[生物]RNA干擾文庫(kù)及其在功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用

1、生物RNA干擾文庫(kù)及其在功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用人類(lèi)基因組大規(guī)模測(cè)序已經(jīng)根本完成。但破解基因組的序列只是一個(gè)起點(diǎn)，目前多數(shù)基因的功能還不清楚，因此基因功能的研究是今后的開(kāi)展趨勢(shì)。傳統(tǒng)研究基因功能的最有效技術(shù)之一是細(xì)胞和小鼠的基因敲除技術(shù)。但該技術(shù)存在技術(shù)復(fù)雜、周期長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)，極大地限制了它的應(yīng)用。應(yīng)用物理和化學(xué)突變技術(shù)可以誘導(dǎo)基因的隨機(jī)突變，導(dǎo)致細(xì)胞或動(dòng)物表型的缺陷，直接進(jìn)展基因功能的篩眩但由于該方法通常需要兩個(gè)等位基因同時(shí)突變才會(huì)出現(xiàn)明顯的表型，成功的時(shí)機(jī)比較低。而rna干擾(rnainterferene，rnai)文庫(kù)有希望成為一種簡(jiǎn)單、高效、大規(guī)模、高通量的功能基因組學(xué)研究的工具

2、。1rnai及rnai文庫(kù)rnai是近年來(lái)的重大發(fā)現(xiàn)，是動(dòng)物和植物界普遍存在的一種防御反響。rnai被細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的雙鏈rna(dsrna)所激活，可以高度特異地抑制同源基因的表達(dá)。根據(jù)目前的研究，rnai的可能機(jī)制如下：長(zhǎng)片段dsrna在細(xì)胞內(nèi)被型rna酶dier切成長(zhǎng)度大約為1923nt的小片段干擾rna(sallinterferingrna，sirna)，由sirna參與構(gòu)成復(fù)合物ris(rna-induedsileneplex)。sirna通過(guò)與同源rna的特異配對(duì)，引導(dǎo)ris特異地降解同源rna，導(dǎo)致基因表達(dá)的抑制。因此小片段的sirna也可以誘導(dǎo)高效的基因沉默。在線蟲(chóng)，注射或喂食ds

3、rna能引起特異基因在動(dòng)物各器官的沉默，而且該抑制作用可以持續(xù)到第一代的子代動(dòng)物。但是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通過(guò)長(zhǎng)片段dsrna直接轉(zhuǎn)染會(huì)引起細(xì)胞的毒性反響，基因沉默效果差。近年來(lái)，陸續(xù)有用體外合成的sirna，或用質(zhì)粒、病毒等載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)sirna到達(dá)在細(xì)胞和小鼠抑制特定基因表達(dá)的報(bào)道。rnai文庫(kù)(rnailibrary)是人工構(gòu)建的能通過(guò)誘導(dǎo)rnai抑制眾多不同基因表達(dá)的混合文庫(kù)，可以用于建立功能缺陷(lssffuntin)的生物或細(xì)胞庫(kù)，進(jìn)展表型的篩眩該技術(shù)在線蟲(chóng)的應(yīng)用最為成功。在線蟲(chóng)等形式生物的研究中，應(yīng)用rnai文庫(kù)建立隨機(jī)基因抑制的線蟲(chóng)，再進(jìn)展表型的挑選，已在其胚胎發(fā)育等領(lǐng)域獲得了

4、重要的發(fā)現(xiàn)。該文庫(kù)用含方向相對(duì)的兩個(gè)t7啟動(dòng)子的載體，可從一個(gè)隨機(jī)克隆的dna模板分別轉(zhuǎn)錄出長(zhǎng)片段的正義和反義rna，形成dsrna，在體內(nèi)被dier切割成小片段的sirna，特異地抑制靶基因的表達(dá)。由于細(xì)胞外dsrna不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞有效地誘導(dǎo)rnai，另外，長(zhǎng)鏈dsrna(30nt)可導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性反響，出現(xiàn)非特異的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和凋亡，上述轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)片段dsrna建立rnai文庫(kù)的方法不能應(yīng)用于哺乳動(dòng)物及其細(xì)胞。線蟲(chóng)等形式生物與人的差距較大，從形式生物獲得的研究結(jié)果雖然有比較重要的意義，但不能取代在人和其他高等動(dòng)物的直接研究。因此建立可以用于人的細(xì)胞以及其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞的rnai文庫(kù)

5、有非常重要的意義。rnai文庫(kù)將為研究基因功能、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶基因、發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因、探究腫瘤治療新途徑等提供重要的方法。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞建立rnai文庫(kù)的方案有兩類(lèi)。我們將對(duì)這兩類(lèi)建庫(kù)方案及其在功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用作一介紹。2哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因rnai文庫(kù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因rnai文庫(kù)構(gòu)建的方法如下：首先選定靶基因，根據(jù)靶基因的dna序列和sirna設(shè)計(jì)原那么，合成sirna，或合成寡核苷酸序列并克隆到表達(dá)載體，或用pr的方法擴(kuò)增為sirna表達(dá)盒。眾多針對(duì)不同基因的sirna或sirna表達(dá)載體或表達(dá)盒即構(gòu)成有限的rnai文庫(kù)。應(yīng)用該文庫(kù)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以特異地抑制不

6、同基因的表達(dá)，通過(guò)表型的挑選來(lái)發(fā)現(xiàn)功能基因，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路新分子的篩癬與腫瘤細(xì)胞存活或轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的挑選等。aza-blan等應(yīng)用dharan公司消費(fèi)的針對(duì)510個(gè)基因(包括了大多數(shù)激酶基因)的sirna文庫(kù)，通過(guò)轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞挑選了對(duì)trail誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有調(diào)控作用的基因。trail是tnf家族的一員，具有抗腫瘤的功能。實(shí)驗(yàn)證明，trail蛋白能同dr4和dr5受體結(jié)合，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響。aza-blan等的挑選既發(fā)現(xiàn)了一些能增強(qiáng)trail誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因，也發(fā)現(xiàn)了一些具有抑制作用的基因。這些基因包括以前對(duì)trail功能有調(diào)控作用的基因如gsk30和srp72

7、，也包括一些未知的調(diào)控基因如dbi、irsa等，對(duì)理解trail的作用機(jī)制和抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)有重要的意義。berns等構(gòu)建了針對(duì)7914個(gè)基因的人rnai文庫(kù)。他們應(yīng)用了shrna(shrthairpinrna)反轉(zhuǎn)錄病毒載體，每一個(gè)基因構(gòu)建了3個(gè)不同的shrna載體，共有23742個(gè)不同的載體。用該rnai文庫(kù)進(jìn)展基因功能的挑選，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)、5個(gè)未知的在p53依賴(lài)的增殖阻滯中起調(diào)控作用的基因。進(jìn)一步的研究證明，抑制這些基因的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)p53和p19arf依賴(lài)的增殖阻滯以及對(duì)dna破壞誘導(dǎo)的g1細(xì)胞周期阻滯均不敏感。paddisn等應(yīng)用shrna病毒載體，構(gòu)建了針對(duì)9610個(gè)人基因和556

8、3個(gè)小鼠基因的shrna表達(dá)文庫(kù)。在26s蛋白酶系統(tǒng)的功能基因挑選中，證實(shí)該rnai文庫(kù)的實(shí)用性和可靠性。zheng等構(gòu)建了一個(gè)雙啟動(dòng)子載體pdual。該載體包含兩個(gè)方向相對(duì)的聚合酶啟動(dòng)子，分別為小鼠的u6啟動(dòng)子和人的h1啟動(dòng)子，中間插入能轉(zhuǎn)錄sirna的dna序列(圖1)。該載體的優(yōu)點(diǎn)是，正義和反義rna從同一dna序列轉(zhuǎn)錄，減少了合成dna序列的長(zhǎng)度，降低了費(fèi)用和工作量。他們巧妙地設(shè)計(jì)了能用pr擴(kuò)增的含雙啟動(dòng)子的sirna表達(dá)盒，并證實(shí)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞有效地抑制基因的表達(dá)。應(yīng)用這一技術(shù)，他們構(gòu)建了針對(duì)8000個(gè)基因的sirna表達(dá)盒，在大規(guī)模的功能基因挑選中發(fā)現(xiàn)了一些和未知的在nf-kb

9、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要作用的基因。silva等將sirna和sirna表達(dá)載體與轉(zhuǎn)染試劑混合后以微陣列的形式點(diǎn)在細(xì)胞培養(yǎng)板上，可以轉(zhuǎn)染在板上生長(zhǎng)并與之接觸的活細(xì)胞。該技術(shù)為應(yīng)用rnai文庫(kù)進(jìn)展細(xì)胞的基因功能挑選提供了一個(gè)簡(jiǎn)單有效的方法。上述研究均證明了有限的基因rnai文庫(kù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因功能研究中的可行性，為哺乳動(dòng)物及其細(xì)胞大規(guī)模功能基因組學(xué)的研究提供了一個(gè)重要的技術(shù)?；騬nai文庫(kù)存在以下缺陷：a不是隨機(jī)rnai文庫(kù)，必須知道靶基因的序列，細(xì)胞基因的覆蓋面窄；b針對(duì)每一個(gè)基因必須合成2條以上寡核苷酸，才能確保從中選出干擾效果較好的；需要合成眾多的不同sirna，或構(gòu)建眾多的不同載體；d所

10、需費(fèi)用高，挑選的工作量宏大。3晡乳動(dòng)物細(xì)胞隨機(jī)rnai文庫(kù)隨機(jī)rnai文庫(kù)(randrnailibrary)是人工構(gòu)建的可能針對(duì)任何基因的rnai文庫(kù)。目前已報(bào)道的方法有兩種，一是通過(guò)化學(xué)合成隨機(jī)dna序列的方法，二是通過(guò)dna酶切并克隆到載體的方法。隨機(jī)rnai文庫(kù)不需要知道靶基因的序列，因此理論上講可以構(gòu)成抑制任何基因表達(dá)的干擾文庫(kù)，抑制基因rnai文庫(kù)細(xì)胞基因覆蓋面窄的缺陷。該文庫(kù)同常用的基因表達(dá)文庫(kù)一樣，為不同sirna載體的混合物，因此易于保存，顯著地減少了挑選的工作量?；瘜W(xué)合成隨機(jī)dna序列構(gòu)成隨機(jī)rnai文庫(kù)的方法是應(yīng)用以下原理。在化學(xué)合成寡核苷酸時(shí)，假設(shè)堿基選為n，那么dna合

11、成儀在合成dna片段時(shí)將隨機(jī)選擇a、t、g、中的任何一種。1921nt的寡核苷酸假設(shè)部分或全部選為n時(shí)，那么形成了眾多不同隨機(jī)序列寡核苷酸的混合物。在進(jìn)展互補(bǔ)鏈合成并克隆到雙啟動(dòng)子rnai載體(見(jiàn)圖1的載體)后，就形成了隨機(jī)rnai文庫(kù)。限制性?xún)?nèi)切酶ei的特點(diǎn)是在dna識(shí)別序列(tga)下游2021bp處切開(kāi)dna片段。lu等巧妙地應(yīng)用ei的獨(dú)特特性，設(shè)計(jì)了將長(zhǎng)dna片段酶切為202lnt小dna片段，克隆于sirna表達(dá)載體構(gòu)成隨機(jī)rnai文庫(kù)的方案，稱(chēng)為speed。首先將隨機(jī)dna片段與含ei酶切位點(diǎn)發(fā)夾構(gòu)造的dna接頭(linker)連接，再用ei消化，獲得2021bp與接頭連接的dna

12、小片段。將形成的雙鏈dna翻開(kāi)成單鏈，合成互補(bǔ)鏈，形成方向相對(duì)的兩個(gè)小片段dna的拷貝，中間為不配對(duì)的形成發(fā)夾構(gòu)造的dna序列。再克隆到反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，構(gòu)成隨機(jī)rnai文庫(kù)。利用小鼠胚胎dna文庫(kù)，他們建立了含3106克壟可以抑制眾多不同基因的隨機(jī)rnai文庫(kù)，證明該方法的可行性。shirane等應(yīng)用同lu等根本一樣的思路獨(dú)立地設(shè)計(jì)了構(gòu)建隨機(jī)rnai文庫(kù)的方法，稱(chēng)為epril。應(yīng)用鼠源fl5.12細(xì)胞的dna文庫(kù)，他們建立了隨機(jī)rnai文庫(kù)。對(duì)240個(gè)不同克隆的隨機(jī)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，215個(gè)克隆含有正確的能表達(dá)sirna的dna片段。blast分析顯示，165個(gè)克隆的插入片段與己知基因或est的順序相吻合，絕大多數(shù)分屬不同的基因。這一結(jié)果說(shuō)明，epril可以用于復(fù)雜基因的隨機(jī)rnai文庫(kù)的構(gòu)建。sen等獨(dú)立地設(shè)計(jì)了相似的建庫(kù)方案，稱(chēng)為regs(restritinenzye-genera