丙烯酰胺的代謝機(jī)理及體內(nèi)防護(hù)的研究進(jìn)展(共7頁)

1、環(huán)氧丙酰胺的代謝(dixi)機(jī)理(j l)及體內(nèi)(t ni)防護(hù)的研究進(jìn)展摘 要：丙烯酰胺，是一種潛在的致癌物，自被研究者在高溫焙烤食品中發(fā)現(xiàn)后，即引起了國內(nèi)外廣泛的重視。而研究進(jìn)一步表明，其對(duì)人體的危害主要是由其代謝產(chǎn)物環(huán)氧丙酰胺造成的。因此近年來，科學(xué)家開始對(duì)環(huán)氧丙酰胺的毒性進(jìn)行評(píng)估，并完善了檢測(cè)方法，對(duì)環(huán)氧丙酰胺的體內(nèi)防護(hù)也展開了探索。本文綜合了近年來對(duì)環(huán)氧丙酰胺的研究成果，總結(jié)了環(huán)氧丙酰胺的代謝機(jī)理以及分析測(cè)定方法；并結(jié)合已有的成果，對(duì)抑制環(huán)氧丙酰胺體內(nèi)毒性提出了展望。關(guān)鍵詞：丙烯酰胺；環(huán)氧丙酰胺；形成機(jī)理；分析方法；體內(nèi)防護(hù)Abstract：Acrylamide (AA)，a pot

2、ential carcinogen，received a world-wide attention, since was found in food after high temperature treatment.The further studies indicated that the harm of acrylamide to human body was mainly performed by its metabolitesglycidamide (GA).In recent years, researchers began to assess the toxicity of GA,

3、 improve the detection methods and initiate searching for the way of protection from GA in vivo.In this article, the achievement on mechanism and analysis methods of GA are sumarized.Suggestions on inhibition of GA in vivo toxicity are also proposed, according to the existing knowledge.Keywords: Acy

4、lamide; Glycidamide; Mechanism; Analysis method; Protection in vivo早在1994年，國際癌癥研究署（IARC）就將丙烯酰胺定為準(zhǔn)致癌物，提醒人們關(guān)注。隨著丙烯酰胺被發(fā)現(xiàn)存在于高溫焙烤食品當(dāng)中后，國際糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）聯(lián)合食品添加劑專家委員會(huì)(JECFA)第64次會(huì)議，對(duì)食品中的丙烯酰胺進(jìn)行了系統(tǒng)的危險(xiǎn)性評(píng)估。人們逐漸認(rèn)識(shí)到丙烯酰胺所具有遺傳毒性、準(zhǔn)致癌性等幾乎都與其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物環(huán)氧丙酰胺有關(guān) 13。丙烯酰胺進(jìn)入生物體后，其中10%左右在線粒體細(xì)胞色素P450中的氧化酶作用下，轉(zhuǎn)變成為環(huán)氧丙酰胺46。環(huán)

5、氧丙酰胺是一種具有較強(qiáng)遺傳毒性的物質(zhì)，能夠攻擊DNA分子，破壞遺傳物質(zhì)7；而且對(duì)遺傳物質(zhì)的破壞作用有明顯的富集性8。此外,環(huán)氧丙酰胺還被證實(shí)，能夠造成生物體精子細(xì)胞的遺傳突變，增加了其它疾病的發(fā)病幾率9。目前，人們更加關(guān)注丙烯酰胺的產(chǎn)生階段，并在利用天然產(chǎn)物抑制生成丙烯酰胺的美拉德反應(yīng)方面取得了長足的進(jìn)展10。近年來，已有不少研究者開始著手利用天然產(chǎn)物抑制丙烯酰胺及其代謝物環(huán)氧丙酰胺在體內(nèi)的毒性，作為防護(hù)丙烯酰胺危害的第二道防線。因此，總結(jié)相關(guān)的體內(nèi)代謝研究和毒性防護(hù)方面的成果，將為人類抵御丙烯酰胺的威脅提供新的思路。丙烯酰胺在體內(nèi)的代謝途徑圖 1: 丙烯酰胺體內(nèi)代謝(dixi)途徑AAMA：

6、(N-acetyl-S-(2-carbamoylethyl)cysteine GAMA：N-acetyl-S-(2-hydroxy-2-carbamoylethyl) cysteine 異GAMA：N-acetyl-S-(1-carbamoyl-2-hydroxyethyl) cysteineAA-Hb：N-(2-carbamoylethyl)valine GA-Hb：N-(2-carbamoy-2-hydroxyethyl) valine 如圖1，丙烯酰胺通過(tnggu)飲食、皮膚或者吸煙1113進(jìn)入(jnr)體內(nèi)后，有兩條主要的代謝途徑：1、在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的作用下，與谷胱甘肽結(jié)合

7、生成硫醇尿酸化合物（AAMA）；2、在細(xì)胞色素P450當(dāng)中的CPY2E1單氧合酶催化下，生成環(huán)氧丙酰胺14,15。所生成的環(huán)氧丙酰胺同樣可以與谷胱甘肽結(jié)合生成兩種硫醇尿酸化合物（GAMA和異GAMA）。除了谷胱甘肽外，人體對(duì)于環(huán)氧丙酰胺具有另一種解毒的途徑：在環(huán)氧化物水解酶的作用下，一部分環(huán)氧丙酰胺可以被轉(zhuǎn)化成Glyceramide（無毒）16,17。上述的AAMA，GAMA，異GAMA， Glyceramide甚至一小部分游離的丙烯酰胺都可以通過尿液排除體外。其中，AAMA的量為GAMA的10倍左右，而異GAMA含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于GAMA4,14,18。這些硫醇尿酸化合物在體內(nèi)的存留時(shí)間很短，一般

8、48小時(shí)后，幾乎完全排出體外4。由于AAMA是尿液中主要結(jié)合物，很多研究中，都選擇AAMA作為評(píng)價(jià)人體暴露于丙烯酰胺的生物學(xué)標(biāo)記。此外，丙烯酰胺和環(huán)氧丙酰胺還會(huì)與血紅蛋白的氨基末端纈氨酸結(jié)合，生成化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的化合物：AA-Hb和GA-Hb19。這個(gè)過程是對(duì)肌體的毒害作用，而且與血紅蛋白的結(jié)合物在血液中的殘留時(shí)間很長，通常超過一周。 丙烯酰胺毒性的體內(nèi)評(píng)價(jià)方法動(dòng)物模型的選取在對(duì)丙烯酰胺毒性的評(píng)價(jià)方面，選取合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是結(jié)果是否合理的關(guān)鍵。一般通過比較GAMA/AAMA的值，來評(píng)價(jià)一個(gè)物種對(duì)丙烯酰胺的體內(nèi)轉(zhuǎn)化活性。研究表明，大鼠的比值為0.2，小鼠為0.55，而人類為0.1左右4。這說明小鼠的

9、CPY2E1酶的活性要遠(yuǎn)大于大鼠和人。所以選取大鼠進(jìn)行體內(nèi)評(píng)價(jià)更接近人類。另一方面，對(duì)比了血液中GA-Hb/AA-Hb值后，發(fā)現(xiàn)(fxin)豬等大型哺乳動(dòng)物相對(duì)于嚙齒類動(dòng)物來說，更接近人類20。但鑒于實(shí)驗(yàn)成本和動(dòng)物數(shù)量(shling)的考慮，研究者一般傾向于使用大鼠模型。樣品(yngpn)預(yù)處理和測(cè)定方法早期評(píng)價(jià)丙烯酰胺暴露量的指標(biāo)主要是血液中的AA-Hb和GA-Hb，采用GC，GC/MS，LC/MS來檢測(cè)居多；近幾年，尿液中AAMA和GAMA的含量也成為了一個(gè)重要的指標(biāo)，基本都采用LC/MS和LC/MS/MS。因此，分析方法主要為血液檢測(cè)和尿液檢測(cè)兩方面。 血液的預(yù)處理方法相對(duì)比較復(fù)雜，一般

10、將采集來的血樣在3000 rpm的轉(zhuǎn)速下，離心得到紅細(xì)胞，并在0.9%的NaCl溶液沖洗2次后，用蒸餾水將血細(xì)胞溶解。溶解的血細(xì)胞在-80靜置過夜，然后通過離心將細(xì)胞碎片去除。上述溶血產(chǎn)物在異丙醇中與鹽酸作用后，離心去除雜質(zhì)。再向懸浮液中加入乙酸乙酯，低溫靜置2小時(shí)后再次離心，得到的沉淀就是珠蛋白。經(jīng)乙酸乙酯和n-己烷的沖洗后，珠蛋白在氮?dú)庀麓蹈?。血液中的丙烯酰胺和環(huán)氧丙酰胺就結(jié)合在血紅蛋白上。接下來是衍生化過程，環(huán)氧丙酰胺和丙烯酰胺與血紅蛋白的結(jié)合物在堿性條件下，與異硫氰酸苯酯發(fā)生艾德曼反應(yīng)，產(chǎn)生一種乙內(nèi)酰苯硫脲衍生物2124。再用乙醚萃取并氮?dú)獯蹈?，?jīng)固相萃取柱凈化后，方可利用LC/MS/

11、MS檢測(cè)19,20。AA-Hb和GA-Hb的檢測(cè)限最低分別可達(dá)0.7pmol/g珠蛋白，1.3 pmol/g珠蛋白22。 尿樣的處理方法要簡單很多。只需將尿樣注入HLB固相萃取柱（用2ml甲醇, 2ml蒸餾水和1ml 0.1%甲酸溶液活化），用1.4ml的0.1%甲酸溶液洗滌，再用21.5 ml 的混合液(蒸餾水：甲醇：甲酸溶液，59 : 40 : 1, v/v)洗脫25。隨后利用LC/MS/MS進(jìn)行檢測(cè)。AAMA和GAMA的檢測(cè)限分別可達(dá)0.8 ng/ml和0.5 ng/ml26。 最近，中國的研究者Qunying X.等人還引進(jìn)了一種新的測(cè)定方法：利用加速器質(zhì)譜來檢測(cè)樣品中帶放射性標(biāo)記的丙

12、烯酰胺和環(huán)氧丙酰胺的結(jié)合物27。這種方法可以便于觀察，生物體內(nèi)各結(jié)合物的微量變化及分布，但是應(yīng)用局限性較大，只能檢測(cè)放射性標(biāo)記后的物質(zhì)。毒性評(píng)價(jià) 大量實(shí)驗(yàn)證明,丙烯酰胺在體內(nèi)的毒性主要由代謝物環(huán)氧丙酰胺產(chǎn)生。對(duì)環(huán)氧丙酰胺的基因毒性和準(zhǔn)致癌性的評(píng)價(jià)是通過體外和體內(nèi)兩個(gè)體系來實(shí)現(xiàn)的。體外毒性 體外毒性主要通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)的。Dale,W. S.等在細(xì)胞有絲分裂的研究中發(fā)現(xiàn)，微管啟動(dòng)蛋白（有絲分裂所必須的）很容易受到環(huán)氧丙酰胺和丙烯酰胺的攻擊。但是對(duì)比了兩者的作用濃度后發(fā)現(xiàn)：要達(dá)到同樣的作用效果(60%的抑制率)，環(huán)氧丙酰胺（500M,）所需的濃度要低于丙烯酰胺（5 mM）28。此外，丙烯酰胺和環(huán)

13、氧丙酰胺會(huì)誘導(dǎo)染色體的畸變，還會(huì)縮短細(xì)胞周期1。 更為重要的是，從對(duì)DNA的作用上看，環(huán)氧丙酰胺會(huì)與DNA分子結(jié)合從而造成基因突變，但是丙烯酰胺卻不會(huì)直接攻擊DNA2。環(huán)氧丙酰胺的攻擊靶點(diǎn)很多：血紅蛋白，血清清蛋白，魚精蛋白和精子DNA27。它對(duì)人體的毒性顯而易見。 雖然環(huán)氧丙酰胺是有害的，但Flurina C. C.等通過體外實(shí)驗(yàn)表明，低濃度（1mM的丙烯酰胺和環(huán)氧丙酰胺培養(yǎng)液）時(shí)可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自我保護(hù)作用，并沒有明顯的毒害作用。他認(rèn)為人類在一般的飲食攝入量下，是不會(huì)產(chǎn)生癌癥信號(hào)的29。體內(nèi)(t ni)毒性 體內(nèi)毒性(d xn)主要的受試對(duì)象(duxing)為嚙齒類動(dòng)物，大型哺乳動(dòng)物（如豬

14、等），甚至也有人體的代謝實(shí)驗(yàn)。綜合大量的研究成果發(fā)現(xiàn)，攝入丙烯酰胺會(huì)增加受試大鼠和小鼠的致癌幾率30, 31。長期的致癌實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)每天的攝入量在1mg/kg以上時(shí)，致癌性才表現(xiàn)出來32。相比之下，西方國家人群攝入量每天一般在0.5g/kg左右33，職業(yè)人群暴露量每天一般在1g/kg左右，吸煙者為3g/kg左右34。光從飲食攝入，并不能定論丙烯酰胺及其代謝物是否會(huì)對(duì)人體造成威脅。流行病學(xué)的研究中，也沒有發(fā)現(xiàn)少量攝入丙烯酰胺與癌癥的發(fā)病有直接的關(guān)系。但是，也有研究者認(rèn)為這些數(shù)據(jù)很有可能是根據(jù)調(diào)查問卷來判定受試者的日常攝入量的，在估算攝入量時(shí)往往有所偏差。另外，丙烯酰胺對(duì)癌癥的誘導(dǎo)作用也許并不是通

15、過基因突變完成的，Pelle T.O.在研究中發(fā)現(xiàn)，如果扣除吸煙的影響，乳腺癌發(fā)病率與血液中的AA-Hb和GA-Hb有一定的相關(guān)性35。由于兩方的成果并不完全一致，現(xiàn)在還無法對(duì)這種食品中的準(zhǔn)致癌物，做一個(gè)準(zhǔn)確的安全性評(píng)價(jià)。毒性抑制的進(jìn)展雖然人們?cè)诟邷乇嚎具^程中，利用天然產(chǎn)物抑制丙烯酰胺產(chǎn)生方面有了較為成功的先例10，但在體內(nèi)防護(hù)方面還鮮有報(bào)道。Dirk Taubert等人發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)胞色素P450的抑制劑二烯丙基硫化物（該物質(zhì)是從大蒜中提取的）。在大鼠肝臟細(xì)胞培養(yǎng)過程中，當(dāng)濃度為100mol/L時(shí)，其對(duì)丙烯酰胺向環(huán)氧丙酰胺轉(zhuǎn)變的抑制率為50%；當(dāng)濃度為1000mol/L時(shí)，抑制率竟達(dá)到85%3

16、6！Qunying, X.等發(fā)現(xiàn)，茶多酚、白藜蘆醇、大蒜素可以有效阻止環(huán)氧丙酰胺對(duì)DNA的破壞。茶多酚可以減少其對(duì)魚精蛋白的結(jié)合，同時(shí)大蒜素可以減少對(duì)血紅蛋白的結(jié)合。兩者還能增加谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性，提高人體的解毒功能37?；钚匝醮厥腔钴S的氧自由基，對(duì)于人體細(xì)胞和遺傳物質(zhì)均有較強(qiáng)的攻擊性。而JUN C.等發(fā)現(xiàn)當(dāng)丙烯酰胺添加到DNAHepG2（人體肝細(xì)胞）細(xì)胞培養(yǎng)液中，會(huì)促進(jìn)活性氧簇的生成；但是加入姜黃達(dá)2.5g/mL時(shí)，丙烯酰胺浸泡下的肝臟細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇得到了明顯的抑制38。以上是天然產(chǎn)物對(duì)于丙烯酰胺和環(huán)氧丙酰胺毒性抑制的直接證據(jù)，另外還有很多關(guān)于天然產(chǎn)物抑制線粒體相關(guān)反應(yīng)的證據(jù)。此外

17、，大薊中提取的水飛薊素可以有效降低人肝微粒體中CPY2E1的活性39。紅茶中的茶黃素和兒茶素可降低大鼠小腸微粒體中的蛋白水平40。大豆中的金雀異黃素和牛尿酚能抑制小鼠肝微粒體中細(xì)胞色素CPY2E1對(duì)硝基苯酚的芳香基羥化作用41。以上的研究成果間接地提示我們，利用天然產(chǎn)物來抑制環(huán)氧丙酰胺的生成以及阻礙其體內(nèi)毒性是可行的。對(duì)體內(nèi)防護(hù)的展望隨著人類對(duì)丙烯酰胺認(rèn)識(shí)的加深，對(duì)丙烯酰胺防護(hù)的第一道防線食品體系中丙烯酰胺生成階段，逐漸引起人們的重視，抑制其生成的研究也取得了較大的進(jìn)展。但是，人們?cè)谌粘Ｉ钪胁豢杀苊膺€會(huì)經(jīng)常攝入丙烯酰胺，體內(nèi)的第二道防線抑制環(huán)氧丙酰胺的毒性就顯得尤為重要?，F(xiàn)階段關(guān)于體內(nèi)(t

18、ni)抑制的成果并不多，還主要停留在體外實(shí)驗(yàn)階段，今后人們定將探索出一條體內(nèi)抑制環(huán)氧丙酰胺毒性的途徑(tjng)。總結(jié)(zngji)了相關(guān)研究，我們建議今后體內(nèi)的抑制手段將通過以下途徑進(jìn)行：抑制CYP 2E1酶的活性，從源頭上減少環(huán)氧丙酰胺的生成量；提高環(huán)氧化物水解酶的活性，增加環(huán)氧丙酰胺向無毒的Glyceramide轉(zhuǎn)化；提高體內(nèi)谷胱甘肽的含量，從而增強(qiáng)人體的解毒能力，盡可能多地通過尿液將有害物質(zhì)排出體外；抑制環(huán)氧丙酰胺和丙烯酰胺對(duì)體內(nèi)靶點(diǎn)的攻擊，減少其對(duì)機(jī)體的傷害。參考文獻(xiàn)【1】Celia, M., Nuno, G. O., Marta, P., Goncxalo, G. C., Vand

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