蛋白質工程在醫(yī)學中應用及其發(fā)展前景

1、蛋白質工程在其誕生以來就在人們生活的方方面面起到了很大的作用，它的應用主要是在在醫(yī)藥，食品加工，輕工業(yè)，農牧業(yè)等方面，為社會的發(fā)展進步提供了不容忽視的力量，這將預示著蛋白質工程將在以后的社會發(fā)展中有著良好的發(fā)展前景。 隨著20世紀70年代初期DNA基因工程的誕生，蛋白質工程在它的沖擊下應運而生。1983年，美國Genex 公司K.Ulmer 在Science上發(fā)表以Protein Engineering.為題的專論，第一次提出了蛋白質工程的概念，并建立了專門的研究實體，制定了相應研究開發(fā)計劃，標志著蛋白質工程的正式誕生。在以后的二十多年里，蛋白質工程有了長足的發(fā)展且應用于醫(yī)學，農業(yè)，輕工等各個

2、領域，產生了較大的經濟效益和社會效益。 一蛋白質工程在醫(yī)藥中的的醫(yī)用 基因工程為實現蛋白質工程已經提供了基因克隆、表達、突變以至活性測定等關鍵技術，而蛋白質分子的結構分析、結構設計和預測為蛋白質工程的實施提供了必要的結構模型和結構基礎。蛋白質工程的實施實際上是一個由理論到實踐、由實踐到理論的周而復始的研究過程，對蛋白質的結構功能關系的規(guī)律性認識是一個螺旋式上升的過程。蛋白質工程不但有著廣泛的應用前景，而且在揭示蛋白質結構形成和功能表達的關系研究中也是一個不可替代的手段。 蛋白質工程在醫(yī)藥中的應用 1抗體工程的應用 抗體工程的出發(fā)點是改善抗體的特異性、親和性以及在受體細胞中的可生產性。當然也包括

3、使其特性擴展，可同時作用于不同的抗原。對于很多應用而言，只改變親和性是不夠的。在一些應用中，特別小的抗體片段是必需的；鼠抗體必須改成人抗體；再者，增加抗體分子對蛋白酶的穩(wěn)定性以及正確折疊都是重要的考慮。 下面以一個特異性結合實體瘤的單克隆鼠抗體為例。這種抗體對高度特異性腫瘤治療而言是很理想的，它可以將免疫毒素帶到瘤細胞中，從而殺死瘤細胞。由于完整的抗體分子太大，不能最大限度地擴散到瘤體中，以致不能完成治療目的。為此，必須將抗體分子變小，抗體的最小片段Fv就成了最佳候選分子。然而Fv本身不穩(wěn)定，這樣抗體運載體Fy和所攜帶的毒素可能在到達目的地之前就分開。因而，首先要使其穩(wěn)定化；然后抗體的親和性要

4、盡可能高，這是因為抗體對抗原(即瘤細胞)的結合越好，所攜帶的毒素錯誤地在身體內傳布的危險性就越小，抗體更能達到其目的地。然而，如果病人的免疫系統(tǒng)將這個鼠源抗體識別 為外源蛋白質，則幾天之后由于HAMA反應產生的人抗鼠抗體就阻斷了攜帶毒素的鼠抗體到達瘤細胞之路，使免疫治療歸于失敗。為了解決這一問題，就要對抗體進行改造。近年來，用大腸桿菌系統(tǒng)有效地表達所需要的特定功能的抗體技術取得突破，向人們提供了具有全新性質的醫(yī)用抗體片段。以上就是對鼠源抗體改造的路子。 如上所述，由于HAMA免疫反應直接從具有特異性結合活性的鼠源單抗在治療中的作用就受到限制。由于絕大多數HAMA抗體是抗鼠源抗體的恒定區(qū)，使人們

5、想到產生嵌合抗體可能解決上述問題，即將鼠單抗的恒定區(qū)換成人抗的恒定區(qū)。由于人抗體基因和鼠抗體基因都可以分別進行克隆，利用PCR技術很容易將鼠單抗可變區(qū)與人的恒定區(qū)重組到一起，所得到的嵌合抗體仍然能特異性地結合抗原，而HAMA反應被減少。由于這樣的嵌合抗體的恒定區(qū)(或恒定結構域)來源于人，因而它對于激活人免疫系統(tǒng)的某些輔助功能更有效，則可有效地激活依賴于抗體的細胞的細胞毒性(ADCC)，這就是某些像這樣的人源化抗體已經用到臨床實驗的原因。 如前所述，抗體的人源化可很明顯地減低HAMA反應，但也產生少數抗鼠可變結構域的人抗鼠抗體(HAMA抗體)。從抗體的結構圖中可以看出抗體的可變結構域可以分成為超

6、變區(qū)(即互補性決定區(qū)CDRs)和變化性較少的骨架區(qū)，而與抗原的結合是由超變區(qū)決定的。與超變區(qū)相比，這些骨架區(qū)是保守的，這些有限的骨架區(qū)的氨基酸序列由一個緊密相關的基因家族編碼。這種結構特點使人們想到，是否可以將鼠抗體的超變區(qū)嫁接到一個相關的人抗體可變結構域的骨架部位，這就是所謂的超變區(qū)嫁接的設計。按著這一種設想產生的第一個抗體，其親和性比它的前體(鼠抗體)明顯地降低。隨著對許多不同抗體的三級結構認識的擴大，CDR嫁接所得到的結果也隨之改善?，F在，幾個完全人源化抗體的親和性已與鼠抗體幾乎沒有差別，用這樣的抗體作為治療制劑也再不受HAMA反應的困擾。 這些研究也對抗體的結構功能研究有很大促進，發(fā)現

7、了在抗體可變區(qū)某些氨基酸是很重要的，某些氨基酸的配對對可變區(qū)的穩(wěn)定性和正確折蠢是不可替代的。在人源化抗體的操作中，這些氨基酸都不能改變。這些發(fā)現體現了蛋白質工程操作從理論到實踐，再由實踐到理論的過程。 總之，通過抗體的蛋白質工程可以對具有特定結合活性的鼠源抗體人源化，為疾病的治療提供安全可靠的藥物。此外還可以通過同源融合、異源融合產生各種雙功能抗體用于臨床的治療。人抗鼠抗體(HAMA)檢測試劑盒 2，抗體酶的應用 抗體酶是研究酶作用機理的有力工具。酶抑制劑的研究支持了Pauling過渡態(tài)理論，但它只能提供作用過程中結合專一性的信息，不能給出結合后發(fā)生催化反應以及結合與催化之間的關系。抗體酶實驗

8、則彌補了這一缺陷。除了基礎理論研究的價值，抗體酶的應用前景也令人鼓舞。Lerner指出，若將催化水解反應的抗體酶研究深入下去，極有可能得到一種新型蛋白酶，這種抗體酶在醫(yī)學上可用來專一破壞病毒蛋白質及清除體內“垃圾”。Lerner還提到，將具有立體專一性的抗體酶應用于制藥工業(yè)，將有助于解決對映體拆分的難題。隨著制備抗體酶新方法的不斷發(fā)展，抗體酶的催化反應的范圍將進一步拓寬特別是對那些天然酶不能催化的反應，則可研制抗體酶來進行催化。 其次，抗體酶的研究，為人們提供了一條合理途徑去設計適合于市場需要的蛋白質，即人為地設計制作酶。這是酶工程的一個全新領域。例如：利用動物免疫系統(tǒng)產生抗體的高度專一性，可

9、以得到一系列高度專一性的抗體酶，成為針對性強、藥效高的藥物，于是生產高純度立體專一性的藥物成為現實。又如：以某個生化反應的過渡態(tài)類似物來誘導免疫反應，產生特定抗體酶，以治療某種酶先天性缺陷的遺傳病?？贵w酶還可有選擇地使病毒外殼蛋白的肽鍵裂解，從而防止病毒與靶細胞結合。另外，抗體酶的固定化已獲得成功，將大大地推進工業(yè)化進程。 3，融合蛋白質的應用 腦啡脹(Enk)N端5肽線性結構是型受體結合的基本功能區(qū)域，干擾素(IFN)是一種廣譜抗病毒抗腫瘤的細胞因子。黎孟楓等人化學合成了Enk N端5肽編碼區(qū)，通過一連接3肽編碼區(qū)與人1型IFN基因連接，在大腸桿菌中表達了這一融合蛋白。以體外人結腸腺癌細胞和

10、多形膠質瘤細胞為模型，采用3H胸腺嘧啶核苷摻入法證明該融合蛋白抑制腫瘤細胞生長的活性顯著高于單純的IFN，通過Naloxone競爭阻斷實驗證明，抑制活性的增高確由Enk導向區(qū)介導。 4，蛋白質工程酶的應用 蛋白質酶工程在醫(yī)學上的應用相當成功。人體的消化功能依靠胃腸運動的機械性消化和消化酶作用的化學性消化來完成。消化液中含有大量消化酶，可促進食物中糖、脂肪、蛋白質的水解。由大分子物質變?yōu)樾》肿游镔|，以便被人體吸收利用。葡萄糖、甘油、甘油-酯、氨基酸等都是可溶解的小分子物質，可被小腸吸收。臨床中，消化酶不足既可引起廣泛的消化不良癥候群，如胃腸脹氣、胃飽脹、惡心、腹痛 、腹瀉、厭食等癥狀，還影響營養(yǎng)

11、物質的消化和吸收，造成低蛋白血癥、脂肪性腹瀉、脂溶性維生素缺乏、內分泌紊亂等。藥物消化酶則可以有效地解決這方面的疾病。消炎酶，溶菌酶，抗腫瘤酶等蛋白酶也在疾病的治療中各有其不同，為生命工程的發(fā)展做出了巨大貢獻。注射用胰蛋白酶-葡糖苷酶 溶菌酶 消炎酶 力克舒膠囊是一種加酶抗感冒藥。具有解熱鎮(zhèn)痛、消炎止咳效果。力克舒膠囊最大特點是配方中加入消炎酶，它是從菠蘿汁或其莖汁水中提取的一種蛋白水解酶。力克舒主要針對感冒癥狀，對鼻咽部卡他癥狀（如鼻塞、流涕、咽充血、痰涎等）。二，蛋白質工程的發(fā)展前景蛋白質工程研究，從世紀年代初至今，由于分子生物學和技術科學相結合，已經完成了幾十種蛋白質分子結構的改造。在蛋

12、白質結構與其功能的研究上已獲得很多有價值的檢測資料。人們已經初步掌握了蛋白質工程的技術程序，這就是基因定位、誘變。在了解蛋白質三維結構與功能的基礎上，對突變后的一維纖性肽鏈進行分子設計，從而構建全新的蛋白質分子。當今，在這個技術程序的控制手段方面已經取得了關鍵技術的突破。當前，蛋白質工程是發(fā)展較好、較快的分子工程。這是因為在進行蛋白質分子設計后，已可應用高效的基因工程來進行蛋白的合成。最早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在19821985年間對酪氨酰tRNA合成酶的分子改造工作。他根據XRD（X射線衍射）實測該酶與底物結合部位結構，用定位突變技術改變與底物結合的氨基酸殘基，并用動力學方法測

13、量所得變體酶的活性，深入探討了酶與底物的作用機制。佩里（Perry）1984年通過將溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，并進一步氧化生成Cys(3)-Cys（97）二硫鍵，使酶熱穩(wěn)定性提高，顯著改進了這種食品工業(yè)用酶的應用價值。1987年福什特通過將枯草桿菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，而導致了活性中心His（64）質子pKa從7下降到6，使酶在pH=6時的活力提高10倍。工業(yè)用酶最佳pH的改變預示可帶來巨大經濟效益。蛋白工程還可對酶的催化活性、底物專一性、抗氧化性、熱變性、堿變性等加以改變。由此可以看出蛋白工程的威力及其光輝前景。上述各例是通過對關鍵氨基酸殘基

14、的置換與增刪進行蛋白工程的一類方法。另一類是以某個典型的折疊進行“從頭設計”的方法。1988年杜邦公司宣布，成功設計并合成了由四段反平行螺旋組成為73個氨基殘基的成果。這顯示，按人們預期要求，通過從頭設計以折疊成新蛋白的目標已是可望又可及了。預測結構的模型法，在奠定分子生物學基礎時起過重大作用。蛋白的一級結構，包含著關于高級結構的信息這一點已日益明確。結合模型法，通過分子工程來預測高級結構，已成為人們所矚目的問題了。 蛋白質工程匯集了當代分子生物學等學科的一些前沿領域的最新成就，它把核酸與蛋白質結合、蛋白質空間結構與生物功能結合起來研究。蛋白質工程將蛋白質與酶的研究推進到嶄新的時代，為蛋白質和酶在工業(yè)、農業(yè)和醫(yī)藥方面的應用開拓了誘人的前景。蛋白質工程開創(chuàng)了按照人類意愿改造、創(chuàng)造符合人類需要的蛋白質的新時期。 蛋白質工程取得的進展向人們展示出