第五章 生產(chǎn)菌種的制備與保藏

1、發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY5 生產(chǎn)菌種的制備和保藏 本章提要 生產(chǎn)菌種的制備過程 生產(chǎn)菌種的質(zhì)量控制 生產(chǎn)菌種的保藏發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY5-1 生產(chǎn)菌種的制備過程 一、菌種擴大培養(yǎng)的目的 1.提供大量而新鮮的、具有較高活力的菌種。 目的： a、縮短發(fā)酵周期、降低能耗、減少染菌的機會（空氣過濾設(shè)備有效時間是有限的）。 b、為了使培養(yǎng)菌在數(shù)量上取得絕對的優(yōu)勢，抑制雜菌的生長。發(fā)酵

2、工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 從對數(shù)殘留定律上看，任何滅菌過程都不能夠做到絕對無菌，因此，抑制雜菌生長，使菌種在菌種在數(shù)數(shù)量上占量上占絕對絕對優(yōu)勢優(yōu)勢也是一種方法也是一種方法，往往是一種行之有效的方法。 2.讓菌種從固試管、液體試管、三角瓶，逐步適應(yīng)發(fā)酵要求。如：啤酒發(fā)酵。 3.菌種經(jīng)過擴大培養(yǎng)，可以提高生產(chǎn)的成功率，減少“倒罐”現(xiàn)象。 許多生產(chǎn)菌種往往都是“溶原性溶原性”的？ 通過連續(xù)的擴大培養(yǎng)，每一級都要進行發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制

3、備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 嚴格的檢查，對于不合格的嚴禁使用，無疑增加了生產(chǎn)的可靠性。 生產(chǎn)菌種的制備一般包括兩個過程，即在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)孢子的孢子制備過程和在液體培養(yǎng)基中生產(chǎn)菌絲的種子制備過程。 二、孢子制備 1.放線菌孢子的制備 孢子的制備是生產(chǎn)菌種生產(chǎn)的開始，是發(fā)酵生產(chǎn)的第一個環(huán)節(jié)。孢子的質(zhì)量、數(shù)量對以后菌絲的生長、繁殖和代謝產(chǎn)物的形成有重要影響。 發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 不同菌種的孢子制備工藝有不同的特點。 放線菌孢子的培養(yǎng)一般采用斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)

4、基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、蛋白胨和無機鹽等。 通常情況下,干燥和限制營養(yǎng)可直接和間接誘導(dǎo)孢子形成。放線菌斜面的培養(yǎng)溫度一般為28，少數(shù)為37，培養(yǎng)時間為5-14d。發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 2.霉菌孢子的制備 培養(yǎng)霉菌孢子的培養(yǎng)基成分一般為大米、玉米、麩皮、麥粒等農(nóng)產(chǎn)品。這些農(nóng)產(chǎn)品的營養(yǎng)成分比較適合適合霉菌孢子的繁殖，而且這類培養(yǎng)基的表面積較大，可獲得大量的孢子。 霉菌的培養(yǎng)溫度一般為25-28 ，培養(yǎng)時間為4-14d。 霉菌孢子的制備方法：菌種 母茄子瓶（孢子） 子茄

5、子瓶（孢子） 搖瓶種子（菌絲） 3.細菌孢子的制備 發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 細菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方，牛肉膏、蛋白胨常作有機氮源。 細菌培養(yǎng)溫度大多為37 ，少數(shù)為28 ，細菌培養(yǎng)時間一般為1-2d。芽孢細菌則為5-10d。 三、種子制備 種子制備是將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的孢子或菌體接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其形成大量菌絲或菌體的過程。發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSIT

6、Y 1.搖瓶種子的制備通常有兩種方法： 固體法：用于釀造業(yè)（白酒等），也是源于釀造業(yè)， 有霉菌的純培養(yǎng)，也有混合培養(yǎng)如：大曲。 液體法：液體深層培養(yǎng)，適合于眾多發(fā)酵行業(yè)。 （1）液體擴培流程 固體試管 三角瓶 大三角瓶 一級種子 二級種子 三級種子 發(fā)酵罐 （2） 固體擴培流程 固體試管 三角瓶 種曲 麩曲（機械通風制曲）發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 2.種子罐種子的制備 種子罐種子的制備工藝過程，因菌種不同而異，一般可分為一級種子、二級種子和三級種子的制備。 現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展是以基因工

7、程菌為主導(dǎo)的微生物發(fā)酵，其菌種的培養(yǎng)要求無菌程度高，而且培養(yǎng)過程中的條件要求也非常嚴格（ 否則易發(fā)生變異丟失質(zhì)粒易發(fā)生變異丟失質(zhì)粒），從這種意義上講，固體菌種的制備是難以實現(xiàn)的，因此，應(yīng)以液體培養(yǎng)為主導(dǎo)方式。發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY5-2 生產(chǎn)菌種的質(zhì)量控制 一、影響孢子質(zhì)量的因素及其控制 （一）培養(yǎng)基 通常，對于種子用的培養(yǎng)基，搖瓶與種子罐用的培養(yǎng)基也不相同，搖瓶要求培養(yǎng)基用的原材料精細精細，碳源濃度較低較低而且是用微生物較易利用較易利用的碳源。 對于種子罐用培養(yǎng)基，要求使用接近大生

8、產(chǎn)用的原材料，氮源濃度較高，有利于菌體的增殖。發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY （二）培養(yǎng)溫度和濕度 許多微生物其最適生長溫度與最適發(fā)酵溫度往往有差異的，例如：谷氨酸發(fā)酵，谷氨酸產(chǎn)生菌的最適生長溫度為30，而最適產(chǎn)物合成溫度為32-34。 種子擴大培養(yǎng)的溫度的選擇，應(yīng)該考慮的是菌體的快速增殖上，一方面可以縮短縮短周期，另一方面有利于抑制抑制其他雜菌的生長。發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 濕度

9、是指斜面培養(yǎng)時的相對濕度相對濕度, ,它它對孢子形成的速度、數(shù)量和質(zhì)量有很大影響。 （三）培養(yǎng)時間和冷藏時間 絲狀菌在斜面培養(yǎng)基上生長發(fā)育可分為五個階段五個階段，即孢子萌發(fā)和基內(nèi)菌絲生長、氣生菌絲生長、孢子的形成、孢子的成熟、斜面衰老菌絲自溶。 發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 1.孢子的培養(yǎng)時間 基內(nèi)菌絲和氣生菌絲內(nèi)的核物質(zhì)和細胞質(zhì)呈液態(tài)，各菌絲內(nèi)質(zhì)量質(zhì)量是不同的，有的含有核粒、有的沒有。這是孢子培養(yǎng)的初期。 孢子的培養(yǎng)時間一般選擇在孢子成熟階段成熟階段，此時在光鏡下可以看見成串孢子成串孢子

10、和游離的分散孢子游離的分散孢子。 2. 孢子的冷藏時間 發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 斜面孢子的冷藏時 間，對孢子質(zhì)量也有影響，總的原則是冷藏時間宜短不宜長。 （四）接種量 制備孢子時接種量要適當，種量過大或過小都會對孢子的質(zhì)量產(chǎn)生影響。一般要求接種后均勻分布整個斜面，基本可見單菌落者為適當。接種搖瓶的斜面孢子，要求菌落疏密適中，孢子數(shù)達到要求。發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 小結(jié) 本次

11、課首先介紹了菌種擴大培養(yǎng)的目的，其次介紹了菌種生產(chǎn)的制備過程：孢子制備、種子制備。第三介紹了影響孢子質(zhì)量的因素及其控制：培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和濕度、培養(yǎng)時間和冷藏時間、接種量。發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 二、影響種子質(zhì)量的因素及其控制 影響種子質(zhì)量的因素有孢子質(zhì)量、培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件、種齡和接種量等。 種子的制備目的是為生產(chǎn)提供一定數(shù)量和質(zhì)量的種子，而且要求菌種處于其生命活動的最旺盛時期，一般是菌種培養(yǎng)的對數(shù)期。 （一）培養(yǎng)基 與孢子培養(yǎng)基成分對孢子質(zhì)量有較大影響一樣，種子培養(yǎng)基的原材

12、料也對種子質(zhì)量有較大的影響。 種子培養(yǎng)基成分首先應(yīng)滿足種子培養(yǎng)的發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 需要，一般選擇一些有利于孢子發(fā)芽和菌絲生長的營養(yǎng)成分，如氮源和維生素等，使培養(yǎng)的菌絲粗壯、活力強。其次，種子培養(yǎng)基成分應(yīng)盡可能同發(fā)酵培養(yǎng)基成分相似，以適應(yīng)發(fā)酵生產(chǎn)的要求。 發(fā)酵培養(yǎng)基濃度一般較小，種子培養(yǎng)過程pH一般較穩(wěn)定，這樣可以較好地滿足菌種的生長發(fā)育。 （二）培養(yǎng)條件 種子的培養(yǎng)條件一般包括溫度、通氣（供氧）、攪拌強度等對菌種培養(yǎng)的影響。因此，發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章

13、第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 在培養(yǎng)過程中，我們要給予這些參數(shù)高度關(guān)注，盡可能地將其控制在最適條件下。 （三）種齡 種子的培養(yǎng)時間稱為種子的種齡。在種子培養(yǎng)罐中，隨著種子培養(yǎng)時間的延長，菌體數(shù)量逐漸增加。但是菌體繁殖到一定程度，由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、代謝產(chǎn)物的積累，菌體數(shù)量不再增加，菌體逐漸衰老。 由于菌體在不同的生長發(fā)育階段其生理活性差別很大，所以應(yīng)特別重視種子的種齡。發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 種子的種齡過老則；適中則.；過短則

14、。最適種齡因菌種不同而有很大差異。細菌菌種種齡一般為7-12h；霉菌菌種種齡一般為16-50h，放線菌菌種種齡為20-65h。 （四）接種量 種子培養(yǎng)液的體積與接種后發(fā)酵液的體積之比稱為接種量。發(fā)酵液的接種量大小與菌種特性、種子質(zhì)量和發(fā)酵條件有關(guān)。 不同微生物菌種的接種量不同，細菌類一般為0.1%-2%，霉菌和酵母菌一般為10%，抗生素菌種一般為7 % -15%，甚至更多一些。 發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY （五）種子的質(zhì)量標準 不同微生物菌種的種子質(zhì)量標準不同，在生產(chǎn)上主要有以下幾個指標

15、。 1.細胞或菌體 菌體形態(tài)、數(shù)量、生長量（OD)、培養(yǎng)液外觀，是種子質(zhì)量的重要指標。 2.生化指標 種子液的糖、氮、磷含量的變化pH變化是菌體生長繁殖、物質(zhì)代謝的反映，所以，它們也是指標之一。 3.產(chǎn)物生成量 重要指標之一，是種子生產(chǎn)能力和成熟度的反映。發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 4.酶活力 指標之一。 5.無污染 （六）種子異常的分析 1.菌種生長發(fā)育緩慢或過快 菌種生長發(fā)育緩慢或過快與孢子質(zhì)量和培養(yǎng)條件有關(guān)。無菌空氣的溫度和培養(yǎng)基滅菌條件差影響大。 2.菌絲結(jié)團 在液體培養(yǎng)條件下，

16、菌絲生長聚集成團狀稱為菌絲結(jié)團。菌絲結(jié)團會影響菌的呼吸和對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。 發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 菌絲結(jié)團和攪拌效果差、接種量小有關(guān)。 3.菌絲粘壁 指在種子培養(yǎng)過程中，由于攪拌效果不好、泡沫過多以及種子罐裝料系數(shù)過小等原因，使菌絲逐漸黏附在罐壁上，最后可能形成菌絲團。5-3 生產(chǎn)菌種的保藏 一、菌種保藏的目的與原理 一個優(yōu)良的菌種被選育出來之后，要保持其生產(chǎn)性能的穩(wěn)定，不污染，不死亡，這就是菌中保藏的目的。發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)

17、菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY （一）菌種保藏的原理 菌種保藏是根據(jù)菌種的生理生化特性，人為創(chuàng)造條件使菌種處于代謝的不活躍狀態(tài)，保持菌種的生產(chǎn)性能。 低溫、干燥、缺氧。 （二）菌種保藏的方法 1.低溫斜面保藏法 此法是利用低溫降低菌種的新陳代謝，使菌種的特性在短期保持不變。 4冰箱保藏。1-3月。 2.液體石蠟封存保藏法發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY 1cm。 4冰箱保藏。1年。 3.固體曲保存法 適用于真菌孢子。培養(yǎng)基成分為麩皮、大米、小米、麥粒等。 保藏期1

18、-年。 4.沙土管保藏法 適用于產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌和產(chǎn)芽孢的細菌。 5.冷凍干燥法 6.液氮超低溫保藏法 （三）菌種保藏的注意事項 1.菌種在包藏前所處的狀態(tài) 2.菌種保藏所用的基質(zhì)發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL UNIVERSITY3.操作過程對細胞結(jié)構(gòu)的損害二、菌種的復(fù)壯措施：1.純種分離2.淘汰衰退的個體3.選擇合適的培養(yǎng)條件三、國內(nèi)外主要菌種保藏機構(gòu)介紹(一）國外菌種保藏機構(gòu)（二）國內(nèi)菌種保藏機構(gòu)發(fā)酵工藝學發(fā)酵工藝學生命科學系生命科學系 第五章第五章 生產(chǎn)菌種的制備生產(chǎn)菌種的制備YANGTZE NORMAL