基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（二）：底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響——Km值的測(cè)定

1、底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響Km值的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?鞏固底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響。2學(xué)習(xí)測(cè)定米氏常數(shù)的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響n米氏方程Vmax VK SmS02468101214161820020406080100C oncentration of S ubstrate(um ol/L)Rate of Reaction(v)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖測(cè)定Kmn米氏常數(shù)是酶的特征性物理常數(shù)。一個(gè)酶在一定條件下，對(duì)某一底物有一定的Km值。111max maxKmVVSV本實(shí)驗(yàn)測(cè)定胰蛋白酶水解酪蛋白

2、的Km值n胰蛋白酶催化的反應(yīng)：催化蛋白質(zhì)中堿性氨基酸(L精氨酸和L賴氨酸)的羧基所形成的肽鍵的水解反應(yīng)。n反應(yīng)物的檢測(cè)：蛋白質(zhì)被水解時(shí)生成自由氨基，這些氨基可以用甲醛滴定法測(cè)定，以此來(lái)確定胰蛋白酶催化反應(yīng)的速度。甲醛滴定法的原理n甲醛滴定法的原理n 氨基酸或者肽中的氨基呈堿性，理論上可以用氫氧化鈉中和滴定的方法測(cè)定氨基上含有的質(zhì)子的數(shù)目，進(jìn)而推斷氨基的數(shù)目n 氫氧化鈉中和滴定的方法常用的指示劑是酚酞，它的變色域?yàn)閜H9.0；n 氨基呈弱堿性，一般在pH值小于11的環(huán)境中不能全部將質(zhì)子解離出來(lái)。n 已知甲醛在常溫條件下能迅速與氨基酸或者肽的氨基結(jié)合，促使氨基釋放H+，滴定終點(diǎn)移至酚酞的變色域內(nèi)(

3、pH9.0左右)。四、試劑四、試劑140g/L酪蛋白溶液(pH8.5)：稱(chēng)40g酪蛋白溶解在900mL蒸餾水中，再加20mL lmol/LNaOH。連續(xù)振蕩，微熱至溶解，最后用lmol/L HCl或lmolL NaOH調(diào)至pH8.5，最后加H20至1000mL。2胰蛋白酶溶液(40gL)：市售胰蛋白酶用H20配制。3甲醛溶液。4酚酞(2.5gL)：用乙醇配制。5標(biāo)準(zhǔn)NaOH(0.1molL)溶液。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.不同濃度底物的配制：用不同濃度底物的配制：用40g/L酪蛋白溶液酪蛋白溶液(pH8.5)稀釋?zhuān)渲茲舛葹橄♂專(zhuān)渲茲舛葹?.5、10、15、20、30gL的的5種不同濃度的酪蛋白溶液各

4、種不同濃度的酪蛋白溶液各50mL，放，放置在置在100mL錐型瓶中。錐型瓶中。2底物與酶液的保溫處理：底物與酶液的保溫處理：胰蛋白酶溶液，胰蛋白酶溶液，7.5gL 100mL的的酪蛋白溶液酪蛋白溶液放置在放置在37水浴中保水浴中保溫溫10min。3中和滴定的準(zhǔn)備：分別向中和滴定的準(zhǔn)備：分別向5個(gè)小三角瓶中加入個(gè)小三角瓶中加入5mL甲醛溶液甲醛溶液和和1滴酚酞滴酚酞并滴加并滴加0.1molL標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)NaOH至混合物呈微粉紅色。所有的瓶中顏色應(yīng)至混合物呈微粉紅色。所有的瓶中顏色應(yīng)當(dāng)一致。當(dāng)一致。4酶促反應(yīng)和取樣：酶促反應(yīng)和取樣：u取取10mL酶液酶液酪蛋白溶液中，充分混合；酪蛋白溶液中，充分混合；

5、u取樣：反應(yīng)取樣：反應(yīng)0、2、4、6和和8min時(shí)分別取出時(shí)分別取出10mL消化消化液液(反應(yīng)混合物反應(yīng)混合物)加到含甲醛的錐型瓶中加到含甲醛的錐型瓶中5中和滴定：每個(gè)三角瓶中各加入酚酞中和滴定：每個(gè)三角瓶中各加入酚酞20滴，用滴，用0.1 molLNaOH滴定至粉紅色，保持顏色在滴定至粉紅色，保持顏色在30秒內(nèi)不退色，記下所用秒內(nèi)不退色，記下所用NaOH的毫升數(shù)。的毫升數(shù)。每個(gè)小每個(gè)小錐型瓶中樣品的滴定終點(diǎn)顏色應(yīng)當(dāng)一致。錐型瓶中樣品的滴定終點(diǎn)顏色應(yīng)當(dāng)一致。6其它濃度的酪蛋白溶液反應(yīng)速度的測(cè)定重復(fù)其它濃度的酪蛋白溶液反應(yīng)速度的測(cè)定重復(fù)25步驟。步驟。五、數(shù)據(jù)處理五、數(shù)據(jù)處理1初速度的計(jì)算u用增加的滴定度(標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定體積 0.1摩爾濃度14.008)對(duì)時(shí)間作圖，測(cè)定不同底物濃度的初速度。u初速度，線性方程的斜率u初速度的單位：V氮(mg)/min2K