豬胰臟制備優(yōu)質(zhì)ppt課件

1、動物胰蛋白酶的制備及活力的測定一、生物大分子制備概述 生物大分子主要是指蛋白質(zhì)、多糖和核酸，這三類物質(zhì)是生命活動的物質(zhì)根底。在自然科學，尤其是生命科學高度開展的今天，蛋白質(zhì)、多糖和核酸等生物大分子的構(gòu)造與功能的研討是探求生命奧妙的中心課題，而生物大分子構(gòu)造與功能的研討，必需首先處理生物大分子的制備問題，沒有可以到達足夠純度的生物大分子的制備任務(wù)為前題，構(gòu)造與功能的研討就無從談起。然而生物大分子的分別純化與制備是一件非常細致而困難的任務(wù)，有時制備一種高純度的蛋白質(zhì)、酶或核酸，要付出長期和艱苦的努力。 生物資料的組成極其復(fù)雜，經(jīng)常包含有數(shù)百種 乃至幾千種化合物。 生物大分子在生物資料中的含量極微。

2、只需萬分之一、幾十萬分之 一，甚至幾百萬分之一。分別純化的步驟繁多，流程又長，有的目 的產(chǎn)物要經(jīng)過十幾步、幾十步的操作才干到達所需純度的要求。例 如由腦垂體組織獲得某些激素的釋放因子，要用幾噸甚至幾十噸的 生物 資料，才干提取出幾毫克的樣品。 生物大分子一旦分開了生物體內(nèi)的環(huán)境時就極易失活。因此分別過 程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。過 酸、過堿、高溫、猛烈的攪拌、強輻射及本身的自溶等都會使生物 大分子變性而失活，所以分別純化時一定要選用最適宜的環(huán)境和條 件。 生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進展的，溫度、pH值、離子強 度等各種參數(shù)對溶液中各種組成的綜合影響，很難準確估

3、計和判 斷。 與化學產(chǎn)品的分別制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點： 1.確定要制備的生物大分子的目的和要求，是進展科研、消費還是要發(fā)現(xiàn)新的物質(zhì)。 2.建立相應(yīng)的可靠的分析測定方法，這是制備生物大分子的關(guān)鍵，由于它是整個分別純化過程的“眼睛。 3.經(jīng)過文獻調(diào)研和預(yù)備性實驗，掌握生物大分子目的產(chǎn)物的物理化學性質(zhì)。 4.生物資料的破碎和預(yù)處置。 5.分別純化方案的選擇和探求，這是最困難的過程 6.生物大分子制備物的均一性即純度的鑒定，要求到達一維電泳一條帶，二維電泳一個點，或HPLC和毛細管電泳都是一個峰。 7.產(chǎn)物的濃縮，枯燥和保管。 生物大分子的制備通?？砂匆韵虏襟E進展：二、生物大分子制

4、備的前處置一 生物資料的選擇制備生物大分子，首先要選擇適當?shù)纳镔Y料。資料的來源無非是動物、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物。從工業(yè)消費角度選擇資料，應(yīng)選擇含量高、來源豐富、制備工藝簡單、本錢低的原料。從科研任務(wù)的角度選材，那么只須思索資料的選擇符合實驗預(yù)定的目的要求即可。除此之外，選材還應(yīng)留意植物的季節(jié)性、地理位置和生長環(huán)境等。選動物資料時要留意其年齡、性別、營養(yǎng)情況、遺傳素質(zhì)和生理形狀等。動物在饑餓時，脂類和糖類含量相對減少，有利于生物大分子的提取分別。選微生物資料時要留意菌種的代數(shù)和培育基成分等之間的差別，例如在微生物的對數(shù)期，酶和核酸的含量較高，可獲得較高的產(chǎn)量。 資料選定后要盡能夠堅持新穎，

5、盡快加工處置，動物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等非活性部分，絞碎后在適當?shù)娜軇┲刑崛?，假設(shè)所要求的成分在細胞內(nèi)，那么要先破碎細胞。植物要先去殼、除脂。微生物資料要及時將菌體與發(fā)酵液分開。生物資料如暫不提取，應(yīng)冰凍保管。動物資料那么需深度冷凍保管。 二 細胞的破碎 1機械法： 1) 研磨將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中，參與少量石英砂研磨或勻漿，即可將動物細胞破碎，這種方法比較溫暖，適宜實驗室運用。工業(yè)消費中可用電磨研磨。細菌和植物組織細胞的破碎也可用此法。2) 組織搗碎機這是一種較猛烈的破碎細胞的方法，為了防止發(fā)熱和升溫過高，通常是轉(zhuǎn)10秒20秒，停10秒20秒，可反復(fù)多次。 2物理法： 1)

6、 反復(fù)凍融法 將待破碎的細胞冷至15到20，然后放于室溫(或40)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細胞內(nèi)構(gòu)成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細胞溶脹破碎。2) 超聲波處置法此法是借助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器。破碎微生物細菌和酵母菌時，時間要長一些，處置的效果與樣品濃度和運用頻率有關(guān)。運用時留意降溫，防止過熱。3) 壓榨法這是一種溫暖的、徹底破碎細胞的方法。在1000 105Pa2000105Pa 的高壓下使幾十毫升的細胞懸液經(jīng)過一個小孔忽然釋放至常壓，細胞將徹底破碎。這是一種較理想的破碎細胞的方法，但儀器用較高。 4) 冷熱交替法 從細菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時可用此法。在90左右維

7、持數(shù)分鐘，立刻放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細胞可以被破碎。 3化學與生物化學方法：自溶法 將新穎的生物資料存放于一定的pH和適當?shù)臏囟认?，細胞?gòu)造在本身所具有的各種水解酶如蛋白酶和酯酶等的作用下發(fā)生溶解，使細胞內(nèi)含物釋放出來，此法稱為自溶法。運用時要特別小心操作，由于水解酶不僅可以使細胞壁和膜破壞，同時也能夠會把某些要提取的有效成分分解了。2 溶脹法 細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在浸透壓差，溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出細胞內(nèi)含物。 3) 酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37，pH8，處置15分鐘，可以專注性

8、地將細胞壁分解，釋放出細胞內(nèi)含物，此法適用于多種微生物。例如從某些細菌細胞提取質(zhì)粒DNA時，可采用溶菌酶來自蛋清破細胞壁，而在破酵母細胞時，常采用蝸牛酶來自蝸牛，將酵母細胞懸于0.1mmol/L 檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液(pH=5.4)中，加1蝸牛酶，在30處置30分鐘，即可使大部分細胞壁破裂，好像時參與0.2疏基乙醇效果會更好。此法可以與研磨法結(jié)合運用。4) 有機溶劑處置法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS十二烷基硫酸鈉等外表活性劑處置細胞，可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂，此法也可以與研磨法結(jié)合運用。 三 生物大分子的提取 “提取是在分別純化之前將經(jīng)過預(yù)處置或破碎的細胞置于溶劑中，使

9、被分別的生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡能夠堅持原來的天然形狀不喪失生物活性的過程。 1水溶液提?。?蛋白質(zhì)和酶的提取普通以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。用水溶液提取生物大分子應(yīng)留意的幾個主要影響要素是：鹽濃度即離子強度： 絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中參與少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時大大添加，稱為“鹽溶景象。但中性鹽的濃度添加至一定時，蛋白質(zhì)的溶解度又逐漸下降，直至沉淀析出，稱為“鹽析景象。鹽溶景象的產(chǎn)生主要是少量離子的活動，減少了偶極分子之間極性基團的靜電吸引力，添加了溶質(zhì)和溶劑分子間

10、相互作用力的結(jié)果。所以低鹽溶液常用于大多數(shù)生化物質(zhì)的提取。通常運用0.02 mol/L 0.05 mol/L 緩沖液或0.09 mol/L 0.15 mol/L NaCl 溶液提取蛋白質(zhì)和酶。不同的蛋白質(zhì)極性大小不同，為了提高提取效率，有時需求降低或提高溶劑的極性。向水溶液中參與蔗糖或甘油可使其極性降低，添加離子強度如參與KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4可以添加溶液的極性。2) pH值：蛋白質(zhì)、酶與核酸的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有關(guān)。過酸、過堿均應(yīng)盡量防止，普通控制在pH=68范圍內(nèi)，提取溶劑的pH應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點的兩側(cè)。堿性蛋白質(zhì)選在偏酸一側(cè)，酸性

11、蛋白質(zhì)選在偏堿的一側(cè)，以添加蛋白質(zhì)的溶解度，提高提取效果。例如胰蛋白酶為堿性蛋白質(zhì)，常用稀酸提取，而肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質(zhì)，那么常用稀堿來提取。3) 溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時普通在05的低溫操作。但少數(shù)對溫度耐受力強的蛋白質(zhì)和酶，可提高溫度使雜蛋白變性，有利于提取和下一步的純化。2有機溶劑提取 一些和脂類結(jié)合比較結(jié)實或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機溶劑提取。常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等。 其中正丁醇在0時在水中的溶解度為10.5，40時為6.6，同時又器具有較強的親脂性，因此常用

12、來提取與脂結(jié)合較牢或含非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)、酶和脂類。 三、生物大分子的分別純化 1. 沉淀法 沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過程。沉淀法即溶解度法操作簡便，本錢低廉，不僅用于實驗室中，也用于某些消費目的的制備過程，是分別純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時最常用的方法。經(jīng)過沉淀，將目的生物大分子轉(zhuǎn)入固相沉淀或留在液相，而與雜質(zhì)得到初步的分別。在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法是： 中性鹽沉淀鹽析法：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分別純化。 蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，由于這些分子的COOH、NH2和OH都是親水基團，這些基團與極性水分子相互作用構(gòu)成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周圍構(gòu)成1nm10

13、0nm顆粒的親水膠體，減弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力，蛋白質(zhì)分子外表極性基團越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因此溶解度也越大。親水膠體在水中的穩(wěn)定要素有兩個：即電荷和水膜。由于中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以參與大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴顯露疏水區(qū)域，同時又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即構(gòu)成沉淀。 鹽析的操作方法 最常用的是固體硫酸銨參與法。欲從較大體積的粗提取液中沉淀蛋白質(zhì)時，往往運用固體硫酸銨，參與之前要先將其研成細粉不能有塊，要在攪拌下緩慢均勻少量多次地參與，尤其到接近方案飽和度時，加鹽的速度更要慢一些，盡量防止部分硫酸銨濃度

14、過大而呵斥不應(yīng)有的蛋白質(zhì)沉淀。鹽析后要在冰浴中放置一段時間，待沉淀完全后再離心與過濾。在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分別，高濃度硫酸銨常用過濾方法，由于高濃度硫酸銨密度太大，要使蛋白質(zhì)完全沉降下來需求較高的離心速度和較長的離心時間。 有機溶劑沉淀： 多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分別純化。 選擇性沉淀熱變性沉淀和酸堿變性沉淀： 多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。 等電點沉淀： 用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀，但此法單獨運用較少，多與其他方法結(jié)合運用。 有機聚合物沉淀： 是開展較快的一種新方法， 主要運用PEG聚乙二醇Polyethyene glycol

15、作為沉淀劑。 未得到充分的證明解釋主要有：以為沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生共沉淀作用。由于聚合物有較強的親水性，使生物大分子脫水而發(fā)生沉淀。聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用構(gòu)成復(fù)合物，在重力作用下構(gòu)成沉淀析出。經(jīng)過空間位置排斥，使液體中生物大分子被迫擠聚在一同而發(fā)生沉淀。 本方法的優(yōu)點是：操作條件溫暖，不易引起生物大分子變性。沉淀效能高，運用很少量的PEG即可以沉淀相當多的生物大分子。沉淀后有機聚合物容易去除。2. 分別純化方法的選擇 生物大分子能否高效率地制備勝利，關(guān)鍵在于分別純化方案的正確選擇和各個分別純化方法實驗條件的探求。選擇與探求的根據(jù)就是生物大分子與雜質(zhì)之間的生物學和物理化

16、學性質(zhì)上的差別。 制備生物大分子的方法可以粗略地分類如下： 以分子大小和形狀的差別為根據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾等。 以溶解度的差別為根據(jù)的方法：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結(jié)晶等。 以電荷差別為根據(jù)的方法：電泳、電滲析、等電點沉淀、吸附層析和離子交換層析等。 以生物學功能專注性為根據(jù)的方法：親和層析等。 從動物胰臟中提取胰蛋白酶時，普通是用稀酸溶液將胰腺細胞中含有的酶原提取出來，然后再根據(jù)等電點沉淀的原理，調(diào)理pH以沉淀除去大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級鹽析將胰蛋白酶原等包括大量糜蛋白酶原和彈性蛋白酶原沉淀析出。經(jīng)溶解后，以極少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌该拥鞍酌负蛷椥缘鞍酌竿瑫r也被激活，被激活的酶溶液再以鹽析分級的方法除去糜蛋白酶及彈性蛋白酶等組分。搜集含胰蛋白酶的級分，并用結(jié)晶法進一步分別純化。普通經(jīng)過23次結(jié)晶后，可獲得相當純的胰蛋白酶，其比活力可到達800010000BAEE單位/毫克蛋白，或更高。胰蛋白酶制備根本原理一、試劑pH2.5乙酸酸化水；硫酸銨。 二、資料新穎或冰凍動物胰臟 豬胰蛋白酶原的提取 1.稱取適量動物胰