常用標(biāo)記免疫酶及其底物

1、常用標(biāo)記免疫酶及其底物 1標(biāo)記酶的選擇條件 活性高，分解底物的能力強(qiáng)。 特異性強(qiáng)，即作用于底物的專一性強(qiáng)。 與抗原抗體結(jié)合后仍保持酶的活性。 與底物作用可以顯色。 純度高、易純化，即含雜蛋白少。 可溶性(水溶性)好，在溶液中穩(wěn)定。 測定方法簡單。 酶來源方便、價(jià)格低廉。2符合條件的酶 辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP)，分子量40 000。 堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase AKP），分子量82 000。 -半乳糖甙酶（-galactosidase），分子量540 000。 葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）,分子量186 0

2、00。其中以HRP最為常用，因其具有活力高、穩(wěn)定、分子量小、易提純等優(yōu)點(diǎn)。3辣根過氧化物酶 HRP廣泛地分布于植物界，以辣根中含量最高。它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉輔基組成的一種糖蛋白，含糖量18%，它由300個氨基酸和4個二硫鍵連接而成。分子量40 000，等電點(diǎn)5.59.0之間，它催化的最適pH因供氫體不同而有所差異，但多在pH5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。HRP酶蛋白和其它雜蛋白的最大吸收光譜為275nm，輔基部分的最大吸收光譜為403nm，二者比值OD403/OD275為酶的純度。以RZ值(Reinheit Zabl德文)表示。RZ3為高質(zhì)量，RZ2.5為

3、中等質(zhì)量，RZ2.5則需要純化。RZ值越小，表示雜蛋白越多,如RZ為0.6，則表示有75%的雜蛋白。衡量酶質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)有兩條，一個是純度即RZ值，一個是活力。只用酶的純度表示是不全面的。目前國際上規(guī)定,酶的活力以國際單位表示。一個酶單位是在一定的條件下(pH、溫度和底物濃度)一分鐘能降解1mMol/L底物的酶活力。1mg酶所含有酶的單位數(shù)稱為比活性。用比活性進(jìn)行酶的比較。用作標(biāo)記的過氧化物酶活性一般要大于250units/mg。4HRP的作用底物與供氫體 底物為H2O2，催化時(shí)需供氫體。 組化法常用的供氫體是3，3二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(3.3diaminobenzidine . DAB)。其反應(yīng)物

4、由于形成的氧化型中間體迅速聚合，形成不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用于光學(xué)顯微鏡觀察。這種多聚物能還原和螯合四氧化鋨(OSO4)形成具有電子密度的產(chǎn)物，可適用于電子顯微鏡觀察。 用于ELISA的供氫體有下列數(shù)種。表 ELISA的供氫體供 氫 體反應(yīng)顏色波長終止劑終止顏色測定波長聯(lián)大茴香胺(OD)桔紅5125Mol/L HCI黃400鄰苯二胺(OPD)黃4442Mol/L H2SO4桔黃492鄰苯甲苯胺(OT)蘭6362Mol/L H2SO4黃4425氨基水楊酸褐4751Mol/L NaOH褐449以O(shè)D和OPD最為常用。OPD有致癌作用，使用時(shí)需注意。5堿性磷酸酶 可從小牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。

5、它是一種磷酸脂酶,其作用是催化磷酸脂水解釋放出無機(jī)磷酸而顯色?；蛘咄ㄟ^水解產(chǎn)生的磷酸與鉬酸反應(yīng)生成磷鉬酸，然后在還原劑作用下生成藍(lán)色的產(chǎn)物進(jìn)行測定。1標(biāo)記酶的選擇條件 活性高，分解底物的能力強(qiáng)。 特異性強(qiáng)，即作用于底物的專一性強(qiáng)。 與抗原抗體結(jié)合后仍保持酶的活性。 與底物作用可以顯色。 純度高、易純化，即含雜蛋白少。 可溶性(水溶性)好，在溶液中穩(wěn)定。 測定方法簡單。 酶來源方便、價(jià)格低廉。2符合條件的酶 辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP)，分子量40 000。 堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase AKP），分子量82 000。 -半乳糖甙

6、酶（-galactosidase），分子量540 000。 葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）,分子量186 000。其中以HRP最為常用，因其具有活力高、穩(wěn)定、分子量小、易提純等優(yōu)點(diǎn)。3辣根過氧化物酶 HRP廣泛地分布于植物界，以辣根中含量最高。它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉輔基組成的一種糖蛋白，含糖量18%，它由300個氨基酸和4個二硫鍵連接而成。分子量40 000，等電點(diǎn)5.59.0之間，它催化的最適pH因供氫體不同而有所差異，但多在pH5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。HRP酶蛋白和其它雜蛋白的最大吸收光譜為275nm，輔基部分的最大吸收光譜為403

7、nm，二者比值OD403/OD275為酶的純度。以RZ值(Reinheit Zabl德文)表示。RZ3為高質(zhì)量，RZ2.5為中等質(zhì)量，RZ2.5則需要純化。RZ值越小，表示雜蛋白越多,如RZ為0.6，則表示有75%的雜蛋白。衡量酶質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)有兩條，一個是純度即RZ值，一個是活力。只用酶的純度表示是不全面的。目前國際上規(guī)定,酶的活力以國際單位表示。一個酶單位是在一定的條件下(pH、溫度和底物濃度)一分鐘能降解1mMol/L底物的酶活力。1mg酶所含有酶的單位數(shù)稱為比活性。用比活性進(jìn)行酶的比較。用作標(biāo)記的過氧化物酶活性一般要大于250units/mg。4HRP的作用底物與供氫體 底物為H2O2，催

8、化時(shí)需供氫體。 組化法常用的供氫體是3，3二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(3.3diaminobenzidine . DAB)。其反應(yīng)物由于形成的氧化型中間體迅速聚合，形成不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用于光學(xué)顯微鏡觀察。這種多聚物能還原和螯合四氧化鋨(OSO4)形成具有電子密度的產(chǎn)物，可適用于電子顯微鏡觀察。 用于ELISA的供氫體有下列數(shù)種。表 ELISA的供氫體供 氫 體反應(yīng)顏色波長終止劑終止顏色測定波長聯(lián)大茴香胺(OD)桔紅5125Mol/L HCI黃400鄰苯二胺(OPD)黃4442Mol/L H2SO4桔黃492鄰苯甲苯胺(OT)蘭6362Mol/L H2SO4黃4425氨基水楊酸褐4751Mol/L NaOH褐44