達(dá)安HBV-DNA定量試劑說(shuō)明書(shū)

1、HBV-DNA PCR 檢測(cè)規(guī)程文件編號(hào)：SZGL-C005-00版本：00修訂次數(shù)：00 末次修（制）訂日期：200308221目的規(guī)范LightCycler 熒光PCR檢測(cè)儀檢測(cè)乙型肝炎病毒（HBV-DNA ）的檢驗(yàn)工作，指 導(dǎo)檢驗(yàn)人員正確進(jìn)行乙肝病毒核酸定量的檢測(cè)，保證檢驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量。2 范圍本規(guī)程適用于 LightCycler 熒光PCR檢測(cè)儀檢測(cè)乙型肝炎病毒（ HBV-DNA ）3試劑中山大學(xué)達(dá)安基因公司乙肝病毒（HBV）核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒4儀器Roche LightCycler 熒光 PCR 檢測(cè)儀高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)微量加樣器（覆蓋1-1000訕）5樣品處理樣品處理按PCR實(shí)驗(yàn)

2、室標(biāo)本處理規(guī)程進(jìn)行收集和處理，具體操作見(jiàn)本規(guī)程附錄1和附錄2。6測(cè)定6.1 PCR擴(kuò)增6.1.1打開(kāi)穩(wěn)壓器電源，再打開(kāi)計(jì)算機(jī)電源。6.1.2打開(kāi)擴(kuò)增儀電源，按儀器操作規(guī)程進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)條件設(shè)定。6.1.3將循環(huán)條件設(shè)定為：程序循環(huán)溫度保持時(shí)間11次93 C2分鐘240次93 C5秒57 C45秒31次40 C0秒6.1.4檢查反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器。6.1.5將待反應(yīng)的PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀中，并根據(jù)實(shí)際情況和儀器操作規(guī)程在程序中定 好反應(yīng)孔位置。6.1.6關(guān)閉擴(kuò)增儀蓋，按儀器操作規(guī)程開(kāi)始循環(huán)。6.1.7擴(kuò)增結(jié)束后關(guān)閉擴(kuò)增儀電源，取出PCR反應(yīng)管，密封放入垃圾桶。6.2產(chǎn)物分析

3、6.2.1條件設(shè)置：反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件，調(diào)整熒光數(shù)值為F1/F2。點(diǎn)擊Quan tification讀取結(jié)果。6.2.2基線的確定：取38個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)。6.2.3噪聲容限（閾值）：調(diào)節(jié)在陰性質(zhì)控品以上，要求在 Step3 : Analysis下相關(guān)性r值v -0.97，接近-1.0。6.2.4對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)：保證陰性質(zhì)控品的Ct值不出現(xiàn)任何數(shù)值（默認(rèn)為40 ）。6.2.5最后記錄儀器自動(dòng)分析計(jì)算出的未知標(biāo)本數(shù)值（ M ），關(guān)閉計(jì)算機(jī)。7 結(jié)果判斷7.1如果Ct值=40,則實(shí)驗(yàn)樣品的 UU DNA 含量（基因拷貝數(shù)/ml ）v 1 X103。7.2如果Ct值v 40,則實(shí)驗(yàn)樣品的 UU

4、 DNA 含量（基因拷貝數(shù)/ml ）= M7.3檢測(cè)樣本中核酸陽(yáng)性時(shí)，按實(shí)際結(jié)果報(bào)告；對(duì)可疑結(jié)果應(yīng)復(fù)查，需要時(shí)與臨床聯(lián)系。8 注意事項(xiàng)8.1 各標(biāo)本沸水浴時(shí)間誤差不超過(guò)1分鐘。8.2 加樣時(shí)每加完一個(gè)要立即蓋上封閉好離心管。9支持性文件9.1 乙型肝炎病毒核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)8.2 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范10 質(zhì)量記錄第3頁(yè)共4頁(yè)HBV-DNA PCR 檢測(cè)規(guī)程文件編號(hào)：SZGL-C005-00版本：00修訂次數(shù)：00 末次修（制）訂日期:20030822文件編號(hào)：SZGL-C005-00附錄1: HBV項(xiàng)目標(biāo)本采集、運(yùn)送流程圖附錄2: HBV樣本處理流程圖 將血清標(biāo)本

5、6,000rpm.離心20s吸取上層血清40ul加入40UIDNA提取液上機(jī)擴(kuò)增充分振蕩充分混勻插入圓形卡盤(pán)倒置10秒100 C沸水浴10min4C充分裂解轉(zhuǎn)置小時(shí)反應(yīng)管6,000rpm離心20秒第5頁(yè)共4頁(yè)10,000rpm 離心 5min文件編號(hào)：SZGL-C005-00取上清2ul點(diǎn)樣陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋及處理:8陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品（1 x 10基因拷貝/ml ）以下步驟同標(biāo)本處理加40ul40ulDNA提取液充分混勻分別吸取陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)梯度 和陰性質(zhì)控管各40ul 6,000rmp離心數(shù)秒以陰性質(zhì)控品為稀釋液將陽(yáng)性 標(biāo)準(zhǔn)品作107104的倍比稀釋熒光探針定量PCR技術(shù)原理及應(yīng)用PCR技術(shù)是通過(guò)對(duì)基因的

6、選擇性片段進(jìn)行體外高效擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)目的基因的檢測(cè)。熒光探針定量PCRFQ-PCR是一種新的基因定量檢測(cè)技術(shù)，國(guó)外文獻(xiàn)多用“實(shí)時(shí)定量 PCRreal time quantitative PCR或“ TaqMan PCR以美國(guó)PE公司商標(biāo)命名）”。該技術(shù)是在常規(guī) PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針，巧妙地把 核酸擴(kuò)增（PCR、雜交及光譜技術(shù)結(jié)合在一起，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的基因的準(zhǔn)確定量檢測(cè)，正發(fā)展成為臨床 實(shí)驗(yàn)診斷的常規(guī)技術(shù)。1.原理FQ-PCR的工作原理1-3是利用Taq酶的5'- 3 '外切酶活性，在 PCF反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個(gè)熒光標(biāo)記的探針。該探針可與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜

7、交，探針的 5'端標(biāo)以熒光報(bào)告基團(tuán)FAM（6-羧基熒光素，熒光發(fā)射峰值在 518mm處），靠近3'端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán) TAMRA（6羧基四甲基 諾丹明，熒光發(fā)射峰值在582nm處），兩者之間構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。當(dāng)探針保持完整時(shí)，5'端熒光報(bào)告基團(tuán)HBV-DNA PCR 檢測(cè)規(guī)程文件編號(hào)：SZGL-C005-00版本：00修訂次數(shù)：00 末次修（制）訂日期：20030822所激發(fā)出的熒光信號(hào)被 3 '端淬滅基因吸收或抑制，不出現(xiàn)熒光信號(hào)變化。當(dāng)PCF反應(yīng)體系中有目的基因存在，就會(huì)擴(kuò)增岀特異核酸片段，熒光探針即會(huì)根據(jù)堿基配對(duì)的原理與之雜交。當(dāng)PCR進(jìn)入延伸（復(fù)制）期，

8、Tap酶從引物3'端開(kāi)始，隨新鏈延伸沿DNA模板移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)到探針結(jié)合的位置時(shí)，其5'一 3 '端外切酶活性作用，將探針切斷（切口平移效應(yīng)）。熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)間的能量傳遞結(jié)構(gòu)被破壞，淬 滅基團(tuán)的淬滅作用被解除， 熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)釋放出來(lái) （圖1）。PCR反應(yīng)每復(fù)制一個(gè)特異核酸片段， 就有一個(gè)探針被切斷，伴隨一個(gè)熒光信號(hào)的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和 PRC產(chǎn)物是一對(duì)一的關(guān)系， 因此用熒光檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)岀的熒光信號(hào)有無(wú)或強(qiáng)弱，即代表擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)或多少。由于熒光信號(hào)是代表擴(kuò)增產(chǎn)物的有效特異信號(hào)，無(wú)需進(jìn)行有效和無(wú)效信號(hào)分離，實(shí)現(xiàn)了儀器實(shí)時(shí)檢測(cè)（圖2），為新的PC

9、R定量原理創(chuàng)造了條件。圖1.TaqMan PCR反應(yīng)模式（A）聚合反應(yīng)：（B）鏈置換；（C）裂解;（D）聚合完成（R: FAM Q TAMRA FP:上游引物；RP下游引物）I fil s MMHH4 11 2 3 & » a ? « 9 M> 1113 14 16 W 17 tt 14 2C 21 z? 23 24 »27 2S 24 30圖2.FQ-PCR實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)曲線ABI公司首先根據(jù)上述原理研制了 ABI 7700等系列定量PCR儀，在PCR反應(yīng)中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)模板系 列（一般57個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度）反應(yīng)管和空白對(duì)照管。通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)，計(jì)算

10、岀RQ+ RQ-、 RQ RQ+弋表樣品管熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)光強(qiáng)度與淬滅基團(tuán)發(fā)光強(qiáng)度的比率，RQJ弋表空白管中二者的比率， RQQ RQ = RQ+-RQ-）代表PCR過(guò)程中熒光信號(hào)變化量。當(dāng)熒光信號(hào)增強(qiáng)到某一閾值（根據(jù)熒光信號(hào)基線的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算岀以99.7%的置信度大于平均值作為閾值）時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)模板反應(yīng)管所用的循環(huán)次數(shù)（ Ct值）就被記錄下來(lái)。Ct值與標(biāo)準(zhǔn)模板數(shù)量的對(duì)數(shù)值之間有嚴(yán)格的線性關(guān)系3,利用系列標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），根據(jù)待測(cè)樣品的 Ct值，就可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定待測(cè)樣品起始的DNA數(shù)量。根據(jù)數(shù)據(jù)處理，即可得出定量結(jié)果。探針設(shè)計(jì)一般應(yīng)符合以下條件2:探針長(zhǎng)度應(yīng)在204

11、0個(gè)堿基左右， 以保證結(jié)合的特異性。 GC堿基含量在40%60%避免單核苷酸序列的重復(fù)。避免與引物發(fā)生雜交或重疊。探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度，因此探針的Tm值要比引物的Tm值至少高岀5'C。另外，探針的濃度，探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。U9CO圖3.FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線2. 技術(shù)特點(diǎn)2.1 封閉狀態(tài)下檢測(cè)，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物污染而致的假陽(yáng)性傳統(tǒng)PCR于反應(yīng)結(jié)束后取出反應(yīng)液，通過(guò)電泳染色和紫外儀觀察結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物在開(kāi)放狀態(tài)下分析，對(duì)實(shí)險(xiǎn)室的污染是不可避免的。因污染而導(dǎo)致假陽(yáng)性，成為PCR臨床實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)應(yīng)用一個(gè)難以逾越的障礙。FQ-

12、PCF在全封閉狀態(tài)下實(shí)現(xiàn) PCF擴(kuò)增和產(chǎn)物分析，完全杜絕了擴(kuò)增產(chǎn)物污染而導(dǎo)致的假陽(yáng)性。 至于樣品間的污染，無(wú)論從目的基因的數(shù)量、濃度還是顆粒大小分析，都比較容易控制。我國(guó)PCR臨床應(yīng)用出現(xiàn)問(wèn)題，產(chǎn)物污染所致假陽(yáng)性是主要原因之一。2.2基因的定量檢測(cè)，擴(kuò)展了臨床應(yīng)用空間傳統(tǒng)PCR對(duì)基因的檢測(cè)只能定性，不能定量主要是由擴(kuò)增產(chǎn)物積累的動(dòng)力學(xué)所決定的：PCR產(chǎn)物在擴(kuò)增過(guò)程中呈指數(shù)積累，當(dāng)產(chǎn)物增加到一定程度，產(chǎn)物就停止了指數(shù)積累。不同起始模板，其指數(shù) 增長(zhǎng)期所用的循環(huán)是不同的，因此，不同數(shù)量基因的樣品在同一循環(huán)次數(shù)中積累的產(chǎn)物不能作為樣品基因 定量的依據(jù)；PCR產(chǎn)物積累到一定程度就不能再增加，再進(jìn)入平臺(tái)

13、期。為了擴(kuò)大PCR僉出的靈敏度通常要增加循環(huán)次數(shù)，循環(huán)次數(shù)增加使得樣品目的基因含量高的反應(yīng)管已進(jìn)入平臺(tái)期，終產(chǎn)物量并不代表樣品 目的基因含量；PCR反應(yīng)的管間擴(kuò)增效率差異總是存在的，既然PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長(zhǎng)，由擴(kuò)增效率差異引起的產(chǎn)物擴(kuò)增差異也呈指數(shù)積累，增加循環(huán)次數(shù)勢(shì)必增加終產(chǎn)物的差異，而減少循環(huán)次數(shù)又降低了檢測(cè) 的靈敏度。FQ-PCR采用實(shí)時(shí)檢測(cè)，使所有含有不同數(shù)量的目的基因均在同一條件（達(dá)到熒光閾值）下進(jìn)行 分析，因而更具有可比性。而且，這一條件處于擴(kuò)增產(chǎn)物指數(shù)積累初期，合成產(chǎn)物所需的dNTR酶、離子均處于飽和的最佳狀態(tài)，所以 FQ-PCR循環(huán)參數(shù)與起始模板間有良好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)0.

14、95 ），實(shí)現(xiàn)了極為精確的基因定量檢測(cè)。2.3光譜技術(shù)進(jìn)一步提高了靈敏度FQ-PCR技術(shù)已用于單細(xì)胞基因診斷，靈敏度已達(dá)到極限水平，即檢測(cè)單拷貝基因，而傳統(tǒng)PCR是不易做到的。靈敏度提高得益于光譜技術(shù)。2.4熒光探針雜交，進(jìn)一步提高了特異性PCR擴(kuò)增中常會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和引物二聚體，從而影響了對(duì)特異電泳帶的判斷。FQ-PCR通過(guò)特異性探針雜交信號(hào)檢測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，相當(dāng)于PCR反應(yīng)過(guò)程中自動(dòng)完成了 Southern雜交，進(jìn)一步提 高目的基因檢測(cè)的特異性。2.5擴(kuò)增與自動(dòng)分析一體化，檢測(cè)更加簡(jiǎn)便和快速FQ-PCR通過(guò)計(jì)算機(jī)和分析軟件，使 PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測(cè)和定量分析一體化，比傳統(tǒng)定性PCR

15、更為簡(jiǎn)便和快速，同時(shí)也避免了傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物分析中有害物質(zhì)對(duì)人體的影響，計(jì)算和數(shù)據(jù)處理也有利于科研和臨床資料的保存和分析。3. 臨床應(yīng)用概要科學(xué)研究已經(jīng)證明，人類疾病大都直接或間接與基因有關(guān)，臨床實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)正進(jìn)入基因診斷時(shí)代。但對(duì)于許多疾病的發(fā)生和發(fā)展來(lái)說(shuō)，相關(guān)基因不是有無(wú)問(wèn)題，而是一個(gè)從量變到質(zhì)變的過(guò)程，基因定量檢 測(cè)更具有臨床意義。3.1 感染性疾病PCR在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)中最有價(jià)值的應(yīng)用領(lǐng)域就是對(duì)感染性疾病的診斷。理論上，只要樣本有一個(gè) 病原體存在，PCR就可以檢測(cè)到。一般實(shí)驗(yàn)室也能檢出10102基因拷貝，而目前病原體抗原檢測(cè)方法一般需要105-7個(gè)病原體才可檢測(cè)到。PCR對(duì)病原體的檢測(cè)解決了免疫

16、學(xué)檢測(cè)的“窗口期”問(wèn)題，可判斷疾病 是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。定量PCR研究資料已表明，病原體數(shù)量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有 相關(guān)性。許多研究表明，人類免疫缺陷病毒（HIV）感染后，潛伏期長(zhǎng)短和臨床癥狀輕重與血液中的病毒量顯 著相關(guān)；有也研究表明，HIV病毒載量低于一定值時(shí)，沒(méi)有傳染性。在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中發(fā)現(xiàn)，病毒的數(shù)量與某些藥物的療效相關(guān)。例如， 干擾素治療對(duì)肝炎病毒高拷貝者不敏感，低拷貝者敏感；而有些藥物則具有顯著降低病毒高拷貝的作 用。3.2 腫瘤盡管腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制尚未完全清楚，但相關(guān)的基因的遺傳學(xué)改變的積累，是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被普遍接

17、受。癌基因的表達(dá)增加和突變，在許多腫瘤早期和良性的階段就可出現(xiàn)。PCR技術(shù)不但能有效的檢測(cè)基因的突變，而且能準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因的表達(dá)量，可據(jù)此進(jìn)行腫瘤早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷。幾乎所有慢性骨髓性白血病患者都可檢測(cè)到原癌基因易位導(dǎo)致的BCR/ABL融合基因形成，定量 PCR技術(shù)可通過(guò)檢測(cè)BCR/ABL融合基因的表達(dá)確定微量殘余惡性細(xì)胞存在的數(shù)量，以此作為治療效果和估計(jì)復(fù)發(fā)的危 險(xiǎn)性的依據(jù)。腫瘤標(biāo)記物質(zhì)也是腫瘤診斷的熱門(mén)研究領(lǐng)域。目前臨床對(duì)此多用免疫學(xué)方法檢測(cè)，靈敏度低，一般需要達(dá)到108個(gè)分子數(shù)。用定量逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR方法，一般條件下可檢出10-102某種標(biāo)志物的mRNA可大大提高檢岀率

18、。一些病毒致癌作用也與病毒載量有關(guān)，EB病毒載量的FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果已被用于鼻咽癌早期發(fā)現(xiàn)和隨訪。3.3遺傳病PCR技術(shù)首次臨床應(yīng)用就是從檢測(cè)鐮狀細(xì)胞和B-地中海貧血的基因突變開(kāi)始的?；虻耐蛔兒腿笔Ь鶗?huì)引起各種珠蛋白的表達(dá)不平衡，用FQ-PCF檢測(cè)各種珠蛋白基因表達(dá)差異，是地中海貧血診斷的有效手段?？傊?，除與疾病直接相關(guān)的基因檢測(cè)外，各種與疾病相關(guān)的細(xì)胞因子、激素、受體，用FQ-PCR方法檢測(cè)其基因表達(dá)水平具有更高的靈敏性，更有利于疾病診斷。參考文獻(xiàn)1 Liva K J, Flood SJA, Marmaro J, et al. Oligonucletides with fluoresce

19、nt dyes atopposite ends provide a quenched prode system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Applic, 1995,4:357-362.2 Holland PM, Abramson RD, Waston R, et al. Detection of specific polymerase chain reactionproduct by utilizing the 5' to 3 ' exonucleas

20、e activity of thethemus aquaticus DNA polymerase. Proc Nat Aca Sci USA,1991,88:7276-72803 Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, et al. Stimutaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology, 1992, 10:413-417.一 熒光探針定量PCR定量檢測(cè)的意義定量檢測(cè)與定性檢測(cè)的最大區(qū)別就在于，定性只是檢測(cè)病原體核酸的“有”或“無(wú)”，而定量可以檢測(cè)病原體核酸量

21、的“多”或“少”。定量檢測(cè)的意義：1. 體現(xiàn)病原體含量與復(fù)制水平、感染程度之間的關(guān)系。2. 評(píng)價(jià)和考核治療效果。3. 用于傳染病發(fā)病的監(jiān)控、預(yù)測(cè)與預(yù)防。4. 作為新的愈后指標(biāo)。5. 建立新的病原體分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。6. 新的藥物及療法的研究與開(kāi)發(fā)。二熒光定量PCR報(bào)告結(jié)果的讀?。簾晒舛縋CR是直接擴(kuò)增病原體的特異性DNA或 cDNA其結(jié)果反映了標(biāo)本中 DNA或 RNA存在的多少，結(jié)果通常用數(shù)字表示，報(bào)告為“ copies/ml ”、“ 2U/ml ”或“ copies ” , copy即“拷貝"，表示病原體基因組的個(gè)數(shù)， 該數(shù)據(jù)越大，表明病原體在體內(nèi)復(fù)制得越厲害，傳染性越強(qiáng)。例：HBV

22、-DNA定量結(jié)果報(bào)告：3.637 X 104 IU/ml （如果采用科學(xué)記數(shù)法表示為：3.637E+04 ），代表每ml血液中含有36,370國(guó)際單位乙肝病毒分子。如果待檢標(biāo)本能夠定量，如血液等，結(jié)果報(bào)告為多少copies/ml或2U/ml。如果待檢標(biāo)本不易定量，如分泌物、痰液等，結(jié)果只報(bào)告為多少copies。乙型肝炎病毒（HB"一 乙肝病毒（hepatitis B virus, HBV） 感染HBV感染是全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界乙肝病毒攜帶者有3.5億人之多。我國(guó)人群HBV攜帶率約為10%,有近1.3億人感染HBV是世界上最大的“肝炎大國(guó)”。HBV感染后臨床表現(xiàn)

23、呈多樣性，可表現(xiàn)為重癥肝炎、急性肝炎、慢性肝炎或無(wú)癥狀攜帶者，其中部分慢性 肝炎可演變成肝硬化或肝癌。 HBV攜帶者因無(wú)癥狀，不易被察覺(jué)，其作為傳染源的危害性比患者更甚。HBV病毒顆粒呈球形，具有雙層的衣殼，HBsAg鑲嵌于脂質(zhì)雙層的外衣殼中。HBsAg大量存在于感染者血中，是HBV感染的主要標(biāo)志，可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體即HBsAbHBcAg位于內(nèi)衣殼部分，其外被 HBsAg所覆蓋，不易在血循環(huán)中檢出。其抗原性較強(qiáng)，能刺激 機(jī)體產(chǎn)生HBcAb HBcAblgG在血中持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)， 為非保護(hù)性抗體。HBcAblgM提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)。HBeAg是 Pre C基因（前核基因）的編碼產(chǎn)物，是一

24、種非結(jié)構(gòu)性蛋白，為可溶性蛋白質(zhì)，自肝細(xì)胞分泌入血中。HBeAg的消長(zhǎng)與病毒體的 DNA聚合酶的消長(zhǎng)一致，故可作為 HBV復(fù)制及強(qiáng)感染性的指標(biāo)。 其刺激機(jī)體產(chǎn)生HBeAb對(duì)HBV感染有一定的保護(hù)作用，通常認(rèn)為HbeAb的出現(xiàn)是預(yù)后良好的征象。在這三對(duì)抗原、抗體系統(tǒng)中，核心抗原較難檢測(cè)到，一般不作為臨床常規(guī)檢查，故稱為“兩對(duì)半”。其中HBsAg HBeAg HBcAb三項(xiàng)陽(yáng)性稱為“大三陽(yáng)”，HBsAg、HBeAb HBcAb三項(xiàng)陽(yáng)性稱為“小三陽(yáng)”。二“兩對(duì)半”檢測(cè)與 HBV-DNA定量“兩對(duì)半”是從免疫學(xué)水平來(lái)檢測(cè) HBV感染機(jī)體后引起免疫應(yīng)答，產(chǎn)生相應(yīng)抗原抗體的含量（這 個(gè)“含量”還不是定量，而

25、只是抗原抗體的“有”或“無(wú)”），它實(shí)際上測(cè)定的是機(jī)體感染HBV后免疫應(yīng)答結(jié)果的反映。由于個(gè)體反應(yīng)的差異，不同的人在感染HBV后會(huì)出現(xiàn)不同的免疫應(yīng)答，從而得到不同的“兩 對(duì)半”結(jié)果模式。如產(chǎn)生抗體、表現(xiàn)為“攜帶者”、“大三陽(yáng)”、“小三陽(yáng)”等等。但是所有這些免疫學(xué) 指標(biāo)不能反映患者或病人體內(nèi)病毒的復(fù)復(fù)水平及傳染程度，不能提示其與乙型肝炎的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程之間 的聯(lián)系。熒光探針定量PCR技術(shù)則是從分子生物學(xué)水平直接檢測(cè)HBV病毒自身的遺傳物質(zhì) DNA是病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)。HBsAg雖然是HBV的感染標(biāo)志，但在感染的早期，或由于 S基因（編碼HBsA®的低水平表達(dá)或 變異，常

26、規(guī)方法難以檢出，會(huì)導(dǎo)致漏檢。HBV-DNA測(cè)比免疫學(xué)檢測(cè)更早期、更靈敏。免疫學(xué)方法檢測(cè)為HBsAg（-）的病人中，約有3濃上檢測(cè)出HBV-DNA（+）,健康供血者用PCR方法檢測(cè)HBV-DNA也有一定比例 的陽(yáng)性。HBsAg陰性的慢性肝炎中，仍有部分是HBV感染引起的。所以單憑 HBsAg陽(yáng)性與否來(lái)判斷肝臟中HBV的復(fù)制及有無(wú)傳染性是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，易造成部分慢性型病毒性肝炎的漏診。對(duì)于HBsAg陰性或有HBV感染后的任何血清學(xué)依據(jù)都應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行HBV-DNA熒光定量檢測(cè)。也有時(shí)出現(xiàn)HBeAg）而HBV-DNA（+的結(jié)果，這是因?yàn)榫幋a e抗原的Pre C區(qū)基因極易出現(xiàn)變異，在 Pre C區(qū)出現(xiàn)終止

27、密碼子，使 Pre C區(qū)基因 與C區(qū)基因不能轉(zhuǎn)譯出完整的 e抗原，導(dǎo)致HBeAg表達(dá)缺失，機(jī)體感染 HBV不表達(dá)HBeAg當(dāng)然血清學(xué)方 法也不能檢測(cè)出HBeAg的存在。HBsAg（+）患者中大約有1-10%檢測(cè)不出HBV-DNA這種情況在世界各國(guó)都有報(bào)道。一方面，由于HBV-DN整合于宿主細(xì)胞基因組，或基因變異，與常用的PCF引物、探針不匹配，PCR擴(kuò)增不出相應(yīng)的基因序列，因而未能檢出。此外，由于HBV的復(fù)制有反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，S基因（編碼表面抗原）可以以 2.1Kb RNA為mRNA專譯成HBsAg故在部分HBV感染中雖無(wú)病毒復(fù)制，但可長(zhǎng)期產(chǎn)生HbsAg。510% HBV感染者表現(xiàn)為單項(xiàng)HBcAb

28、陽(yáng)性。有許多報(bào)道證明，單項(xiàng) HBcAb陽(yáng)性的血液可以引起 HBV的輸血后感染。如果同時(shí)檢查 HBV-DN A可以減少漏檢，預(yù)防輸血后肝炎的發(fā)生。應(yīng)用PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)“大三陽(yáng)”病人血中能夠檢出 HBV-DAK檢出率約為96%左右），有 相當(dāng)一部分人e抗原轉(zhuǎn)化e抗體后，即"大三陽(yáng)”轉(zhuǎn)化為"小三陽(yáng)”后，其血清中仍有DNA存在（檢出率約為30%），說(shuō)明病毒仍未消失和停止復(fù)制。 “小三陽(yáng)”病人血清中 HBV-DNA專陰率約為60-70%，這與病毒遺 傳物質(zhì)突變或與宿主基因組整合、用藥后復(fù)制暫停、以及血清HBV病毒炎癥清除使血清中的 HBV-DNA消失或下降至極低濃度（低于檢測(cè)下

29、限）有關(guān)，這種情況下并不表示病人恢復(fù)，應(yīng)隨訪并復(fù)查血清HBV-DNA以免誤癥。要特別指岀的是，近年來(lái)由于抑制病毒復(fù)制的核苷類藥物藥物（如拉咪呋啶）在臨床的大量使用，使得HBV-DNA復(fù)制水平可能會(huì)在短時(shí)期內(nèi)迅速降低至不可檢測(cè)水平（這時(shí)候免疫學(xué)檢測(cè)指標(biāo)可不發(fā)生 改變），但是隨著患者出現(xiàn)藥物耐受或產(chǎn)生基因突變，HBV-DNA復(fù)制水平又可能呈現(xiàn)一種上升趨勢(shì)，從而使HBV-DNA定量檢測(cè)出現(xiàn)相對(duì)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果。三 熒光探針PCR定量檢測(cè)HBV-DNA勺意義（一）HBV-DNA定量檢測(cè)，臨床上以v 103 copies/ml為檢測(cè)臨界值，可作為乙肝病毒無(wú)復(fù)制狀態(tài)或低水平復(fù)制的指標(biāo)。慢性乙肝患者血清中HBV-DNA> 105 copies/ml的患者，如果體內(nèi)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平異常，應(yīng)考慮接受抗病治療。（二）HBV-DNA定量檢測(cè)是直接對(duì) HBV的遺傳物質(zhì)DNA進(jìn)行基因擴(kuò)增，是病毒復(fù)制和存在的最早期、最靈敏也是最可靠的指標(biāo)，可對(duì)HBV感染作出早期診斷。乙肝病人傳染性與其血清中HBV-DNA含量高低呈正相關(guān)，病人血清中HBV-DNA復(fù)制水平越高，其