實驗四 電泳技術-LDH-SDS-PAGE及western__ blotting

1、實驗四實驗四電泳技術電泳技術一、定義一、定義 帶電顆粒在電場作用下向著與其電性相反的電極帶電顆粒在電場作用下向著與其電性相反的電極移動的現象，稱為電泳。移動的現象，稱為電泳。 帶正電荷的粒子向負極移動，帶負電荷的粒子向帶正電荷的粒子向負極移動，帶負電荷的粒子向正極移動。正極移動。 是生化與分子生物學的重要研究方法之一，可用是生化與分子生物學的重要研究方法之一，可用于于樣品分離、物質純度分析和分子量的測定樣品分離、物質純度分析和分子量的測定等。等。第一節(jié)第一節(jié) 電泳的基本原理電泳的基本原理+-1.1.許多生物分子帶有電荷，在電場中可以發(fā)生許多生物分子帶有電荷，在電場中可以發(fā)生 移動。移動。2.2

2、.每種分子遷移率不同，一定時間內在電場中每種分子遷移率不同，一定時間內在電場中 的遷移距離不同。的遷移距離不同。在一定在一定pH條件下，每一種分子條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數都具有特定的電荷（種類和數量）、大小和形狀，在一定時量）、大小和形狀，在一定時間內它們在相同電場中泳動速間內它們在相同電場中泳動速度不同，各自集中到特定的位度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術就是帶電粒子可以用電泳技術進行分離、分析和鑒定的基本進行分離、分析和鑒定的基本原理原理。原理原理二、電泳遷移率二、電泳遷移率 設一帶電粒子在電場中所受

3、的力為設一帶電粒子在電場中所受的力為F F，則，則 F = QEF = QE（Q Q為粒子所帶電荷，為粒子所帶電荷，E E為電場強度）為電場強度） 根據根據StokeStoke定律，一球形分子在溶液中運動定律，一球形分子在溶液中運動 所受的阻力所受的阻力f f為：為： f f = 6 = 6rvrv（v v為分子移動速度；為分子移動速度；r r為分子半徑；為分子半徑；為介質為介質 黏度）黏度） 當分子達到動態(tài)平衡時，當分子達到動態(tài)平衡時， F = F = f f 即即 QE= 6QE= 6rvrv 移項得移項得 v/E=Q/ 6rv/E=Q/ 6r v/E:v/E:表示單位電場強度時粒子運動速

4、度，稱表示單位電場強度時粒子運動速度，稱 為為遷移率遷移率，也稱，也稱電泳速度電泳速度，以，以 表示表示。 因此上式也可表示為：因此上式也可表示為： = = Q Q / 6/ 6r r 從上式可推知，從上式可推知，帶電粒子在電場中的移動與帶電粒子在電場中的移動與: : 粒子大小有關，顆粒愈小愈快粒子大小有關，顆粒愈小愈快 粒子的電荷有關，電荷愈多愈快粒子的電荷有關，電荷愈多愈快 粒子的形狀有關，愈接近球形愈快粒子的形狀有關，愈接近球形愈快三、影響遷移率的因素三、影響遷移率的因素1.1.電場強度（電場強度（E E） 電場強度是指每厘米的電位降。電泳速度與電場電泳速度與電場 強度成正比。強度成正比

5、。電場強度越高電泳速度越快電場強度越高電泳速度越快。 根據電場強度大小，電泳可分為： 常壓電泳：210V/cm 高壓電泳：20200V/cm2.2.溶液的溶液的pHpH值值 pH值決定帶電顆粒的解離程度，決定物質所帶凈電荷的多少。選擇合適pH，使混合物中各成分所帶電量差別較大。 pHpIpHpI帶負電帶負電 pHpIpHpI時從陰極向陽極依次排列為LDH5、LDH4、LDH3、LDH2、LDH1 。 血清LDH同工酶檢測的臨床意義：血清LDH同工酶的正常值為LDH1 32.7%、LDH2 45.1%、LDH3 18.5%、LDH4 2.9%、LDH5 0.8% 不同組織中LDH同功酶譜不一樣，臨床上可根據酶譜的變化協(xié)助診斷 檢測原理 乳酸鈉為基質，在輔酶I（NAD+）的存在下，LDH能使乳酸鈉脫氫生成丙酮酸，而NAD+還原成NADH+H+，NADH+H+可將氫傳遞給吩嗪二甲酯硫酸鹽