種微生物營養(yǎng)組的抑制作用。批次生物測定結(jié)果表明銅（II）對廢水處理系統(tǒng)中的關鍵微生物群體造成了嚴重的抑制。發(fā)現(xiàn)反硝化細菌對銅（II）的存在非常敏感。引起50%抑制（IC50）的銅（II）對脫氮酶代謝活性的濃度為0.95mgL-1。銅對發(fā)酵細菌，需氧葡萄糖降解異養(yǎng)菌和硝化細菌也有抑制作用（IC50值分別為3.5,4.6和26.5mgL-1）。盡管如此，反硝化和硝化細菌在暴露于高銅水平（分別高達25和

2、100mgCu（II）L-1）暴露僅幾天后，其代謝活性顯著恢復（分別用于脫氮和硝化）?；謴涂赡苁怯捎诳扇苄糟~的衰減或微生物的適應。一，簡介重金屬對環(huán)境，公眾健康和經(jīng)濟的潛在影響一直是近幾十年來的一個主要問題。銅，鋅，鎳和鎘等重金屬普遍存在于來自采礦，冶煉，半導體，冶金，電鍍和金屬加工行業(yè)。液體排放物中銅的濃度根據(jù)工業(yè)活動而顯著不同。例如，塞爾維亞銅礦'Cerovo”采礦廢水中的銅含量高達1550mgL-1（Stankovicetal。，2009）。銅在半導體出水中的濃度也很高，通常在5-100mgL-1范圍內(nèi)（Sierra-Alvarez等人，2007）。但是，市政廢水中的銅含量預計會

3、相當?shù)?，因為工業(yè)廢水將被來自居民來源的廢水稀釋。另外，吸附和沉淀反應會導致生物廢水處理系統(tǒng)中銅的去除。由Crane等人進行的研究（2010）報道了在不同類型的二級生物廢水處理過程中大量去除銅。在加入高達40mgCuL-1的臺架測定中，分別獲得了99,84和47%的活性污泥，滴濾液和膜生物反應器的銅去除率。銅是所有生物體必不可少的元素（Burgess等，1999;Cervantes和GutierrezCorona，1994）;然而，這種重金屬的高濃度抑制細胞代謝。含銅和銅的化合物被廣泛用作殺菌劑和殺真菌劑。銅的抗菌作用被認為是銅離子螯合巰基的能力，從而與細胞蛋白質(zhì)或酶相互作用（Yeager，19

4、91）。已經(jīng)進行了幾項研究來確定廢水處理過程中銅的微生物抑制潛力。銅對好氧異養(yǎng)細菌以及硫酸鹽還原和其他厭氧降解過程中微生物的抑制作用已被廣泛研究（Ahring和Westermann,1985;Jalali和Baldwin，2000;Karri2006;Lawrence和MeCwq，1965;Mori等，2000;Mosey和Hughes,1975;Utgikar等，2001）。相比之下，關于這種金屬對其他微生物群體在廢水處理中起關鍵作用的毒性的信息是有限的，例如硝化和反硝化微生物和葡萄糖發(fā)酵細菌。據(jù)報道即使對于同一營養(yǎng)組中的微生物抑制其生物活性的銅（II）濃度差別也是很大。例如，在硫酸鹽還原菌

5、的研究中觀察達到50%的銅（II）的抑制水平其濃度從僅0.84mgL-1至多達200mgL-1（Jalali和Baldwin，2000;Karri等人，2006;Sani等人，2001;Utgikar等人，2001）。在同樣的方法中，厭氧污泥中產(chǎn)甲烷微生物的銅抑制水平發(fā)生了顯著的變化，其數(shù)值從2.2mgL-1到400mgL-1幾個數(shù)量級（Ahring和Westermann，1985;Karri等人，2006;Lawrence和MeCwq,1965;Mori等人，2000;Mosey和Hughes,1975）。報道的銅在血管內(nèi)水平觀察到的顯著變化很可能是由于在各種實驗中使用的實驗條件的差異（例如

6、，培養(yǎng)基的組成，pH值，溫度，銅配體濃度如硫化物，等），已知會影響銅的特性和生物利用度。本研究的目的是評估銅（II）對廢水生物處理過程中涉及有機物和氮營養(yǎng)物質(zhì)去除的各種微生物種群的毒性效應。為了比較不同微生物種群的抑制水平，所使用的毒性生物測定被設計為最小化實驗變化（即pH值，微量元素溶液，溫度，振蕩條件在所有生物測定中相同）。2。材料和方法2.1。化學制品從SpectrumChemicalsandLaboratoryProducts（Gardena，CA，USA）獲得硝酸鉀和乙酸鈉（N99.0%純度）。從SigmaChemicalsCo.（St.Louis,MO,USA）購買脫水氯化銅（II

7、）（99.0%ACS級)，硫酸鈉(N99.5%)和硫酸(95-98%ACS級)。碳酸氫銨由MPBiomedicals(Solon,OH,USA)獲得。苯酚(99.0%ACS級)從EMDchemicals(Gibbstown,NJ,USA)獲得。無水D-葡萄糖購自MallinckrodtChemical(Paris,KY,USA)。N2/CO2氣體(80/20,v/v)由美國空氣公司(美國亞利桑那州鳳凰城)交付。所有的化學品都是按收到的使用2.2。污泥來源厭氧產(chǎn)甲烷顆粒污泥(Eerbeek和Aviko污泥)的兩種類型在這項研究中進行了評估。Eerbeek污泥來自工業(yè)厭氧污泥床(UASB)再處理再

8、循環(huán)廢水(Industriewater,Eerbeek,TheNetherlands),以及來自UASB反應器處理污泥處理廢水(Aviko,Steenderen,荷蘭)的Aviko污泥。將兩種接種物洗滌并篩分以除去細顆粒，并將其在4°C的氮氣下儲存。Eerbeek和Aviko污泥中揮發(fā)性懸浮固體(VSS)的含量分別為12.9%和11.5%。硝化試驗中使用的接種物RandolphParksludgeI是從全面污水處理設施(RandolphParkWastewaterReclamationFacility,Tucson,AZ,USA)的硝化階段獲得的。污泥中的VSS含量為4.8%。分別使

9、用Aviko顆粒污泥和RandolphParksludgeII在厭氧和好氧條件下獲得葡萄糖降解富集培養(yǎng)物。富集培養(yǎng)物是通過將培養(yǎng)上清液以葡萄糖消耗以5%(v/v)的速率成功轉(zhuǎn)移至含有新鮮葡萄糖的基礎培養(yǎng)基中而形成的。好氧污泥，蘭道夫公園污泥l(xiāng)I(0.13%VSS),從蘭道夫公園廢水回收設施的曝氣池獲得。所有的污泥樣品在4C的氮氣下儲存。2.3。培養(yǎng)基在三元生物測定法(BM-1)中提供的基礎礦物介質(zhì)的組成為(mgL-1)：NaHCO3(2000),NaH2PO4H2O(1200)和Na2HPO4(715)。包含(含L-1)：K2HPO4(250)的基礎礦物介質(zhì)在脫氮生物測定法(BM-2)(NH4

10、)HCO3(417)和NaHCO3(1500)。用于好氧異養(yǎng)生物測定和發(fā)酵毒性生物測定(BM-3)的基礎礦物介質(zhì)包含(inmgL-1)：NH4Cl(280);NaHCO3(2000);K2HPO4(250);KH2PO4(2050);CaSO42H2O(10),MgSO47H2O(100)和酵母提取物(50)。所有培養(yǎng)基中添加10mgL-1酵母提取物和1mLL-1微量元素溶液(50),FeCl24H2O(2000),ZnCl2(50),MnCl24H2O(50),(NH4)6Mo7O244H2O(50),AlCl36H2O(200),CuCl22H2O(30),NaSeO35H2O(100),

11、EDTA(1000),刃天青(200),CoCl26H2O和36%的HCl(1mLL-1)。所有培養(yǎng)基根據(jù)需要用HCl或NaOH調(diào)節(jié)至pH7.2。2.4。分批微生物毒性分析在各種毒性生物體中使用的實驗條件總結(jié)在表1中。除非另有說明,批量生物測定使用補充有50ml培養(yǎng)基的玻璃血清燒瓶(165ml)進行。使用氯化銅(CuCl22H2O)的濃縮儲備溶液加入所需量的銅(II)。在稀鹽酸(10mM)中制備儲備溶液以確保完全溶解銅。燒瓶缺乏銅也孵化和作為不受限制的控制。在厭氧和缺氧生物測定中,用丁基橡膠密封墊和鋁制卷曲密封封口，然后用N2:CO2氣體(80：20,v/v)沖洗頂部空間以確保無氧條件。好氧異

12、養(yǎng)和氮化生物測定的頂空是大氣,并且每天補充以防止氧的限制。在所有生物測定中,由于基礎礦物介質(zhì)的高緩沖能力，加入銅原液后的最終pH值約為7.2。硝化作用(mgNH4+-消耗的g-1VSSd-1),反硝化作用(mgNO3一g-1VSSd-1)和葡萄糖降解(mg葡萄糖降解的g-1VSSd-1)的最大活性由銨濃度，硝酸鹽濃度和葡萄糖消耗生物量濃度與時間(d),作三個平行重復測定的平均值計算得到。在每種情況下，在無銅對照顯示最大特異活性的時間段內(nèi),確定給定銅濃度下的最大特異活性。觀察到的抑制作用如下所示計算。與未抑制的對照相比，引起活性降低20,50和80%的銅(II)的初始濃度分別被稱為IC20,IC

13、50和IC80。這些值通過在繪制抑制劑濃度的作用所觀察到的抑制作用()的圖中插入來計算。除非另有說明,否則所報導的抑制濃度是三個平行相應標準偏差的平均值。2.5。分析方法使用Agilent7500a的電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）得到液體樣品中的銅（II）濃度。分析系統(tǒng)的功率為1500W，等離子氣體流量為15Lmin-1,載氣流量為1.2Lmin-1。取樣后立即用薄膜過濾（0.45pm）,用稀硝酸稀釋。如別處所述（Dubois等，1956）,用比色法測定糖。簡單地說，將0.5ml離心樣品轉(zhuǎn)移到試管中，然后加入0.5ml5%（v/v）苯酚和2.5ml濃硫酸?；靹驑悠凡⑹蛊潇o置7分鐘。隨后，

14、將管在45°C加熱20分鐘。使溶液冷卻，并通過在490nm處測量樣品的顏色強度來測定生物測定中的葡萄糖濃度。先前構建了含有范圍從2.9到14.3mgL-1的葡萄糖濃度的校準曲線。用空白樣品校正。使用Dionex3000系統(tǒng)（Sunnyvale，CA，USA），用DionexIonPacAS18分析柱（4X250mm）和AG18保護柱（4X40mm），通過抑制電導離子色譜分析硝酸鹽和亞硝酸鹽。該柱維持在35C。使用的洗脫液為10mMKOH，流速為1.0mLmin-1。注射量為25pL。在測量之前，將所有樣品離心（10,000rpm）10分鐘或者通過膜濾器（0.45pm）。使用Orion

15、Thermo組合離子選擇性電極測定銨。使用PerpHecTROSS玻璃組合電極以Orionmodel310PerpHecTpH-meter取樣后立即測定pH。揮發(fā)性懸浮物和其他分析參數(shù)是根據(jù)“水和廢水檢測標準方法”（APHA，1998）確定的。3。結(jié)果與討論圖1顯示了在0,1,2.5,5,10,25,35,50,80和100mg銅（II）L-1存在下硝化活性測定中來自氨的硝酸鹽形成的時間進程的說明性實例。含有銅（II）的處理中的硝化活性基于不含銅的不受抑制的對照的活性進行標準化。圖2A顯示硝化微生物作為初始銅（II）濃度的函數(shù)的標準化活性。由對照最大硝酸鹽形成時間計算其硝化活性，約90至180

16、小時。本研究中其他微生物的生物活性用相同的方法計算。3.1。葡萄糖發(fā)酵菌銅（II）在極低濃度時對污泥中的厭氧葡萄糖發(fā)酵微生物具有抑制作用（表2）。觀察厭氧培養(yǎng)物中銅濃度在0-10mgL-1范圍內(nèi)的葡萄糖利用率的顯著降低（圖3A）。厭氧富集培養(yǎng)和厭氧顆粒污泥（Aviko）對葡萄糖利用率產(chǎn)生50%抑制的銅（II）濃度分別為1.4和3.5mgL-1。這些結(jié)果表明，發(fā)酵微生物的生長在某種程度上與其代謝活性相比，更受銅（II）的影響。文獻中銅對發(fā)酵菌的IC50值差異很大。Lin和Shei（2008）使用蔗糖評估了銅對發(fā)酵產(chǎn)氫產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)在本研究中確定的IC50值與相同數(shù)量級（6.5mgL-1）的相同

17、。兩項研究銅對蔗糖產(chǎn)生H2的影響中（LiandFang，2007），一項來自乳品廢水（YuandFang,2001）實驗，IC50值高出一個數(shù)量級（分別為65和30mgL-1）。Zheng和Yu（2004）在評估銅對乳品廢棄物轉(zhuǎn)化為H2的影響的試驗中發(fā)現(xiàn)，其IC50值（350mgL-1）相當高。在厭氧環(huán)境降解有機物其他微生物如產(chǎn)甲烷菌和硫酸鹽還原菌相比發(fā)酵細菌似乎更容易受到銅的抑制作用，.IC50的可溶性銅與發(fā)酵細菌相比在這兩個微生物群落的結(jié)果往往是發(fā)酵細菌一個或多個數(shù)量級（Ahring和Westermann，1985;Jalali和Baldwin，2000;Karri等人，2006;Law-

18、rence和MeCwq，1965;Mori等人，2000;Mosey和Hughes,1975;Utgikar等，2001;Utgikar等，2003）。在葡萄糖發(fā)酵毒性測定中，觀察到可溶性銅（II）水平快速下降。圖4顯示了在實驗開始和結(jié)束時各種處理中測定的可溶性銅（II）的濃度。作為一個例子，Cu（II）L-1在2和50mgCu（II）L-1處理后分別只檢測到0.60和4.4mgCu（II）L-1。負責去除銅的機制可能是由于沉淀和吸附到污泥（Artolaetal。，1997;Karrietal。，2006）。礦物介質(zhì)中含有Bi-碳酸鹽，磷酸鹽和羥基基團;因此，由于CuCO3，Cu（OH）2和C

19、u3（PO4）2的溶解度較低的產(chǎn)物分別為2.5X10-10,2.2X10-20和1.4X10-37,會發(fā)生銅的化學沉淀Stumm和Morgan,1981）。銅還可以形成高度不溶性的沉淀物（硫酸銅的溶度積為8X10-37,Stumm和Morgan,1981）,這是負責厭氧生物反應器中（部分）銅解毒的過程。然而，由于硫酸鹽和硫化物鹽在所有生物測定中被排除在基礎礦物介質(zhì)之外，所以需要注意CuS的形成，以防止（生物）硫化物沉淀銅?？扇苄糟~濃度也可以通過將銅吸附到生物質(zhì)上而得到消除（Hu等，2004;White等，1995）,些研究表明銅的抑制作用隨著生物量的增加而降低銅的比例Braam和Kkapwij

20、k,1981;Pamukoglu和Kargi，2007）。吸附和沉淀反應會導致生物廢水處理系統(tǒng)和水生環(huán)境中銅的大量去除。一篇綜述提到，在活性污泥處理過程中，銅的去除率為33-98（Lester，1983）。3.2。硝化和脫硝銅（II）被發(fā)現(xiàn)抑制硝化微生物在aero-bic污泥。搖動的批次生物測定顯示隨著銅（II）含量的增加，氨消耗速率和硝酸鹽形成速率顯著降低（圖2A），在添加銅濃度為50mgL-1或更高時，幾乎完全抑制了硝化作用。IC20，IC50和IC80的值在表2中進行了總結(jié)。有趣的是，硝化細菌快速地適應銅（II），在銅暴露140小時后，最初被銅抑制的代謝活性大大增加（圖1）。銅濃度在50

21、100mgL-1范圍內(nèi)在120140h內(nèi)完全抑制，但隨后其活性急劇上升，達到接近不受抑制的水平。這種恢復可歸因于主要的硝化菌對銅（II）的生理適應或微生物群體向更耐銅的II（II）的轉(zhuǎn)換。介質(zhì)中銅濃度的逐漸下降可能是導致微生物適應毒性的另一個原因。文獻研究表明，金屬的毒性與溶液中的自由離子濃度有關，而與總金屬濃度有關（Campbell,1995）。與其他毒性生物測定法類似，測定可溶性銅（I）濃度的顯著降低。在實驗結(jié)束時對所有的硝化處理進行的可溶性銅（I）的分析證實，Cu濃度大大降低到只有0.25到0.51mgL-1。值得注意的是，低濃度的銅（II）（b10mgL-1）被發(fā)現(xiàn)對微生物將氨氧化成硝

22、酸鹽具有適度的刺激作用。文獻中早先報道了硝化的刺激作用。Barber和Stuckey（2000）觀察到，在生物反應器中加入銅（32mgL-1），硝化效率大大提高（提高了68%）。然而，持續(xù)補充銅在四周后就會停止硝化。從廢水中去除銅后，硝化作用恢復。銅是硝化所必需的，因為參與電子轉(zhuǎn)移鏈的許多酶以及主要的酶氨加合酶都含有銅（Jones，1982;Painter，1970）。銅被發(fā)現(xiàn)是潛在的抑制劑，可以抑制微生物的活性（圖2B）。確定的IC20，IC50和IC80值分別為0.40,0.95和2.50mgCu（II）L-1。然而，與硝化生物測定法類似，在所有處理的培養(yǎng)49-60小時后恢復了代謝活動含量

23、低于25mgCu（II）L-1的原因可能是由于微生物種群結(jié)構的改變導致對銅不敏感的脫氮物種占主導地位。另外，銅（II）的逐漸沉淀可能是對觀察到的行為的另一種可能的解釋。很少有文獻研究考慮了銅對反硝化微生物的抑制作用。唯一發(fā)現(xiàn)的研究指出銅濃度高達26mgL-1時對懸浮生長系統(tǒng)中的反硝化生物量沒有受到抑制（Kamath等，1991）。銅是脫氮所需的微量元素。參與脫氮的幾種酶，例如一些亞硝酸鹽還原酶和一氧化二氮還原酶是依賴于銅的酶（Stouthamer,1991;Vanniel等，1992）。根據(jù)這些結(jié)果，可以得出這樣的結(jié)論：與硝化劑相比，脫硝劑對銅（II）的抑制作用更容易受到影響。然而，在這兩種情況下，微生物種群在從廢水中回收氮的生物過程的恢復是