藥物分析學：生物藥物分析概論

1、第十章 生物藥物分析概論生物藥物分析的特點（書P236）相對分子量的測定生物活性檢查安全性檢查效價測定結構確證第一節(jié) 生化藥物一、生化藥物種類例：氨基酸、多肽、蛋白質、酶等。二、鑒別方法1、化學鑒別法例：谷氨酸(Glutamic Acid)片的鑒別 取本品的細粉適量(約相當于谷氨酸5 mg)加水5ml，加熱使谷氨酸溶解，濾過，取濾液，加茚三酮約5 mg，加熱，溶液顯藍至藍紫色。2、光譜鑒別法利用藥物的光譜特性如UV或IR特征吸收而進行鑒別例：細胞色素C的鑒別 取含鐵量項下的供試品溶液1ml，置50 ml量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH=7.3)稀釋至刻度，加連二亞硫酸鈉約15 mg，搖勻，測定，在

2、520、550 nm波長處有最大吸收，在535 nm波長處有最小吸收。原理：細胞色素C是以含鐵卟啉為輔基的結合蛋白，當其結構中鐵原子為三價(Fe3+)時，它是氧化型的細胞色素C，但接受一個電子變成二價鐵(Fe2+)后，就成了還原型的細胞色素C。在磷酸鹽緩沖液(pH=7.3)中，其還原型在550、520與415nm波長處有最大吸收，而其氧化型在280、361、410與529nm波長處有最大吸收，故可采用UV進行鑒別。3、HPLC法利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時間和肽圖譜的一致性進行鑒別。例：胰島素的鑒別 采用HPLC法，固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠(5 m)，柱溫40，流動相為0.1

3、mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH=3.0)乙腈(7327)，檢測波長214 nm。取胰島素(豬或牛)對照品及供試品適量，分別加0.01mol/L鹽酸溶液制成濃度為40 U/ml的溶液，各取5 L進樣，供試品主峰的保留時間應與同種屬對照品主峰的保留時間一致。4、酶法例：尿激酶的鑒別-氣泡上升法原理：5、電泳法：以肝素鑒別為例與國家肝素標準品對照，其移動位置相應6、生物鑒別法利用生物體進行試驗來鑒別藥物例：家兔驚厥試驗鑒別胰島素利用胰島素的降糖作用，給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50%GS，驚厥停止。7、肽圖鑒別法肽圖譜分析是根據蛋白質分子量的大小以及氨基酸組成特點，使用專一性較強的蛋白

4、水解酶，一般為肽鏈內切酶，作用于特殊的肽鏈位點，將蛋白質裂解成較小的片斷，經分離檢測形成特征性指紋圖譜。三、檢查 有效成分在生物材料中濃度很低，雜質的含量相對比較高，因此，雜質檢查和安全性檢查就顯得非常重要。生化藥物應保證符合無毒、無菌、無熱源、無致敏源和降壓物質等一般安全性要求。（一）雜質檢查 一般雜質檢查：氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬等 特殊雜質檢查：原料藥純度分析生產過程中雜質的檢查 如：原料藥純度分析多糖類-低聚糖、核酸、蛋白質酶類藥物-酶催化反應基本產物的分析，具有一定活性的其他有關酶的檢查。例：糜蛋白酶中胰蛋白酶的檢查吸取供試品溶液(10 mg/ml) 50l與0.1

5、%胰蛋白酶對照品溶液5l，分別置白色點滴板上，各加對甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽試液0.2 ml，放置后，供試品溶液應不呈現紫紅色或呈色時間晚于胰蛋白酶對照品溶液(1.0)。（二）安全性試驗1、熱源與細菌內毒素試驗 ：ChP中的熱原檢查采用家兔法，細菌內毒素檢查采用鱟試劑法2、異常毒性試驗：急性毒性物質用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗動物，觀察其急性毒性反應。反應的判斷以試驗動物死亡與否為終點。3、過敏試驗：異性蛋白有可能存在異性蛋白的藥物應作過敏試驗。4、降壓物質試驗：降壓物質是指某些藥物中含有的能導致血壓降低的雜質，包括組胺、類組胺或其他導致血壓降低的物質

6、。5、無菌試驗檢查藥品及敷料是否染有活菌： 無菌檢查指示控制制品染菌狀況的一種檢測手段。要使藥品真正達到無菌，首先應嚴格 執(zhí)行GMP管理制度。四、含量測定1、含量表示方法：百分含量適用于結構明確的小分子藥物或經水解后變成小分子的藥物生物效價或酶活力單位適用于酶類、蛋白質類藥物理化分析法： 化學分析法：重量測定法、滴定分析法 電化學分析法光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法色譜分析法：HPLC法（RP-HPLC、 HPIEC 、HPGFC、灌注色譜法、HPCE法）酶法：酶活力測定法、酶分析法電泳法生物檢定法2、酶分析法以酶能專一而高效地催化某化學反應為基礎，通過對酶反應速度的測定或對生成物

7、等濃度的測定而檢測相應物質的含量。包括酶活力測定法和酶法分析兩種類型。3、酶活力測定法（1）概念：（2）酶活力評價指標 酶的活力單位（enzymatic activity unit）定義：一定條件下，單位時間內轉化一定量底物所需酶的量。酶在25以最適當的底物濃度、最適當的緩沖液離子強度以及最適當的pH等條件下，每分鐘能轉化1mol底物的酶量為一個活性單位，用IU表示。 酶的比活性（specific activity）定義：每毫克蛋白質中所含的酶單位數，用IU/（mg 蛋白質）表示錯誤的說法：每毫克酶的活力單位數在酶高度純凈，酶的分子量已知時，可采用分子活力表示（3）酶促反應的條件及影響因素：如

8、何選擇酶促反應的條件：使所有待測定的酶分子都應該能夠正常地發(fā)揮它的作用。 底物濃度影響：反應速率受到底物濃度影響 S100Km pH影響：pH影響酶的活性和反應方向 溫度影響： 直接影響化學反應速度，影響酶通常選用25，30或37 （0.1） 輔助因子影響：有些酶需要金屬離子，有些酶則需要相應的輔酶物質。為了提高酶在反應系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有時需要某些相應的物質。如對巰基酶可加入二巰基乙醇、二巰基蘇糖醇等。 空白和對照：空白是指雜質反應和自發(fā)反應引起的變化量；通過不加酶，或不加底物，或二者都加（但酶需經過失效處理）；提供未知因素的影響。對照是指用純酶或標準酶制劑測得的結果，主要用于比較或標定。（4

9、）測定方法包括物理法、化學法和酶分析法常用方法有：按取樣和檢測方式分為取樣測定和連續(xù)測定： 取樣測定酶反應開始后不同的時間，取出一定量反應液，并用適當的方法停止其反應后，對產物和底物進行定量分析，求得單位時間內酶促反應變化量的方法。加入酶變性劑加熱使酶變性 連續(xù)測定基于底物和產物在物理化學性質上的不同，在反應過程中對反應系統(tǒng)進行直接連續(xù)檢測的方法。從準確性和測定效率看，連續(xù)法都比取樣測定好。取樣測定法目前仍廣泛采用，這是因為：a. 它不需要特殊儀器；b. 幾乎所有酶反應都可根據產物或底物的化學性質找出具體測定方法c. 由于色源底物和熒光源底物的發(fā)展，可在原來的底物分子上接上相應的有色基團、發(fā)色

10、基團或熒光基團。 檢測方法：常用UV-Vis和熒光分光光度法UV-Vis分光光度法：產物和底物在某波長或波段處有明顯的特征吸收差別。如：細胞色素氧化酶的底物為細胞色素C，該物質的還原態(tài)在550nm的摩爾吸收系數為2.18104，而氧化態(tài)為0.80104，可利用這種吸收度差別來進行測定。熒光分光光度法產物和底物之一有熒光，熒光強度變化可指示反應速度。特別適于酶量或底物量極低時的快速分析。旋光度法某些酶反應過程常伴隨著旋光變化，在沒有其它更好的方法可用時，可考慮用旋光度測定法其它法酶偶聯測定、電化學測定、放射化學法等（5）計算：第二節(jié) 生物制品生物制品：是應用普通的生物技術獲得的微生物、細胞及組織

11、等生物材料制備用于人類疾病預防、治療和診斷的藥品。一、生物制品的分類1、疫苗類藥物：細菌疫苗、病毒疫苗、聯合疫苗、 2、抗毒素及抗血清類藥物：被動免疫制劑3、血液制品4、重組DNA制品：細胞因子、生長因子、酶、抗體5、診斷制品 6、其他制品二、質量控制特點生物制品的質量需要從原材料、生產過程到最終產品進行全過程控制，對原液、半成品和成品進行微生物學、化學和物理學檢定。質量突出體現在安全性和有效性。三、物理化學檢定生物制品的物理化學檢定包括鑒別、物理性狀檢查、分子量測定法、蛋白質含量測定、防腐劑含量測定、純度檢查、安全性檢查、生物制品的效力測定等1、生物制品的鑒別生鑒別方法包括理化方法和生物學方

12、法理化方法：常用的有HPLC法生物學方法：依據生物制品的生物學特點，利用免疫學等方法進行真?zhèn)蔚呐袛啵Ｓ玫挠忻庖哂≯E法、免疫斑點法、免疫雙擴散法、酶聯免疫法等例 重組人生長激素的鑒別：在相關蛋白質檢查項下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時間響應與相應的對照品(重組人生長激素或甲酰化重組人生長激素對照品)的保留時間一致；取對照品溶液和供試品溶液各10 L，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品的肽圖譜應與對照品的肽圖譜一致。例 ChP中注射用重組人促紅素(CHO細胞)、注射用重組人干擾素1b、注射用重組人干擾素2a、注射用重組人干擾素2b、注射用重組人白介素-2等33種生物制品均采用免疫印跡法鑒

13、別。該法是以供試品與特異性抗體結合后，抗體再與酶標抗體特異性結合，通過酶學反應的顯色，對供試品的抗原特異性進行檢查。2、物理性狀檢查主要包括外觀、真空度及溶解時間檢查。制品外觀異常往往會涉及制品的安全和效力，一般以澄明度來檢查外觀類型不同的制品。真空封口的凍干制品應進行真空度及溶解時間檢查，通常可用高頻火化真空測定器檢查其真空度，凡有真空度者瓶內應出現藍紫色輝光。3、分子量的測定通常采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定。多數蛋白質與陰離子表面活性劑SDS按重量比結合成復合物，使蛋白質分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白質分子的凈電荷，消除了不同蛋白質分子的電荷效應，使蛋白質按分子

14、大小分離。4、蛋白質含量測定很多生物制品的有效成分是蛋白質。類毒素、抗毒素、血液制品和基因工程產品等需要測定蛋白質含量，以檢查其有效成分，計算純度和比活性。ChP采用的測定方法有凱氏定氮法、酶試劑法(Lowry法)和雙縮脲法。凱氏定氮法：通過測定供試品的總氮含量以及經鎢酸沉淀法去除蛋白的供試品濾液中的非蛋白氮含量，計算出蛋白質的含量。一般步驟是將一定量的供試品置于凱氏燒瓶中，加硫酸、硫酸鹽及適當的催化劑，加熱消解，使有機分子破壞分解，將氮完全轉變?yōu)榱蛩徜@，加氫氧化鈉溶液堿化，將游離出的氨蒸餾出來，并由2硼酸溶液吸收，然后用硫酸滴定液進行滴定。5、純度檢查抗毒素、類毒素、血液制品和基因工程產品在

15、制造中，經過精制提純，故要求檢查純度，通常采用電泳法和高效液相色譜法檢查。四、安全性檢定生物制品的安全檢定有一般安全檢查；殺菌、滅活和脫毒情況的檢查；外源性污染物檢查和過敏性物質檢查。1、一般安全檢查包括無菌試驗、熱原試驗等。2、 疫苗和類毒素制品的菌毒種多為致病性強的微生物，如未被殺死或解毒不完全，在生物制品的使用中就會發(fā)生嚴重事故，因此需要進行活毒檢查、解毒試驗和殘余毒力試驗。3、抗毒素是采用異種蛋白為原料所制成，因此需要檢查過敏原是否符合限度要求。4、外源性污染物檢查主要有野毒檢查、支原體檢查、乙肝表面抗原和丙肝抗體檢查、外源DNA測定和殘余宿主細胞蛋白測定。宿主細胞蛋白殘留量的檢查目的：控制異源蛋白的含量以防超量后引起機體免疫反應測定法：酶聯