T∕CPMA 006-2019 空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌檢驗(yàn)方法

1、 ICS 11.100.10C 04團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/CPMA 0062019空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌檢驗(yàn)方法Identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli2019年8月16日發(fā)布2019年9月1日實(shí)施 T/CPMA 0062019目 次前1言 . III范圍. 1設(shè)備和材料. 1培養(yǎng)基和試劑. 1檢驗(yàn)程序. 2檢測(cè)步驟. 3結(jié)果報(bào)告. 7生物安全. 8234567附錄A（規(guī)范性附錄） 培養(yǎng)基和試劑的成分及制法 . 9A.1A.2A.3A.4A.5糞便標(biāo)本采集液的成分及制法. 9食品樣品漂洗液的成分及制法. 9增菌液的成

2、分及制法. 9哥倫比亞血瓊脂平板成分及制法. 10Karmali瓊脂平板成分及制法. 11II T/CPMA 0062019前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。III T/CPMA 0062019空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌檢驗(yàn)方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）、結(jié)腸彎曲菌（Campylobacter coli）的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于糞便標(biāo)本、食品和水樣品中空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌的檢驗(yàn)。2設(shè)備和材料2.1冰箱：4 8 ，-20 ，-80 ；恒溫培養(yǎng)箱：42 1 ，36 1 ；微需氧培養(yǎng)裝置：提供微需氧氣體條件（5%氧氣、10%二氧化碳和

3、 85%氮?dú)猓凰⊙b置：36 1 、100 ；離心機(jī)：離心力20000 g；天平：感量 0.1 g；2.22.32.42.52.62.7顯微鏡：10倍100倍，有相差功能；培養(yǎng)皿：直徑為 90 mm或 60 mm；pH計(jì)或 pH比色管或精密 pH試紙；振蕩器；2.82.92.102.112.122.132.142.152.16過濾裝置及濾膜（0.22 m、0.45 m）；均質(zhì)器與配套均質(zhì)袋；基因擴(kuò)增儀；DNA電泳儀；凝膠成像系統(tǒng)；彎曲菌分離培養(yǎng)試劑盒。3培養(yǎng)基和試劑3.13.23.33.43.5糞便標(biāo)本采集液：見附錄 A中 A.1。食品樣品漂洗液：見附錄 A中 A.2。增菌液：見附錄 A中

4、A.3。哥倫比亞血瓊脂平板：見附錄 A中 A.4。Karmali瓊脂平板：見附錄 A中 A.5。1 T/CPMA 00620193.63.7空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC700819。結(jié)腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC33559。4檢驗(yàn)程序空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌檢驗(yàn)程序見圖1。糞便標(biāo)本食品樣品水樣品取糞便標(biāo)本或肛拭子增菌培養(yǎng)充分漂洗食品樣品后取漂洗液增菌培養(yǎng)富集水樣品，取富集液增菌微需42124 h36 h過濾接種 Karmali或者哥倫比亞血瓊脂平板，微需氧培養(yǎng)421 24 h48 h挑取形態(tài)疑似菌落接種 Karmali或哥倫比亞血瓊脂平板421 24 h48 h革蘭氏染色氧化酶試過氧化氫酶試驗(yàn)PC

5、R核酸鑒定生化鑒定馬尿酸水解試驗(yàn)吲哚乙酸酯水解試驗(yàn)報(bào)告結(jié)果圖 1空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌檢驗(yàn)程序2 T/CPMA 00620195檢測(cè)步驟5.1標(biāo)本及樣品采集、運(yùn)輸及前期處理5.1.1腹瀉患者或者健康人糞便標(biāo)本盡量在患者使用抗生素前無菌采集新鮮糞便標(biāo)本 3 g5 g（或者黃豆至蠶豆大?。瑢?biāo)本直接置于便盒中，冷藏保存（不可冷凍），當(dāng)天送檢。糞便量小于 3 g（黃豆大?。⒈闶米踊蛘吒厥米?，可放入 Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中，冷藏運(yùn)輸，當(dāng)天送檢。便拭子或者肛拭子也可直接放入彎曲菌的增菌液中，冷藏運(yùn)輸，當(dāng)天運(yùn)送實(shí)驗(yàn)室或24 h內(nèi)進(jìn)行增菌培養(yǎng)。注：腹瀉患者標(biāo)本采集時(shí)，黏液便盡量挑取有膿血和黏液

6、部分。使用便拭子采集時(shí)，盡量將沾有標(biāo)品的棉簽部分浸入在運(yùn)輸培養(yǎng)基或者保存液的液面以下，采集標(biāo)本后應(yīng)迅速擰緊管口或者蓋口。5.1.2家禽、家畜及其泄殖腔中糞便標(biāo)本直接將標(biāo)本置于便盒中運(yùn)輸，或者無菌挑取黃豆粒大小標(biāo)本直接放入裝有 1.5 mL的無菌生理鹽水或者 PBS緩沖液中，冷藏保存及運(yùn)輸，24 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。5.1.3整禽胴體及分割肉樣品使用無菌均質(zhì)袋采集整只禽胴體，冷藏運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室，加入適量的樣品漂洗液淹沒樣品（一般每 1 kg樣品加入 500 mL樣品漂洗液），置于振蕩器上，100 r/min震蕩 15 min，反復(fù)揉搓禽胴體 5 min（注意各個(gè)部位均要揉到）。無菌操作取出禽胴體，取 2

7、 mL漂洗液進(jìn)行檢測(cè)。如果當(dāng)天不能檢測(cè)可將禽肉樣品浸潤(rùn)在漂洗液中，放置 4 冷藏過夜，24 h內(nèi)再次充分揉搓后，取 2 mL漂洗液進(jìn)行增菌培養(yǎng)。取分割肉 1塊（大于 25 g）放入無菌均質(zhì)袋中，冷藏保存運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，加入適量樣品漂洗液淹沒樣品，100 r/min震蕩 15 min,反復(fù)揉搓樣品 5 min，無菌操作取出禽肉，取 2 mL漂洗液進(jìn)行增菌培養(yǎng)。5.1.4蔬菜、水果等樣品采集一定量的蔬菜或者水果（樣品的采集量可以根據(jù)要求確定或者采集 100 g150 g），將樣品放入無菌均質(zhì)袋中，加入樣品漂洗液后充分浸潤(rùn)、漂洗（一般每 100 g150 g樣品加入 100 mL樣品漂洗液），置于振蕩

8、器上，100 r/min震蕩 15 min，取出樣品，取漂洗液進(jìn)行直接檢測(cè)或者 4 低速(1500 g1900 g)離心 10 min，富集污染病原于 2 mL增菌液中，進(jìn)行增菌培養(yǎng)。5.1.5水樣品廢水取 20 mL50 mL，地面水取 100 mL200 mL，飲用水取 1 L4 L。無菌容器采集水樣，將水樣用 0.22 m的無菌濾器過濾富集污染病原，或者將水樣 4 低速(1500 g19003 T/CPMA 0062019g)離心 10 min，富集污染病原于 2 mL增菌液中進(jìn)行增菌培養(yǎng)。5.2細(xì)菌培養(yǎng)培養(yǎng)條件5.2.1空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌皆為微需氧菌，在微需氧（5%氧氣，10%二氧

9、化碳，85%氮?dú)猓怏w環(huán)境下生長(zhǎng)最好?？漳c彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌最適宜的培養(yǎng)溫度為 42 1 。空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的增菌培養(yǎng)和過濾培養(yǎng)都可在上述微需氧的環(huán)境下，42 1 ，培養(yǎng) 24 h48 h。5.2.2糞便標(biāo)本增菌培養(yǎng)從便盒中挑取黃豆粒大小糞便標(biāo)本（水樣便 300 L500 L），加入到 2 mL4 mL的增菌液中，充分混勻后進(jìn)行增菌培養(yǎng)；將便拭子或者肛拭子直接放入 2 mL4 mL的增菌液中，充分?jǐn)D壓混勻，取出棉簽后進(jìn)行增菌培養(yǎng)；松動(dòng)增菌液的管口（目的是讓微需氧環(huán)境的氣體進(jìn)入增菌液培養(yǎng)管中），在微需氧環(huán)境下，42 1 增菌培養(yǎng) 24 h36 h。5.2.3禽肉、蔬菜、水果等樣品漂洗液增菌

10、培養(yǎng)直接取 2 mL樣品漂洗液或者樣本富集液，加入到 4 mL的增菌液中，充分混勻后進(jìn)行增菌培養(yǎng)。5.2.4水樣品富集液增菌培養(yǎng)將富集后的 0.22 m濾膜用 2 mL的無菌生理鹽水或者 PBS緩沖液反復(fù)沖洗，將沖洗液加入到 4 mL的增菌液中，充分混勻后進(jìn)行增菌培養(yǎng)；使用無菌剪刀將濾膜剪碎后直接放入4 mL增菌液中，充分混勻后進(jìn)行增菌培養(yǎng)；或者直接將富集的沉淀懸浮于 2 mL的無菌生理鹽水或者 PBS緩沖液中，充分混勻后加入到 4 mL的增菌液中，充分混勻后進(jìn)行增菌培養(yǎng)24 h36 h。5.2.5過濾培養(yǎng)取出冷藏保存的 Karmali平板和哥倫比亞血瓊脂平板，室溫平衡 40 min60 mi

11、n。無菌操作，用鑷子取一片 0.45 m的濾膜，將濾膜輕輕貼在平板的中央表面（光滑面朝上），使濾膜與培養(yǎng)基的表面充分貼合，注意不要產(chǎn)生氣泡。如有氣泡，可用鑷子彎頭背面或者無菌玻璃棒輕輕撫平?；蛘呤褂蒙逃迷噭┖袝r(shí)，按照試劑盒的說明操作，制備帶有濾膜的 Karmali和哥倫比亞血瓊脂平板。取出增菌培養(yǎng)物，擰緊管口，輕輕混勻，擰開管口，取 300 L500 L的增菌培養(yǎng)物（樣品不做增菌，直接過濾培養(yǎng)時(shí)，可直接取稀釋后的樣品 300 L500 L），分成 464 T/CPMA 0062019點(diǎn)，呈梅花樣滴加于濾膜上，注意滴加的液體不能超過濾膜的邊緣。在生物安全柜中，等待濾膜上的液體充分透過濾膜（約 4

12、5 min60 min）,迅速揭掉濾膜，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)平板，置于微需氧環(huán)境中 42 1 ，培養(yǎng) 24 h48 h（細(xì)菌培養(yǎng) 24 h后如細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢或者菌落很小，可增加培養(yǎng)時(shí)間至 48 h，72 h后仍無疑似菌落判斷為陰性）。注：不同種類標(biāo)本、樣品運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后，可采用商用的空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌培養(yǎng)檢測(cè)試劑盒（過濾法）進(jìn)行分離培養(yǎng)，培養(yǎng)步驟按照試劑盒的說明進(jìn)行。5.3菌種鑒定5.3.1菌落形態(tài)及革蘭氏染色鑒定空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌典型菌落形態(tài)一般有兩種，一種呈圓形透明，光滑，針尖狀或水滴狀，直徑 1 mm3 mm，邊緣整齊、有光澤的單個(gè)菌落；另一種呈淺灰白色，半透明，扁平或稍突起，形狀常呈不規(guī)則圓

13、盤狀，直徑 2 mm5 mm的單個(gè)菌落，培養(yǎng)時(shí)間增加，菌落直徑變大。對(duì)疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色，空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌革蘭氏染色陰性，革蘭氏染色菌體形態(tài)彎曲，有如半個(gè)括號(hào)狀，或者呈 S形、螺旋狀或海鷗展翅狀。5.3.2生化試驗(yàn)鑒定氧化酶試驗(yàn)5.3.2.1挑取 35個(gè)疑似菌落，劃線接種到 Karmali或者哥倫比亞血瓊脂平板進(jìn)行分純培養(yǎng) 24h48 h后進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定。用無菌棉簽蘸取疑似菌落，將氧化酶試劑直接滴加到棉簽的菌上，如果在 10 s內(nèi)出現(xiàn)紫紅色、紫羅蘭色或深藍(lán)色為陽性。5.3.2.2過氧化氫酶試驗(yàn)挑取 35個(gè)菌落，加到干凈玻片上的 3過氧化氫溶液中，如果在 30 s內(nèi)出現(xiàn)氣泡則判定結(jié)果

14、為陽性?？漳c彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌和海鷗彎曲菌為陽性。5.3.2.3馬尿酸鹽水解試驗(yàn)挑取單菌落純培養(yǎng)物（10 L取菌環(huán)約半環(huán)），加到盛有 0.4 mL的 1馬尿酸鈉的試管中制成菌懸液?；旌暇鶆蚝笤?361水浴中溫育 2 h或培養(yǎng)箱中溫育 4 h。沿著試管壁緩緩加入 0.2 mL茚三酮溶液，不要振蕩，在 361的水浴或培養(yǎng)箱中再溫育 10 min后判讀結(jié)果。若出現(xiàn)深紫色則為陽性；若出現(xiàn)淡紫色或沒有顏色變化則為陰性。5.3.2.4吲哚乙酸酯水解試驗(yàn)挑取多個(gè)菌落至羥基吲哚醋酸鹽紙片上，再滴加一滴滅菌蒸餾水。如果吲哚乙酸脂水解，5 T/CPMA 0062019則在 5 min10 min內(nèi)出現(xiàn)深藍(lán)色；若無

15、顏色變化則表示沒有發(fā)生水解。5.3.2.5生化試驗(yàn)結(jié)果判定根據(jù)表1中的生化反應(yīng)結(jié)果判定菌種。表 1重要食源性彎曲菌生化試驗(yàn)結(jié)果空腸彎曲菌結(jié)腸彎曲菌海鷗彎曲菌烏普薩拉彎曲菌特征（C. jejuni）（C. coli）（C. lari）（C. upsaliensis）氧化酶試驗(yàn)或微弱過氧化氫酶試驗(yàn)馬尿酸鹽水解試驗(yàn)吲哚乙酸脂水解試驗(yàn)注：表示陽性；表示陰性。注：根據(jù)生化鑒定可報(bào)告生化鑒定結(jié)果，PCR核酸檢測(cè)鑒定方法可作為第二法或者核實(shí)鑒定的方法。5.3.3核酸檢測(cè)鑒定5.3.3.1DNA模板制備無菌接種環(huán)挑取適量純培養(yǎng)細(xì)菌，在 200 L無菌純水中充分混勻，于 100金屬水浴加熱 10 min后，13

16、000 g離心 3 min，取上清液作為菌株鑒定的 DNA模板?；蛘呷∫欢康募兣囵B(yǎng)細(xì)菌，按照商品化試劑盒的操作說明，使用 DNA提取試劑盒提取純培養(yǎng)細(xì)菌 DNA，作為菌株鑒定的模板。所有提取的 DNA模板可在-20條件下保存?zhèn)溆谩?.3.3.2多重 PCR鑒定a)多重 PCR引物序列、產(chǎn)物大小及菌種判定見表 2。表 2多重 PCR鑒定的引物序列、產(chǎn)物大小及菌種判定引物名稱16S-F推薦序列（53）產(chǎn)物長(zhǎng)度（鑒定菌種）ATCTAATGGCTTAACCATTAAACGGACGGTAACTAGTTTAGTATTCTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTGGCTTTATTTGCCATTTGTTT

17、TATTAATTTGAAAATTGCTCCAACTATGTGATTTTATTATTTGTAGCAGCG857 bp（空腸彎曲菌、結(jié)腸16S-R彎曲菌）mapA-CJFmapA-CJRceuE -CCFceuE -CCR589 bp（空腸彎曲菌）462 bp（結(jié)腸彎曲菌）b)多重 PCR反應(yīng)體系（20L）的設(shè)置見表 3。多重 PCR鑒定體系需要設(shè)置陽性對(duì)照（空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC700819,結(jié)腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC33559的 DNA模板或者相6 T/CPMA 0062019應(yīng)克隆靶基因）、陰性對(duì)照(其它非彎曲菌菌株的 DNA模板）以及空白對(duì)照。表 3多重 PCR反應(yīng)體系（20L）試

18、劑成分2PCR反應(yīng)液16S-F終濃度10.4 mol/L0.4 mol/L0.2 mol/L0.2 mol/L0.2 mol/L0.2 mol/L約 50 ng16S-RmapA-CJFmapA-CJRceuE -CCFceuE -CCRDNA模板H2Oc)多重 PCR反應(yīng)程序：95預(yù)變性 5 min，95變性 1 min，55退火 1 min，72延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)后 72延伸 5 min, 4保存。d)瓊脂糖凝膠電泳：用 0.5TBE制備1.5的瓊脂糖凝膠（含 0.5 g/mL的 Goldview）。取 5 l的 PCR產(chǎn)物（可包括適量的上樣緩沖液），用 DNA分子量標(biāo)記物做參照

19、，電壓 110V，電泳 45 min50 min（根據(jù)實(shí)驗(yàn)室儀器情況確定具體電泳條件）。使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行保存和分析。e)結(jié)果判定：陰性對(duì)照未出現(xiàn)條帶，陽性對(duì)照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶條件下，如待檢菌落出現(xiàn)857 bp大小和589 bp大小的擴(kuò)增條帶，則可判定該菌落檢驗(yàn)結(jié)果為空腸彎曲菌；如待測(cè)菌落出現(xiàn) 857 bp大小和 462 bp大小的擴(kuò)增條帶，則可判定該菌落為結(jié)腸彎曲菌；如果陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶和/或陽性對(duì)照未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，本次待測(cè)菌落的檢測(cè)結(jié)果無效，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)，并排除污染因素。6結(jié)果報(bào)告根據(jù) 5.3.2.5和（或）5.3.3.2的結(jié)果，報(bào)告標(biāo)本/樣品中檢出或未檢出空

20、腸彎曲菌和（或）結(jié)腸彎曲菌。7生物安全按照我國人間傳染的病原微生物名錄空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌皆屬于三類病原微生物，生物危險(xiǎn)程度為 II級(jí)，活菌的操作以及相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可在 BSL-2實(shí)驗(yàn)室戴相應(yīng)基礎(chǔ)防護(hù)規(guī)范操作。7 T/CPMA 00620198 T/CPMA 0062019附錄 A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑的成分及制法A.1糞便標(biāo)本采集液的成分及制法酪蛋白酶解物動(dòng)物組織酶解物葡萄糖10.0 g10.0 g1.0 g2.0 g5.0 g0.1 g酵母浸膏氯化鈉亞硫酸氫鈉蒸餾水1000 mL將上述各成分溶解于蒸餾水中，校正pH值至 pH 7.0 0.2，加入 25%30%的甘油，充分混勻后 121滅菌 15 min，備用。A.2食品樣品漂洗液的成分及制法蛋白胨氯化鈉10.0 g5.0 g磷酸氫二鈉（Na2HPO312H2O）9.0 g磷酸二氫鉀蒸餾水1.5 g1000 mL將上述各成分溶解于蒸餾水中，校正 pH值至 pH 7.0 0.2，121滅菌 15 min，備用。A.3增菌液的成分及制法A.3.1基礎(chǔ)培養(yǎng)液成分及制法牛肉