酶的分離純化

1、Chapter 4 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme酶的分離純化酶的分離純化Contents of chapter 4第一節(jié)、發(fā)酵醪液預(yù)處理第二節(jié)、酶的初步純化第四節(jié)、酶的濃縮與干燥酶的濃縮與干燥第五節(jié)、酶純化方案的設(shè)計(jì)與評價純化方案的設(shè)計(jì)與評價第三節(jié)、酶的高度純化第一節(jié)、發(fā)酵醪液預(yù)處理第一節(jié)、發(fā)酵醪液預(yù)處理一一、 酶在細(xì)胞中分布及發(fā)酵醪液預(yù)處理酶在細(xì)胞中分布及發(fā)酵醪液預(yù)處理二、細(xì)胞破碎二、細(xì)胞破碎三、發(fā)酵液的固液分離發(fā)酵液的固液分離第一節(jié)、發(fā)酵醪液預(yù)處理 一、酶在細(xì)胞中的分布及發(fā)酵醪預(yù)處理1、酶在細(xì)胞中分布、酶在細(xì)胞中

2、分布l胞外酶：水解酶類，易收集，不必破碎細(xì)胞，緩沖液或水浸泡細(xì)胞或發(fā)酵液離心得到上清液即為含酶液。l胞內(nèi)酶：除水解酶類外的其它酶類，需破碎細(xì)胞，不同的酶分布部位不同，最好先將酶存在的細(xì)胞器分離后再破碎該細(xì)胞器，然后將酶用適當(dāng)?shù)木彌_溶液或水抽提。細(xì)胞結(jié)構(gòu)與酶分布2、酶分離原則：l在增加酶得率和純度的同時，盡可能避免高溫、過酸、過堿、劇烈的震蕩及其它可能使酶喪失活力的一切操作過程。盡最大可能保存酶的活力。3 3、 酶的提取、分離純化技術(shù)路線酶的提取、分離純化技術(shù)路線預(yù)處理預(yù)處理酶初步分離純化酶初步分離純化酶濃縮、干燥酶濃縮、干燥酶產(chǎn)品酶產(chǎn)品發(fā)酵醪液發(fā)酵醪液沉淀分離、提取、離沉淀分離、提取、離心心酶

3、高度分離純化酶高度分離純化細(xì)胞破碎、離心、過濾細(xì)胞破碎、離心、過濾膜過濾、層析分離，電泳分膜過濾、層析分離，電泳分離離l預(yù)處理預(yù)處理（pretreatment）：包括固液分離和細(xì)胞：包括固液分離和細(xì)胞破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。l初步純化初步純化（rough fractionation） （提?。撼ㄌ崛。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。去與目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。l高度純化高度純化（fine fractionation） （精制）：除（精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。l濃縮與干燥濃縮與干燥（concentration and desic

4、cation）（成品加工）（成品加工）: :使酶與溶劑分離的過程。使酶與溶劑分離的過程。二、二、 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細(xì)胞進(jìn)行破首先需要對細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。碎處理。1）機(jī)械破碎）機(jī)械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化學(xué)破碎）化學(xué)破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超聲波超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞破碎珠細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機(jī)高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I型型 電動玻璃勻漿機(jī)電動玻璃勻漿機(jī)機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法 物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法 化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活

5、性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過通過機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生的剪切機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生的剪切力力，使組織、細(xì)胞破碎。，使組織、細(xì)胞破碎。通過通過各種物理因素的作用，各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。壞，而使細(xì)胞破碎。通過通過各種化學(xué)試劑各種化學(xué)試劑對細(xì)胞對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過通過細(xì)胞本身的酶系或外細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，加酶制劑的催化作用，使使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理細(xì)胞破碎方法及其原理本章目錄三、發(fā)酵液的固液分離三、發(fā)酵

6、液的固液分離1 . 過濾：過濾：借助過濾介質(zhì)使不同大小、不同形狀組分分離。借助過濾介質(zhì)使不同大小、不同形狀組分分離。 過濾介質(zhì)：濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等過濾介質(zhì)：濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等 根據(jù)推動力產(chǎn)生條件不同過濾分為：根據(jù)推動力產(chǎn)生條件不同過濾分為： （1）常壓過濾常壓過濾：以液位差為推動力。如濾紙、吊籃或吊袋過濾：以液位差為推動力。如濾紙、吊籃或吊袋過濾 （2）加壓過濾加壓過濾：以壓力泵或壓縮空氣產(chǎn)生的壓力為動力：以壓力泵或壓縮空氣產(chǎn)生的壓力為動力如板框壓如板框壓濾濾 （3）減壓過濾減壓過濾：在通過過濾介質(zhì)下方抽真空，使產(chǎn)生壓力差。：在通過過濾介質(zhì)下方抽真空，使產(chǎn)生壓力差。

7、 如轉(zhuǎn)鼓式真空吸濾機(jī)。如轉(zhuǎn)鼓式真空吸濾機(jī)。在發(fā)酵醪液預(yù)處理中采用的是粗濾，即過濾懸浮液中直徑大于在發(fā)酵醪液預(yù)處理中采用的是粗濾，即過濾懸浮液中直徑大于2m的顆粒的顆粒2 2、離心分離、離心分離 離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過程。 在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的的顆粒大小、密度和特性的不同顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)?，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件離心機(jī)、離心方法和離心條件。（一）離心機(jī)的選擇（一）離

8、心機(jī)的選擇離心機(jī)的種類離心機(jī)的種類1 1、常速離心機(jī)常速離心機(jī) 最大轉(zhuǎn)速最大轉(zhuǎn)速8000rpm8000rpm(r/min), (r/min), 用于用于細(xì)細(xì)胞、細(xì)胞碎片胞、細(xì)胞碎片和和培養(yǎng)基殘?jiān)囵B(yǎng)基殘?jiān)确蛛x；等分離；2 2、高速（冷凍）離心機(jī)、高速（冷凍）離心機(jī) 1 110104 4-2.5-2.510104 4rpmrpm, ,用于用于沉淀沉淀、細(xì)胞器細(xì)胞器等分離；等分離；3 3、超速離心機(jī)、超速離心機(jī) 轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速2.5-82.5-810104 4rpmrpm，用于，用于DNADNA、RNARNA蛋白質(zhì)及細(xì)胞器病毒分離純化蛋白質(zhì)及細(xì)胞器病毒分離純化；檢測純度檢測純度；沉降系沉降系數(shù)和相對分

9、子量測定數(shù)和相對分子量測定等。等。l分制備用、分析用、制備及分析用三種。分析用超分制備用、分析用、制備及分析用三種。分析用超速離心機(jī)裝有光學(xué)檢測系統(tǒng)、自動記錄系統(tǒng)、數(shù)據(jù)速離心機(jī)裝有光學(xué)檢測系統(tǒng)、自動記錄系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；處理系統(tǒng)；l溫度類型：溫度類型：常溫及冷凍常溫及冷凍l超速離心機(jī)均為冷凍型。超速離心機(jī)均為冷凍型。l使用冷凍離心機(jī)時提前使用冷凍離心機(jī)時提前降溫，預(yù)冷離心頭。降溫，預(yù)冷離心頭。l使用超速離心機(jī)時先抽使用超速離心機(jī)時先抽真空。真空。l外擺式一般為低速，外擺式一般為低速， l角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。 l角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋要旋緊。角

10、式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋要旋緊。材質(zhì)：玻璃，塑料材質(zhì)：玻璃，塑料強(qiáng)度：和離心速度強(qiáng)度：和離心速度相配相配大?。汉娃D(zhuǎn)子配套大?。汉娃D(zhuǎn)子配套高速超速管要加蓋高速超速管要加蓋l平衡、定溫、定速、定時。平衡、定溫、定速、定時。（二）離心方法的選擇（二）離心方法的選擇l所分離的顆粒大小和密度相差較大所分離的顆粒大小和密度相差較大:常速常速、高速離心高速離心;l若從樣品液中分離若從樣品液中分離2種以上大小和密度不同的顆粒：種以上大小和密度不同的顆粒： 差速離心差速離心;l超速離心超速離心:差速離心法差速離心法和和密度梯度離心法密度梯度離心法，后者又分速，后者又分速率率區(qū)帶離心區(qū)帶離心

11、和和等密度等密度離心。離心。離心分離示意圖離心分離示意圖（a）離心前的懸浮液）離心前的懸浮液 （b）（）（e）離心不同時間后顆粒的沉降情況）離心不同時間后顆粒的沉降情況 差速離心示意圖差速離心示意圖已破碎的細(xì)胞已破碎的細(xì)胞 沉淀（細(xì)胞核）沉淀（細(xì)胞核） 上清液上清液 沉淀（細(xì)胞膜碎片、沉淀（細(xì)胞膜碎片、線粒體、溶酶體）線粒體、溶酶體） 上清液上清液 沉淀（核糖核蛋白體）沉淀（核糖核蛋白體） 上清液（可上清液（可溶性組分）溶性組分）500g,1010 000g,101差速離心差速離心 （differential centrifugation） 采用不同的采用不同的離心速度離心速度和和離心時間離心

12、時間，使沉降速度不同的顆粒，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。分批分離的方法。l適用：適用：分離大小和密度差異較大的顆粒。分離大小和密度差異較大的顆粒。 l優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：操作簡單操作簡單 。l缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：1）分離效果較差，）分離效果較差， 不能一次得到純顆粒。不能一次得到純顆粒。 2）壁效應(yīng)嚴(yán)重。）壁效應(yīng)嚴(yán)重。 3）沉降的顆粒受到擠壓）沉降的顆粒受到擠壓2密度梯度離心密度梯度離心 (區(qū)帶離心區(qū)帶離心) （density gradient centrifugation）l樣品在樣品在密度梯度介質(zhì)密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。

13、接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。l常用的密度梯度溶液是常用的密度梯度溶液是蔗糖、甘油蔗糖、甘油溶液。（溶液。（5%5%60%60%）l密度梯度介質(zhì)一般采用密度梯度混合器進(jìn)行制備密度梯度介質(zhì)一般采用密度梯度混合器進(jìn)行制備l特點(diǎn)：特點(diǎn)： 區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度。區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度。 適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)。密度升高密度升高3種梯度示意圖BABAABa.線性梯度線性梯度b.凸型梯度凸型梯度c.凹型梯度凹型梯度Density gradient ultracentrifugation3. 等密度梯度離心等

14、密度梯度離心l又稱又稱沉降平衡離心沉降平衡離心 （sedimentation equilibrium centrifugation）l根據(jù)根據(jù)顆粒的密度不同顆粒的密度不同而進(jìn)行分離。而進(jìn)行分離。l離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆?；蛳蛳鲁两?，或向上漂浮，達(dá)到與其相同的密度時不顆?；蛳蛳鲁两担蛳蛏掀?，達(dá)到與其相同的密度時不再移動，形成區(qū)帶。再移動，形成區(qū)帶。 l常用常用氯化銫氯化銫（CsCl）作為梯度介質(zhì)。）作為梯度介質(zhì)。l特點(diǎn)：特點(diǎn)： 介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度

15、。 適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。本節(jié)目錄梯度回收梯度回收1、穿刺法、穿刺法l采用針穿刺離心管底部，使梯度靠重力自由滴采用針穿刺離心管底部，使梯度靠重力自由滴出，然后依次作分布收集，此法適用于薄壁塑出，然后依次作分布收集，此法適用于薄壁塑料管，流出液部分收集于小試管中，經(jīng)分析決料管，流出液部分收集于小試管中，經(jīng)分析決定取舍或合并。定取舍或合并。l此法對梯度擾動小，但離心管不能再用，不適此法對梯度擾動小，但離心管不能再用，不適合回收管底有沉淀的梯度，也不使用于不銹鋼合回收管底有沉淀的梯度，也不使用于不銹鋼或厚壁塑料管?；蚝癖谒芰瞎?。2、取代法、取

16、代法濃濃取取代代液液收集收集 稀稀 濃濃通入空氣、輕液體通入空氣、輕液體收集收集 濃濃 稀稀l優(yōu)點(diǎn)：是不破壞離心管優(yōu)點(diǎn)：是不破壞離心管，能用于較粘梯度，可借，能用于較粘梯度，可借光學(xué)（放射性）系統(tǒng)進(jìn)行光學(xué)（放射性）系統(tǒng)進(jìn)行流出液跟蹤，簡化分析化流出液跟蹤，簡化分析化驗(yàn)工作。驗(yàn)工作。l缺點(diǎn)：開始取代操作時缺點(diǎn)：開始取代操作時易引起擾亂，操作需特別易引起擾亂，操作需特別小心，梯度粘度太大時也小心，梯度粘度太大時也不合適。不合適。 向上取代向上取代向下取代向下取代3 3、虹吸法、虹吸法 用一根聚乙烯小管插到管底部，用虹吸法吸出梯用一根聚乙烯小管插到管底部，用虹吸法吸出梯 度，度，它也不損傷離心管，尤

17、其適用于不銹鋼管中物質(zhì)的分級它也不損傷離心管，尤其適用于不銹鋼管中物質(zhì)的分級分離，但虹吸時易引起分離區(qū)帶擾亂，最好使用專門的分離，但虹吸時易引起分離區(qū)帶擾亂，最好使用專門的裝置。裝置。l除取代法和虹吸法外，有時從管上部直接仔細(xì)地用除取代法和虹吸法外，有時從管上部直接仔細(xì)地用注射注射器或吸管定量移出梯度液器或吸管定量移出梯度液，效果也較好。，效果也較好。4 4、切割法、切割法 適用于極粘梯度，就是用離心管切割器將凍結(jié)的塑料適用于極粘梯度，就是用離心管切割器將凍結(jié)的塑料管子切成薄片，從而將梯度分部收集，此法僅適用于賽管子切成薄片，從而將梯度分部收集，此法僅適用于賽璐璐或硝酸纖維素管。璐璐或硝酸纖維

18、素管。（三）離心條件選擇（三）離心條件選擇1. 離心力離心力 Fc = m ac m r2 m r ( 2 N/60 ) 2 N為離心機(jī)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)為離心機(jī)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) （r/min ）；）； Fc通常以相對離心力通常以相對離心力RCF（relative centrifugal force）表示，即離心力表示，即離心力F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多）的多少倍。一般用少倍。一般用g（或數(shù)字（或數(shù)字 g）表示。）表示。 RCF = m r (2 N/60)2 /mg= 1.12 10-5 N2 r 此公式描述了相對離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系，此公式描述了相對離心力與

19、轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系， 旋轉(zhuǎn)半徑旋轉(zhuǎn)半徑用用r平均代替平均代替 r平均平均=1/2（r大大+r?。┬。ヽm通常：通常：l低速離心以低速離心以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：表示，如：4000r/min。l高速離心（超速），常以高速離心（超速），常以相對離心力相對離心力（RCF）表示，如：表示，如：65000g。l 兩者可換算或查測算圖。兩者可換算或查測算圖。2、離心時間、離心時間 不同離心方法，離心時間的概念不同。不同離心方法，離心時間的概念不同。l對常速離心、高速離心、差速離心對常速離心、高速離心、差速離心,指顆粒完全指顆粒完全沉降到離心管底的時間沉降到離心管底的時間,沉降時間或澄清時間沉降時間

20、或澄清時間;l等密度梯度離心等密度梯度離心,指顆粒完全到達(dá)等密度點(diǎn)時平指顆粒完全到達(dá)等密度點(diǎn)時平衡時間，衡時間，平衡時間平衡時間;l對密度梯度離心對密度梯度離心,指形成界限分明區(qū)帶的時間，指形成界限分明區(qū)帶的時間，區(qū)帶形成時間區(qū)帶形成時間;沉降時間沉降時間l指顆粒從樣品液面完全沉降到離心管底所需的時間指顆粒從樣品液面完全沉降到離心管底所需的時間;l決定于沉降速度和沉降距離。決定于沉降速度和沉降距離。沉降系數(shù)已知顆粒沉降系數(shù)已知顆粒S：沉降系數(shù)；：沉降系數(shù)；:角速度；角速度；r1，r2:轉(zhuǎn)軸中心到液面與管底距離。轉(zhuǎn)軸中心到液面與管底距離。效率因子效率因子KK與轉(zhuǎn)子半徑和轉(zhuǎn)速有關(guān)；與轉(zhuǎn)子半徑和轉(zhuǎn)速

21、有關(guān)；實(shí)際操作中：實(shí)際操作中：1、某一顆粒、某一顆粒S定值，故定值，故K小，小，t也小，效率高（轉(zhuǎn)子的選擇）；也小，效率高（轉(zhuǎn)子的選擇）；2、轉(zhuǎn)子與離心機(jī)確定，具體顆粒的、轉(zhuǎn)子與離心機(jī)確定，具體顆粒的2t是常數(shù)，故可調(diào)整是常數(shù)，故可調(diào)整與與 t 得相同效果。得相同效果。3、溫度和、溫度和pH值值l一般為一般為4。l穩(wěn)定性好的酶，可取室溫；穩(wěn)定性好的酶，可取室溫；l超高速離心需冷凍。超高速離心需冷凍。lpH值應(yīng)處于酶穩(wěn)定的值應(yīng)處于酶穩(wěn)定的pH范圍。范圍。第二節(jié)、酶的初步分離純化第二節(jié)、酶的初步分離純化一、酶的提取二、酶的沉淀分離三、膜過濾酶的提?。好傅奶崛。菏侵冈谝欢ǖ臈l件下，用適當(dāng)是指在一定的

22、條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解的溶劑或溶液處理含酶原料，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。一、一、 酶的提取酶的提取 (extraction)(extraction) l提取目標(biāo)：提取目標(biāo)： a.a.將目的酶最大限度地溶解出來。將目的酶最大限度地溶解出來。 b.b.保持生物活性。保持生物活性。注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，一般采用低溫下（一般采用低溫下（0-100-10）操作。）操作。l提取原則提取原則 a.a.相似相溶。相似相溶。 b.b.遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的遠(yuǎn)離等電

23、點(diǎn)的pHpH值，溶解度增加值，溶解度增加酶的主要提取方法酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.020.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取pH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取pH812的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶本章目錄酶的提取主要影響因素是酶的提取主要影響因素是酶在所使用溶劑中的溶解度酶在所使用溶劑中的溶解度，以及，以及酶酶向溶劑相中的擴(kuò)散速度向溶劑相中的擴(kuò)散速度。此外還受到此外還受到溫度溫度、

24、pH值值和和提取液體提取液體積積等提取條件的影響。等提取條件的影響。大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象鹽溶現(xiàn)象。 二、沉淀分離二、沉淀分離沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法：在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法： 中性鹽沉淀（鹽析法）中性鹽沉淀（鹽析法） 有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀 選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性）選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性） 等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀 有機(jī)聚合物沉淀有機(jī)聚合物沉淀1、鹽析沉淀法（改

25、變離子強(qiáng)度）、鹽析沉淀法（改變離子強(qiáng)度）（1）. 基本原理（鹽溶和鹽析）基本原理（鹽溶和鹽析） 向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：兩種現(xiàn)象： 1) 鹽溶鹽溶（salting in） ： 低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。 2) 鹽析鹽析（salting out） ： 高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。l在某一濃度的鹽溶液中，不同的蛋白質(zhì)溶解度不同，由此在某一濃度的鹽溶液中，不同的蛋白質(zhì)溶解度不同，由此可達(dá)到分離的目的?？蛇_(dá)到分離的目的。蛋白質(zhì)的鹽析原因：原因： 高鹽濃度下

26、鹽離子與高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀降低溶解度而沉淀。不同蛋白質(zhì)分子量、表面電不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉荷不同，在不同鹽濃度下沉淀，逐漸增大鹽濃度，不同淀，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽分段鹽析析。（2） 鹽析用鹽鹽析用鹽1）中性鹽的選擇）中性鹽的選擇 常用常用(NH4)2SO4，其突出優(yōu)點(diǎn)：，其突出優(yōu)點(diǎn)： a. 溶解度大溶解度大 b. 分離效果好分離效果好 c. 不易引起變性不易引起變性 d. 價格便宜價格便宜2） 鹽濃度的表示鹽濃度的表示 用飽

27、和（溶解）度表示用飽和（溶解）度表示: 溶液中飽和硫酸銨的體積溶液中飽和硫酸銨的體積 飽和度飽和度 溶液的總體積溶液的總體積3) 調(diào)整鹽濃度的方式調(diào)整鹽濃度的方式 a. 飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）l適于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達(dá)到的鹽濃度又不適于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達(dá)到的鹽濃度又不太高時。太高時。l配制飽和硫酸銨溶液配制飽和硫酸銨溶液l所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計(jì)算：所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計(jì)算： V=V0 式中式中 V,V0為所需加入的飽和硫酸銨體積及原溶液體積 S2,S1為所需達(dá)到的硫酸銨飽和度和原來溶液的硫酸銨飽和度S2 - S

28、11 - S2b. 添加固體硫酸銨添加固體硫酸銨l適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要達(dá)到的鹽濃度又很高時。達(dá)到的鹽濃度又很高時。l按下式計(jì)算，得表中數(shù)據(jù)按下式計(jì)算，得表中數(shù)據(jù) W= A,B常數(shù)，與溫度有關(guān)。常數(shù)，與溫度有關(guān)。 實(shí)際使用時，可直接查表實(shí)際使用時，可直接查表 （各種飽和度下需加固體硫酸（各種飽和度下需加固體硫酸銨的量）銨的量）。B(S2-S1)1-AS2l低飽和度：低飽和度：飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過般終飽和度不超過40。l高飽和度高飽和度：固體鹽添加法。不會大量增加溶液體積

29、。固體鹽添加法。不會大量增加溶液體積。l操作步驟：操作步驟： 1）固體硫酸銨充分研細(xì)，溫和攪拌中緩慢加入。）固體硫酸銨充分研細(xì)，溫和攪拌中緩慢加入。 2）冰箱中（）冰箱中（4）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。 3）沉淀再溶解后可用超濾（）沉淀再溶解后可用超濾（ultrafiltration） 、透析、透析（dialysis）或?qū)游觯ǎ┗驅(qū)游觯╟hromatography）方法脫鹽。）方法脫鹽。硫酸銨濃度（硫酸銨濃度（%） 枯草桿菌枯草桿菌 -淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線 （4）鹽析的影響因素）鹽析的影響因素1) 離子強(qiáng)度和種類（介紹鹽析常數(shù)）離

30、子強(qiáng)度和種類（介紹鹽析常數(shù)） 蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關(guān)系：蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關(guān)系： I：離子強(qiáng)度，I = MZ2； M：離子濃度（mol/L）； Z：離子價數(shù) S：離子強(qiáng)度為I時的蛋白質(zhì)的溶解度（g/L） S0：離子強(qiáng)度為0時蛋白質(zhì)的溶解度（g/L） Ks：鹽析常數(shù)， Ks代表鹽析效率 ，其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度，Ks越大鹽析效果越好。 IKSSs0loglogl當(dāng)溫度和當(dāng)溫度和pH一定時，一定時，S0對于某一溶質(zhì)是常數(shù)，用對于某一溶質(zhì)是常數(shù)，用表示，鹽析方程式可改寫為：表示，鹽析方程式可改寫為： log S = - Ks I l兩種鹽析法：兩種鹽析法：Ks

31、分級鹽析法分級鹽析法 ：在一定的在一定的pH和溫度條件下，利和溫度條件下，利用不同蛋白質(zhì)用不同蛋白質(zhì)Ks的不同，通過改變離子強(qiáng)度或鹽的不同，通過改變離子強(qiáng)度或鹽濃度（即改變濃度（即改變I值）的沉淀方法。值）的沉淀方法。分級鹽析法分級鹽析法 ：在一定離子強(qiáng)度下，通過改變?nèi)茉谝欢x子強(qiáng)度下，通過改變?nèi)芤旱囊旱膒H及溫度的沉淀方法。及溫度的沉淀方法。2) 蛋白質(zhì)濃度： 過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，2.5%- 3%最好。 3) pH值：等電點(diǎn)處最易沉淀。4) 溫度的影響：l稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。l濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度下降。l 一般可在室溫下進(jìn)行。某些對溫度敏感的酶，可在

32、04下操作。 2、有機(jī)溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）有機(jī)溶劑沉淀（降低介電常數(shù)） 利用酶等蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使之分利用酶等蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。離的方法。 （1） 沉淀機(jī)理沉淀機(jī)理 降低溶液的介電常數(shù)降低溶液的介電常數(shù) 破壞蛋白質(zhì)表面水膜破壞蛋白質(zhì)表面水膜 （2） 常用有機(jī)溶劑常用有機(jī)溶劑 丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇，用量一般為酶液體積的甲醇，用量一般為酶液體積的2 2倍左倍左 右，終濃度為右，終濃度為70%70%。 l 有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機(jī)溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20時水的介電常數(shù)為80，而82乙醇水溶液的介電常數(shù)為40

33、。l 溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時，對于具有水膜的分子來說，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。 本節(jié)目錄（3）優(yōu)缺點(diǎn)：l優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1）分辨率比鹽析法高分辨率比鹽析法高 2） 沉淀不需脫鹽沉淀不需脫鹽 3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心l缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活）容易引起蛋白質(zhì)變性失活 2)2)有機(jī)溶劑易燃、易爆，對安全要求有機(jī)溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。較高。（4） 影響有機(jī)溶劑沉淀的因素影響有機(jī)溶劑沉淀的因素 1）溫度）溫度 ：低溫（低溫（0）操作。）操作。 2）pH 值

34、：值：盡可能靠近其等電點(diǎn)。盡可能靠近其等電點(diǎn)。 3）離子強(qiáng)度：）離子強(qiáng)度：采用采用 2m酵母、霉菌、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾微濾0.22m細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾超濾200.2m病毒、生物大分子等超濾膜反滲透反滲透20 (40,000) 壓力差，100kPa 篩分 超濾UF 120 (10,000-40,000) 壓力差，100kPa 篩分 納濾NF 1 (1001000) 壓力差，100) 壓力差，1000kPa 優(yōu)先吸附、溶解擴(kuò)散 四種常用膜分離技術(shù)的基本特征四種常用膜分離技術(shù)的基本特征 四種常用膜分離過程的截留特性四種常用膜分離過程的截

35、留特性本節(jié)目錄Reverse Osmosis (RO)Ultrafiltration (UF)Nanofiltration (NF)Microfiltration (MF)2、電場膜分離、電場膜分離在半透膜的兩側(cè)分別裝上正負(fù)極，電場作用下小分子在半透膜的兩側(cè)分別裝上正負(fù)極，電場作用下小分子帶電物或離子向與其本身電荷相反的電極移動，透過帶電物或離子向與其本身電荷相反的電極移動，透過半透膜，達(dá)到分離目的。半透膜，達(dá)到分離目的。電滲析電滲析離子交換膜電滲析離子交換膜電滲析應(yīng)用：應(yīng)用：脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠電洗脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸

36、及凝膠電洗脫。脫。用離子交換膜代替一般的半透膜。用離子交換膜代替一般的半透膜。樣品液樣品液緩沖液3、擴(kuò)散膜分離、擴(kuò)散膜分離透析膜透析膜商品透析膜大多制成管狀商品透析膜大多制成管狀 。材料：纖維素衍生物。材料：纖維素衍生物。1）透析膜的預(yù)處理透析膜的預(yù)處理：目的：目的：除雜質(zhì)。除雜質(zhì)。 2）透析袋的保存透析袋的保存 ：防腐劑防腐劑冷藏。冷藏。第三節(jié)、酶的高度分離第三節(jié)、酶的高度分離一、層析分離二、電泳分離二、層析分離二、層析分離 層析法也稱色譜法，是層析法也稱色譜法，是1903年俄國植物學(xué)年俄國植物學(xué)家家Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。將植物色素溶發(fā)現(xiàn)并命名的。將植物色素溶液通過裝有液

37、通過裝有CaCO3 吸附劑的柱子，然后用石吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動后形成油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開。不同的色帶而被分開。 色譜色譜組分色素石油醚石油醚碳酸鈣顆粒色譜起源色譜起源用色彩（用色彩（chromachroma）和圖譜（）和圖譜（graphsgraphs）組成色譜）組成色譜 一詞，（一詞，（Chromatography) Chromatography) 。層析法的基本原理利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)( (分子大小和分子大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)形狀、分子極性、吸附力

38、、分子親和力、分配系數(shù)等等) )的差別，的差別，使各組分在流動相和固定相中的分布使各組分在流動相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移動而達(dá)到分離的目的。程度不同，并以不同的速度移動而達(dá)到分離的目的。：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體：靜止不動的一相：靜止不動的一相層析法的分類l按兩相所處的狀態(tài)分類：按兩相所處的狀態(tài)分類： 液相層析液相層析氣相層析氣相層析液液-液層析液層析液液- -固層析固層析氣氣- -液層析液層析氣氣- -固層析固層析l 按層析原理分類按層析原理分類 層析方法分離依據(jù)吸附層析吸附層析利用吸附劑表面對不同組分吸附性能差異吸附性能差異而使混合物中各組分

39、分離分配層析分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對不同組分的親和力親和力不同，而達(dá)到分離目的凝膠層析凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用凝膠對相對分子質(zhì)相對分子質(zhì)量量不同不同各種組分的阻滯作用不同，而達(dá)到物質(zhì)分離親和層析親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的專一而又可逆的親和力親和力，使生物分子分離純化層析聚焦層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離l按操作形式不同分類：柱層析柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品

40、沿一個方向移動而達(dá)到分離。向移動而達(dá)到分離。紙層析紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。動相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。（一）吸附層析（一）吸附層析（adsorption chromatography）l原理原理 利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解作用（解吸作用）力的大小及洗脫液對它的溶解作用（解吸作用

41、）的差異進(jìn)行分離。的差異進(jìn)行分離。l吸附作用的強(qiáng)弱主要與吸附劑和被吸附物質(zhì)的吸附作用的強(qiáng)弱主要與吸附劑和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。性質(zhì)有關(guān)。l吸附層析的關(guān)鍵是吸附層析的關(guān)鍵是吸附劑吸附劑和和洗脫劑洗脫劑的選擇。的選擇。常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析吸附層析柱柱。層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生在洗脫時，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。的過程。 溶劑洗脫法置換洗脫法前緣洗脫法 吸附層析操作：吸附層析操作：2.吸附劑 吸附劑通過范德華力、靜電引力、疏水作用

42、等與待分吸附劑通過范德華力、靜電引力、疏水作用等與待分離物質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。離物質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。1 1）吸附劑的選擇：）吸附劑的選擇：根據(jù)吸附能力強(qiáng)弱分為：根據(jù)吸附能力強(qiáng)弱分為： 弱吸附劑：蔗糖、淀粉弱吸附劑：蔗糖、淀粉 中等吸附劑：碳酸鈣、磷酸鈣、硅膠等中等吸附劑：碳酸鈣、磷酸鈣、硅膠等 強(qiáng)吸附劑：氧化鋁、活性炭強(qiáng)吸附劑：氧化鋁、活性炭吸附劑的選擇根據(jù)相似相溶原則：吸附劑的選擇根據(jù)相似相溶原則：l極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)l非極性的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。非極性的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。l但為了便于解吸附，對于極性強(qiáng)的物質(zhì)通常選但為了便于解吸附

43、，對于極性強(qiáng)的物質(zhì)通常選用極性弱的吸附劑進(jìn)行吸附用極性弱的吸附劑進(jìn)行吸附2）吸附劑的性質(zhì)：l活性炭：活性炭：常用的吸附介質(zhì)。常用的吸附介質(zhì)。l硅膠：硅膠：常用的極性吸附介質(zhì)。常用的極性吸附介質(zhì)。l羥基磷灰石羥基磷灰石 （HA） Ca10(PO4)6.(OH)2 : 微晶型的磷酸鈣制品，表面有微晶型的磷酸鈣制品，表面有Ca2+和和PO43-兩兩種帶電基團(tuán)；種帶電基團(tuán)； 酸性和中性蛋白質(zhì)可與酸性和中性蛋白質(zhì)可與Ca2+結(jié)合；堿性蛋白結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與質(zhì)可與PO43-結(jié)合。結(jié)合。 吸附原理是吸附原理是HA的的Ca2+與蛋白質(zhì)的負(fù)電荷基與蛋白質(zhì)的負(fù)電荷基團(tuán)作用。團(tuán)作用。 3. 洗脫劑要求：要求： 粘

44、度小，純度高，穩(wěn)定性好，完全洗脫下所要粘度小，純度高，穩(wěn)定性好，完全洗脫下所要分離的成分分離的成分,易與目標(biāo)分子分離。易與目標(biāo)分子分離。選擇：選擇：l具有較高洗脫能力的洗脫劑作為流動相。具有較高洗脫能力的洗脫劑作為流動相。l生物大分子一般選擇中性鹽溶液為洗脫劑。生物大分子一般選擇中性鹽溶液為洗脫劑。常用洗脫劑種類：常用洗脫劑種類：飽和烴、醇、酮、酚、醚、鹵代烷、水等飽和烴、醇、酮、酚、醚、鹵代烷、水等（二）分配層析（二）分配層析分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。分配系數(shù)：分配系數(shù)：是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時，該溶質(zhì)在兩項(xiàng)溶劑中的濃度的比值。

45、在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。K=固定相中溶質(zhì)的濃度固定相中溶質(zhì)的濃度流動相中溶質(zhì)的濃度流動相中溶質(zhì)的濃度由于不同溶質(zhì)有不同的分配系數(shù)，移動速度不同，從而達(dá)由于不同溶質(zhì)有不同的分配系數(shù)，移動速度不同，從而達(dá)到分離到分離p 在分配層析中，通常采用多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。p 另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為流動相流動相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動相的帶動流經(jīng)固定相時，該溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動態(tài)分配。 紙上層析：紙上層析：濾紙為載體，紙上結(jié)合水為固定相，有機(jī)溶劑為流動相濾紙為載體，紙上結(jié)合

46、水為固定相，有機(jī)溶劑為流動相分配薄層層析：纖維素、硅藻土為支持物。分配薄層層析：纖維素、硅藻土為支持物。 （三）離子交換層析（三）離子交換層析 （ion exchange chromatography，IEC）1.1.原理原理: :根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離 純化方法。純化方法。1）離子交換劑：）離子交換劑：l離子交換劑由載體、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。離子交換劑由載體、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。 如羧甲基纖維素離子交換劑組成如羧甲基纖維素離子交換劑組成 纖維素纖維素O OCHCH2 2COOCOO- -NaNa+ + 載體載體 電荷基團(tuán)電荷基團(tuán) 反離子反離子是含

47、有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過在是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。（活性基團(tuán)）而制成。 化學(xué)原料合成化學(xué)原料合成 ：樹脂類物質(zhì)：樹脂類物質(zhì)（酚醛樹脂、苯乙烯樹脂）（酚醛樹脂、苯乙烯樹脂） 載體載體 天然材料制成：天然材料制成： cellulose cellulose sephadex sepharose 陽離子交換劑陽離子交換劑: 電荷基團(tuán)（）電荷基團(tuán)（）, 反離子（）反離子（）電荷基團(tuán)電荷基團(tuán) 陰離子交換劑陰離子交換劑: 電荷基團(tuán)（）電荷基團(tuán)（）, 反離子（）反離子（

48、） 如：如：DEAE-纖維素，纖維素， CM-Sepharose離子交換劑離子交換劑-帶有電荷基團(tuán)的帶有電荷基團(tuán)的不溶性不溶性載體載體-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3載體載體Cl-Diethylaminoethyl(DEAE) 陰離子交換劑陰離子交換劑(可吸附可吸附帶負(fù)電的蛋白質(zhì)帶負(fù)電的蛋白質(zhì)) 陽離子交換劑陽離子交換劑(可吸附可吸附帶正電的蛋白質(zhì)帶正電的蛋白質(zhì))陰離子交換劑：陰離子交換劑：l常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羥丙基羥丙基陽離子交換劑：陽離子交換劑：l常用羧甲基常用羧甲基 CM CH2COO- l磺丙基磺丙基 SP C3H6SO3-

49、DEAE C2H4N+(C2H5)2HQAE C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3類型類型說明說明功能基功能基反離子反離子DEAE-SephadexDEAE-Sephadex A-25 A-25 ，A-50A-50弱堿性陰離弱堿性陰離子交換劑子交換劑二乙氨基己基二乙氨基己基氯氯QAE-SephadexQAE-Sephadex A-25 A-25 ，A-50A-50強(qiáng)堿性陰離強(qiáng)堿性陰離子交換劑子交換劑二乙氨基己二乙氨基己基基2-2-羥丙羥丙基基氯氯CM-SephadexCM-Sephadex C-25 C-25 ，C-50C-50弱酸性陽離弱酸性陽離子交換劑子交換劑羧甲基羧甲基鈉鈉

50、SP-SephadexSP-Sephadex C-25 C-25 ，C-50C-50強(qiáng)酸性陽離強(qiáng)酸性陽離子交換劑子交換劑磺丙基磺丙基鈉鈉Ion-exchange chromatography1. 基本原理基本原理 大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來； 小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長而小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長而后流出層析柱。后流出層析柱。凝膠層析柱中裝有多孔凝膠多孔凝膠，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于

51、凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進(jìn)入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進(jìn)出于一個個顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動小分子物質(zhì)向下移動的速度比大分子的速度慢，從而的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對分使混合溶液中各組分按照相對分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的層析柱，而達(dá)到分離的目的。Size-exclusion chromatography凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)KdKd表示：表示： Ve-Vo Kd= ViVo外水體積外水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（，層析柱內(nèi)凝

52、膠顆粒之間空隙的體積（ml）Vi內(nèi)水體積內(nèi)水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（ml）Ve某組分的洗脫體積某組分的洗脫體積，從加進(jìn)層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)，從加進(jìn)層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時的洗脫液體積（高峰時的洗脫液體積（ml）凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰. K. Kd d=0=0時時, ,即即VeVe=Vo,=Vo,說明該組分分子量足夠大，不進(jìn)入微孔，最說明該組分分子量足夠大，不進(jìn)入微孔，最先流出。先流出。. K. Kd d=1=1時時, ,即即VeVe=Vo+Vi=Vo+Vi，說明該組分能進(jìn)入凝膠的全部內(nèi)空隙，

53、說明該組分能進(jìn)入凝膠的全部內(nèi)空隙，最后流出。最后流出。. . 其它組分其它組分0K0Kd d1,1,因分子大小而改變洗脫峰的位置。因分子大小而改變洗脫峰的位置。KdKd小的先小的先流出，流出，KdKd大的后流出。大的后流出。分配系數(shù)分配系數(shù)Kd的意義：的意義：1) 可定量地衡量各組分的流出順序。可定量地衡量各組分的流出順序。2) 判斷分離效果，判斷分離效果，Kd差異大，分離效果好，差異大，分離效果好， Kd差異小，分離效果差。差異小，分離效果差。2.凝膠的種類和性質(zhì)凝膠的種類和性質(zhì)1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（交聯(lián)葡聚糖凝膠（dextran gel) 商品名商品名:Sephadex 型號型號 Sepha

54、dex G10至至G-200 G 后的數(shù)字為凝膠吸水值的后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。數(shù)字越大，倍。數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，孔徑越大，分離范圍越廣。交聯(lián)度越小，孔徑越大，分離范圍越廣。葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)參數(shù)葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)參數(shù) 凝膠型號凝膠型號 顆粒大小顆粒大小/m/m 溶脹體積溶脹體積/(ml/g)/(ml/g) 分離范圍（分離范圍（MrMr） SephadexSephadex G-10 G-10 SephadexSephadex G-15 G-15 SephadexSephadex G-25 G-25 SephadexSephadex G-50 G-50 SephadexSep

55、hadex G-75 G-75 SephadexSephadex G-100 G-100 SephadexSephadex G-150 G-150SephadexSephadex G-200 G-2004 4120120 4 4120120 5050150150 5050150150 4040120120 4040120120 4040120120 4040120120 2 23 3 2.52.53.53.5 4 46 6 9 91111 12121515 15152020 20203030 20203030 小于小于7 710102 2 小于小于1.51.510103 3 1.01.0101

56、03 35.05.010103 3 1.51.510103 33.03.010104 43.03.010103 38.08.010104 4 4.04.010103 31.01.010105 5 5.05.010103 33.03.010105 5 5.05.010103 36.06.010105 5 2）瓊脂糖凝膠（）瓊脂糖凝膠（agarose gel)商品名商品名:Sepharose （瑞典）（瑞典）; Bio-Gel A (美國）美國）依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。Sepharose及及

57、Bio-gel A 型號型號 型號型號 使用范圍（蛋白質(zhì)的分子量）使用范圍（蛋白質(zhì)的分子量）含瓊脂糖含瓊脂糖（） 6B6BSepharoseSepharose 4B 4B 2B 2B10104 43 310106 610105 53 310107 710106 610108 8 6 64 4 2 2 6B 6BSepharoseSepharose CL 4B CL 4B 2B 2B 同上同上 同上同上 0.5m0.5m Bio-Gel A 1.5mBio-Gel A 1.5m 5m 5m 15m 15m 50m 50m 150m 150m101050050010103 310101500150

58、0101050005000404015000150001001005000050000 1000 1000150000150000 10108 86 64 42 2 1 1 3）聚丙烯酰胺凝膠）聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel）l商品名為商品名為Bio-Gel,型號從型號從 Bio-Gel P2至至P-300，P值越大，孔徑也越大。值越大，孔徑也越大。l以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。劑聚合成的高分子聚合物。3. 操作：操作：1）凝膠的選擇和處理）凝膠的選擇和處理 根據(jù)相對分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號的凝膠

59、根據(jù)相對分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號的凝膠介質(zhì)。介質(zhì)。 將干膠懸浮于將干膠懸浮于510倍的蒸餾水中倍的蒸餾水中 ，充分溶，充分溶脹，抽氣，裝柱。脹，抽氣，裝柱。2）柱的選擇）柱的選擇 采用采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速影響流速。3）加樣）加樣 體積不能過多，不超過床體積的體積不能過多，不超過床體積的5，脫鹽時，脫鹽時可在可在10左右。左右。4）洗脫）洗脫 洗脫液與平衡時用的洗脫液與平衡時用的buffer一致。一致。 洗速不可過快，保持恒速。洗速不可過快，保持恒速。5）膠的保存）膠的保存 洗脫完畢后，凝膠柱已恢復(fù)到上柱前的狀態(tài)，洗脫完畢后，凝膠柱已恢復(fù)

60、到上柱前的狀態(tài)，不必再生處理。不必再生處理。 用用0.02%NaN3防腐。防腐。4. 應(yīng)用應(yīng)用 1）脫鹽）脫鹽) 生物大分子物質(zhì)的分離純化生物大分子物質(zhì)的分離純化 3）分子量的測定）分子量的測定 4）溶液濃縮）溶液濃縮 （五）親和層析(Affinity Chromatography) 由吸附層析發(fā)展起來的由吸附層析發(fā)展起來的 ，是從復(fù)雜混和物中純化蛋，是從復(fù)雜混和物中純化蛋白質(zhì)的最好方法。白質(zhì)的最好方法。 1.1.原理原理 利用生物大分子間利用生物大分子間特異的親和力特異的親和力來純化生物大分子，來純化生物大分子，如：如：抗原抗原和和抗體抗體；酶酶和和底物底物或或輔酶輔酶或或抑制劑抑制劑；激素