人和大鼠膀胱平滑肌細胞自噬的鑒定

1、 人和大鼠膀胱平滑肌細胞自噬的鑒定趙江1 , 董興有2, 楊星亮2, 王亮2, 李龍坤2, 周占松1，宋波1*（400038 重慶， 第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院全軍泌尿外科研究所1；400037，重慶，第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院泌尿外科2）通信作者：宋波，Email: songb-mr目的：探討人和大鼠膀胱平滑肌細胞是否存在自噬，為下一步研究自噬在膀胱疾病中的作用奠定基礎。方法：透射電鏡（TEM）用于人和大鼠膀胱平滑肌細胞自噬小體鑒定。免疫熒光雙標用于人和大鼠微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)和平滑肌肌動蛋白（-SMAC）共定位。Western bolt 和RT-PCR用于人和大鼠膀胱肌層組織LC3蛋白和mR

2、NA表達檢測。結果：TEM證實人和大鼠膀胱平滑肌細胞存在自噬小體。免疫熒光雙標、Western bolt 和RT-PCR證實人和大鼠膀胱平滑肌細胞存在自噬標記蛋白LC3的表達。結論：人和大鼠膀胱平滑肌細胞存在自噬，這種低水平自噬可能在維持膀胱平滑肌細胞自身穩(wěn)態(tài)中起到重要作用。關鍵詞自噬；膀胱平滑肌；膀胱 Identification of autophagy in human and rat bladder smooth muscle cellsZhao Jiang1, Dong Xingyou2，Yang Xingliang2,Wang Liang2 ,LI longkun2,Zhou Zh

3、ansong1，Song Bo1*. （1Urinary Surgery Research Institute,Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China）（2Department of Urinary Surgery， Xin Qiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037, China）Corresponding author: Song Bo，Email: songb-mrobjecti

4、ve：To Investigate whether the human and rat bladder smooth muscle cell existence of autophagy for further study its role in bladder disease foundation. Method：Transmission electron microscopy (TEM) were used for identification of autophagosome in human and rat bladder smooth muscle cells. Co-locatio

5、n of human and rat microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) and -smooth muscle actin(-SMA) was detected with double-labeled immunofluorescent. the expression of LC3 protein and mRNA in human and rat bladder muscle layer were detected by Western bolt and RT-PCR. Results：TEM observation hu

6、man and rat bladder smooth muscle cells exist in autophagosome. double-labeled immunofluorescent，Western bolt and RT-PCR confirmed the autophagy marker protein LC3 expression in human and rat bladder smooth muscle cell. Conclusion：the presence of autophagy in human and rat bladder smooth muscle cell

7、s ，the low level of autophagy may play an important role in maintain homeostasis of bladder smooth muscle cells. 【Key words】Autophagy；Bladder smooth muscle；Bladder 在真核生物細胞中，自噬是一個高度保守的蛋白降解途徑，其通過隔離損傷以及衰老的細胞器和蛋白并交給溶酶體溶解，從而精細的地調控這著細胞的生理功能，扮演這細胞管家角色1-2?；A水平的自噬是維持細胞穩(wěn)態(tài)的一種重要機制3。當細胞面對不同應激（如：饑餓，感染、內質網應激、線粒體損傷

8、等）時，自噬將提供細胞多樣化功能以應對外界環(huán)境的應激1。此時，自噬演變?yōu)橐环N重要的細胞保護機制，這種保護機制提供了細胞面對嚴峻環(huán)境改變時的適應能力。目前大量研究提示，自噬相關蛋白和通路的改變參與了機體多種器官和組織的炎癥、衰老、代謝以及感染等疾病的病理生理過程1，4，5，在這些疾病中，自噬扮演的保護功能受到了阻止或者敲低建議改為：被降低或阻止。這提示自噬的紊亂與疾病的發(fā)生存在較為密切的關系。膀胱平滑肌作為膀胱的重要組成成分，其生理性的舒張和收縮在維持膀胱尿液存儲和排空中占有重要的地位。其結構和功能改變不但影響了膀胱的正常的尿液存儲和排空功能，而且還是多種膀胱疾病如：膀胱出口梗阻、糖尿病膀胱、老

9、年膀胱等發(fā)病機理的重要原因6-8。自噬作為維持細胞穩(wěn)態(tài)和細胞保護的重要機制，其在膀胱平滑肌中是否存在以及其作用尚未見到報道。事實上，平滑肌自噬在氣道、血管以及陰莖上已被證實，并且自噬在其中扮演發(fā)揮者著重要的保護作用9-11,可見自噬在平滑肌功能的維持中占有重要的地位。因此，本研究在此，我們主要探討膀胱平滑肌是否存在自噬，為下一步研究其在膀胱疾病中的作用奠定基礎。材料與方法1.1實驗對象 SD大鼠8只，2-3月齡，體重200-230g，購自于第三軍醫(yī)大學大坪動物室。膀胱腫瘤患者（N=4）全切膀胱來自于西南醫(yī)院泌尿外科。本研究經第三軍大學倫理委員會批準通過，所有患者均簽署書面知情同意書。1.1 W

10、estern blot檢測人和大鼠膀胱肌層LC3B蛋白表達 SD大鼠4只，過量戊巴比妥麻醉處死，迅速取出膀胱并沿縱軸切開一分為二，右半部分膀胱在解剖顯微鏡下迅速去除粘膜用于LC3蛋白表達檢測，另一半用于后續(xù)試驗。癌旁2cm的2cm以外還是以內？膀胱（N=4）組織約50mg迅速在解剖顯微鏡下去除粘膜用于LC3蛋白表達檢測。Western blot具體方法和步驟同前我們先前報道12?？贵w濃度為小鼠單克隆抗體-actin（1：1000,SantaCruz公司）,兔多克隆抗體LC3B(1：600,Sigma公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1:4000，北京中杉公司），辣根過氧化物酶標記的山羊

11、抗鼠二抗（1:1000，北京中杉公司）。1.2 TEM觀察自噬小體結構 人和大鼠膀胱肌條(n=4) 4mm8mm，迅速放入電鏡固定液（1%多聚甲醛,2.5%戊二醛)中固定，梯度酒精脫水，環(huán)氧化樹脂包埋。隨后，各肌條被切為50nm超薄切片并用醋酸鉛鈾酰檸檬酸染色。制作好的標本在Philips CM10(Philips CM10; Eindhoven, Netherlands)透射電鏡下觀察自噬小體的結構。1.3 LC3和-SMA免疫熒光雙標人和大鼠新鮮膀胱肌條(n=4) 約5mmX10mm用于冰凍切片制作。制作好的冰凍切片標本（5m）經多聚甲醛常溫下固定15min，PBS清洗三次。切片經0.3%

12、 TritonX-100打孔5min，PBS清洗三次，1% BSA常溫下封閉2h。接著鼠單克隆抗體-SMCA（1:100，SantaCruz公司）和兔多克隆抗體LC3B(1：300，sigma公司) 4過夜孵育。隨后，切片PBS清洗三次，F(xiàn)ITC標記山羊抗鼠（1:100，武漢博士德公司）和羅丹明標記驢抗兔（1:300，Invitrogen公司）常溫下孵育2h。切片PBS清洗三次，DAPI常溫下孵育5min。PBS清洗三次，甘油封片。制作好的標本在萊卡激光顯微鏡下觀察。陰性對照為不含一抗建議詳細一點。1.4 RT-PCR檢測人和大鼠膀胱肌層LC3 mRNA表達SD大鼠4只，過量戊巴比妥麻醉處死，

13、迅速取出膀胱并沿縱軸切開，膀胱在解剖顯微鏡下迅速去除粘膜（四例膀胱癌旁2cm組織約150mg在解剖顯微鏡下迅速去除粘膜）后各取100mg組織，用Tirzol總RNA提取液（碧云天，中國）提取總RNA，通過逆轉錄試劑盒（Takara，日本）將RNA逆轉為cDNA后，用PCR試劑盒（康為世紀，中國）配置如下20L體系：10L的 PCR Mix ， 2L的cDNA，上/下引物各1L，6L的無RNase水。擴增程序為：2min，94預變性，94變性30sec，大鼠LC3、大鼠GADPH、人LC3和人GADPH退火分別為58、59、56和58，30sec，72延伸30sec，終延伸725min。反應結束

14、后，取LC3及GAPDH擴增產物各5l分別與6Loading Buffer1l混合, 2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。擴增的引物如下：LC3(大鼠,321bp)：5-GAGGAGACACACAAGGGAAGTG-3(forward), 5-CCATTCACCAGGAGGAAGAAG -3(reverse)。LC3(人，374bp)：5-GTAAACGGGCTGTGTGAGAAA -3(forward), 5-AAGGCAGAAGGGAGTGTGTCT -3(reverse)。GAPDH(大鼠，434bp)：5-TCCGCCCCTTCCGCTGATGC -3(forward), 5-GCCGCCTGCT

15、TCACCACCTTCT -3 (reverse)。GAPDH(人，239bp)：5-AGGAGCGAGATCCCTCCAAA -3(forward), 5-TAAGCAGTTGGTGGTGCAGG -3 (reverse)。結果人和大鼠膀胱平滑肌細胞內存在自噬小體TEM結果(圖一1)證實人和大鼠膀胱平滑肌細胞存在自噬小體，電鏡下平滑肌細胞自噬小體為雙層膜結構，中間包裹一些胞質貨物描述欠妥。 圖一1 TEM顯示大鼠和人膀胱平滑肌細胞自噬小體人和大鼠膀胱平滑肌細胞存在自噬標記蛋白LC3LC3和-SMA免疫熒光雙標證實（圖二2）人和大鼠膀胱平滑肌細胞存在自噬標記蛋白LC3表達，有右圖可知顯示自噬標

16、記蛋白呈現(xiàn)為斑點狀和顆粒狀，表達量相對較少。圖二2免疫熒光雙標檢測 人和大鼠膀胱平滑肌細胞LC3和-SMA表達免疫熒光雙標（綠色為-SMA，紅色為LC3，為藍色為細胞核DAPI）人和大鼠膀胱肌層LC3蛋白表達情況 Western boltWB結果(圖三3)證實顯示人和大鼠膀胱肌層存在自噬標記蛋白LC3的表達建議對表達情況進行適當描述。 圖三3 人和大鼠膀胱肌層LC3蛋白表達人和大鼠膀胱肌層LC3mRNA表達情況RT-PCR結果(圖三4？)證實人和大鼠膀胱肌層存在LC3 mRNA的表達。 圖四4 人和大鼠膀胱肌層LC3mRANA表達討論 電鏡、LC3免疫熒光以及western blot是可靠并被

17、廣泛運用的自噬檢測和評價的方法13-14。在我們的試驗中，運用電鏡我們清晰的地觀察到人和大鼠膀胱逼尿肌細胞存在自噬小體。隨后，免疫熒光雙標證實了人和大鼠膀胱平滑肌細胞上存在自噬標記蛋白LC3表達。此外，人和大鼠膀胱肌層LC3蛋白和基因的表達同樣被我們證實。綜合電鏡、免疫熒光、western blot和RT-PCR的結果,我們證實人和大鼠膀胱平滑肌細胞存在自噬。此外，我們發(fā)現(xiàn)正常人和大鼠膀胱平滑肌細胞自噬水平較低，這種低水平自噬可能在維持膀胱平滑肌穩(wěn)態(tài)中具有重要的作用。無論是在我國還是國外，女性和男性患者均顯示老年與下尿路癥狀(LUTS)在女性和男性病人中呈高度相關15-17。然而，老年如何引起

18、LUTS目前尚未闡明，但是，大量的臨床資料和基礎實驗提示老年相關的盆底血管紊亂在LUTS中扮演者較為重要角色17。在經直腸彩色超聲檢查中，與正常年輕人相比，老年LUTS病人膀胱血供顯著減少18。在盆底動脈功能障礙和膀胱出口梗阻動物模型研究中，研究者同樣發(fā)現(xiàn)動物膀胱存在供血不足的情況17。這提示膀胱慢性缺血缺氧可能是LUTS的一個重要發(fā)病機理。進一步研究中發(fā)現(xiàn)，無論是在活體還是在細胞水平上慢性膀胱缺血缺氧導致逼尿肌細胞線粒體以及內質網腫脹、變形，細胞膜結構損傷等改變，這些變化最終導致平滑肌細胞氧化應激的發(fā)生17。氧化應激發(fā)生將引起一些系列下游的瀑布效應，其中包括蛋白氧化、細胞膜破壞、細胞凋亡信號

19、誘導等，這些因素最終引起膀胱平滑肌細胞收縮功能損傷和細胞數(shù)量減低以及纖維化的發(fā)生17。膀胱的慢性缺血導致膀胱逼尿肌結構和功能的改變，從而影響膀胱正常的尿液存儲和排空，進而導致尿急、尿頻、尿不盡、尿等待等LUTS癥狀產生。改善膀胱血供是干預老年LUTS的途徑之一，但控制和調節(jié)膀胱平滑肌細胞氧化應激損傷可能也是干預老年LUTS的重要方式。目前，自噬作為調控氧化應激的一種重要方式得到了廣泛的研究。研究提示當細胞線粒體遭到損傷，損傷的線粒體將產生較多的活性氧族（ROS ）和活性氮族(RNS )以及損傷其它細胞器，作為自噬激活因素 ，ROS、RNS以及損傷的細胞器將激活自噬，激活的自噬將通過清除損傷的線

20、粒體、細胞器和蛋白等發(fā)揮抗氧化應激保護細胞的作用19-20。據此，我們可推測在老年相關的LUTS中，膀胱平滑肌細胞氧化應激將激活自噬，激活的自噬可能在其中發(fā)揮這重要的保護作用。然而，事實上自噬與老年疾病的發(fā)生存在較為密切的關系，老年時氧化應激增加但自噬的水平卻有不同程度的降低，這導致了氧化應激的損傷持續(xù)從而加速了老年化的進程21。因此，在老年相關的LUTS中，膀胱平滑肌細胞的自噬激活可能是不充分或者是低下的，這導致了平滑肌細胞的持續(xù)損傷，最終導致LUTS癥狀隨在這此年紀年齡段增加而增多。我們下一步也將闡述自噬在老年相關的LUTS中具體變化以及干預自噬是否能改善膀胱功能。在未來的10到15年里，

21、中國作為老年化人口的大國，老年相關疾病將成為我國醫(yī)療負擔的重要組成成分和研究的重心。老年相關的LUTS也將成為泌尿科醫(yī)生面臨的棘手問題，因此闡述自噬在老年相關的LUTS中的作用和地位可能對我們處理和對待LUTS提供新思路。引用文獻1.Levine B, Mizushima N, Virgin HW. Autophagy in immunity and inflammationJ. Nature，2011, 469(7330):323-335.2.Komatsu M, Waguri S, Koike M, et al. Homeostatic levels of p62 control cyto

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23、 enhances endotoxin-induced IL-1beta productionJ.Nature，2008, 456(7219):264-268.5.Salminen A, Kaarniranta K, Kauppinen A. Beclin 1 interactome controls the crosstalk between apoptosis, autophagy and inflammasome activation: Impact on the aging processJ. Ageing Research Reviews, 2013, 12(2):520-534.6

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