生化課件chapter1

1、蛋白質(zhì)化學第 一 章chemistry of Protein本章的重點和難點重點：掌握組成蛋白質(zhì)的氨基酸的結(jié)構(gòu)特點、分類、 三個字母代號及重要理化性質(zhì)； 掌握蛋白質(zhì)1-4級結(jié)構(gòu)特點、作用力； 了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系； 了解蛋白質(zhì)的重要理化性質(zhì)。難點：氨基酸結(jié)構(gòu)特點、酸堿性質(zhì)、等電點；蛋白質(zhì) 各級結(jié)構(gòu)的概念和特點、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系； 蛋白質(zhì)重要理化性質(zhì)的應用。 第一節(jié) 概 述一、什么是蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)是一切生物體中普遍存在的，由20種左右天然-氨基酸通過肽鍵相連形成的高分子含氮化合物；其種類繁多，具有一定的相對分子量、復雜分子結(jié)構(gòu)和特定生物學功能；是表達生物遺傳性狀的一類主要物質(zhì)。二、蛋白質(zhì)在

2、生命中的重要性 恩格斯曾指出：“生命是蛋白體的存在方式，這種存在方式本質(zhì)上就在于這些蛋白體的化學組成部分的不斷的自我更新?！?第一，蛋白體是生命的物質(zhì)基礎； 第二，生命是物質(zhì)運動的特殊形式，是蛋白體的存在方式； 第三，這種存在方式的本質(zhì)就是蛋白體與其外部自然界不斷 的新陳代謝。1.蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)必不可少的重要成分，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。 蛋白質(zhì)占干重 人體中（中年人） 人體 45% 水55% 細菌 50%80% 蛋白質(zhì)19% 真菌 14%52% 脂肪19% 酵母菌 14%50% 糖類1% 白地菌 50% 無機鹽7%三、 蛋白質(zhì)具有重要的生物學功能2.蛋白質(zhì)是一種生物功能的主

3、要體現(xiàn)者，它參與了幾乎所有的生命活動過程。1）作為生物催化劑（酶）2）代謝調(diào)節(jié)作用3）免疫保護作用4）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和存儲5）運動與支持作用6）參與細胞間信息傳遞3.外源蛋白質(zhì)有營養(yǎng)功能，可作為生產(chǎn)加工的對象。Fireflies emit light catalyzed by luciferase（熒光素酶） with ATPA few examples on protein diversityErythrocytes（紅細胞） contain a large amount of hemoglobins（血紅蛋白）, the oxygen-transporting protein.The prot

4、ein keratin （角蛋白） is the chief structural components of hair, horn, wool, nails and feathers.四、蛋白質(zhì)的元素組成 1.主要有C、H、O、N和S，有些蛋白質(zhì)含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質(zhì)還含有碘。 碳 50 氫 7 氧 23 氮 16% 硫 0-3 其他 微量（1）一切蛋白質(zhì)都含N元素，且各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近， 平均為16； （2）蛋白質(zhì)系數(shù)：任何生物樣品中每1g N的存在，就表示 大約有100/16=6.25g 蛋白質(zhì)的存在， 6.25被稱為蛋白質(zhì) 系數(shù) 100克樣品中蛋白

5、質(zhì)的含量 ( g )= 每克樣品含氮的克數(shù) 6.251001/16%2.蛋白質(zhì)元素組成的特點：凱氏定氮法測定粗蛋白含量五、蛋白質(zhì)的分類 （一）、依據(jù)蛋白質(zhì)的外形分為球狀蛋白質(zhì)和纖維狀蛋白質(zhì) 1.球狀蛋白質(zhì)：外形接近球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結(jié)晶， 大多數(shù)蛋白質(zhì)屬于這一類。 2.纖維狀蛋白質(zhì)：分子類似纖維或細棒。它又可分為可溶性纖維狀蛋 白質(zhì)和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)。 （二）、依據(jù)蛋白質(zhì)的組成分為簡單蛋白和結(jié)合蛋白 1.簡單蛋白：又稱為單純蛋白質(zhì)；這類蛋白質(zhì)只含由-氨基酸組成的 肽鏈，不含其它成分。 （1）清蛋白和球蛋白：廣泛存在于動物組織中，易溶于水，球蛋白 微溶于水，易溶于稀酸中。 （2）

6、谷蛋白和醇溶谷蛋白：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀 堿中，后者可溶于7080乙醇中。 （3）精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質(zhì)，存在與細胞核中。 （4）硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，分為角 蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。2.結(jié)合蛋白：由簡單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成（1）色蛋白：由簡單蛋白與色素物質(zhì)結(jié)合而成。如血紅蛋白、葉綠蛋白和細胞 色素等。（2）糖蛋白：由簡單蛋白與糖類物質(zhì)組成。如細胞膜中的糖蛋白等。（3）脂蛋白：由簡單蛋白與脂類結(jié)合而成。 如血清-、-脂蛋白等。（4）核蛋白：由簡單蛋白與核酸結(jié)合而成。如細胞核中的核糖核蛋白等。（5）磷蛋白：由簡單蛋白質(zhì)和磷酸組成。如胃

7、蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、彈性 蛋白、絲心蛋白等。（三）、按功能分為活性蛋白和非活性蛋白（四）、按營養(yǎng)價值分為完全蛋白和不完全蛋白 蛋白質(zhì)的互補作用第 二 節(jié) 氨基酸化學（重點） 組成蛋白質(zhì)的基本單位存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均屬 L-氨基酸（甘氨酸除外）。 一、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類(2). 除甘氨酸外，其它所有氨基酸分子中的-碳原子都為不對稱碳原 子。 A. 氨基酸都具有旋光性； B. 每一種氨基酸都具有D-型和L-型兩種立體異構(gòu)體。目前已 知的天然蛋白質(zhì)中氨基酸都為L-型。（一）氨基酸的結(jié)構(gòu) 氨基酸是蛋白質(zhì)水解的最終產(chǎn)物，是組成蛋白質(zhì)的基本單位。從

8、蛋白質(zhì)水解物中分離出來的氨基酸有二十種，除脯氨酸和羥脯氨酸外，這些天然氨基酸在結(jié)構(gòu)上的共同特點為：(1). 分子中同時含有羧基和氨基，且與羧基相鄰的-碳原子上都有一 個氨基，因而稱為-氨基酸。 COOHH2N CH -碳原子基團 R R基團-氨基酸基本結(jié)構(gòu)通式這些基本術(shù)語要清楚？-碳原子不對稱碳原子旋光性D-型和L-型兩種立體異構(gòu)體H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R（二）氨基酸的分類* 20種氨基酸的英文名稱、縮寫符號及分類如下: 中性AA（1）按R基團的酸堿性分 酸性AA 堿性AA（2）按R基團的疏水性和親水性分 疏水性R基團AA 親水性R基團AA （3）按R基團的化學結(jié)構(gòu)分 脂肪族A

9、芳香族AA 雜環(huán)族AA甘氨酸 glycine Gly G 5.97丙氨酸 alanine Ala A 6.00纈氨酸 valine Val V 5.96亮氨酸 leucine Leu L 5.98 異亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02 苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48脯氨酸 proline Pro P 6.30（非極性）疏水性氨基酸色氨酸 tryptophan Try W 5.89絲氨酸 serine Ser S 5.68酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66 半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸 methionine Me

10、t M 5.74天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65 蘇氨酸 threonine Thr T 5.602. 極性（親水）中性氨基酸天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22賴氨酸 lysine Lys K 9.74精氨酸 arginine Arg R 10.76組氨酸 histidine His H 7.593. 酸性氨基酸4. 堿性氨基酸由兩種酸性氨基酸衍生的兩種酰胺Gln（谷氨酰胺）Asn（天門冬酰胺）脂肪族氨基酸： 中性aa：甘、丙、纈、亮、異亮、絲

11、、蘇 酸性aa及酰胺：谷氨酸、谷氨酰胺、天門冬氨酸 及天門冬酰胺 堿性aa：精、賴、組 芳香族aa： 苯丙、色、酪 雜環(huán)aa： 脯、組 課后自己總結(jié)： 含S的aa？ 含酚羥基的aa? 含羥基的aa? 含酰胺基的aa? 含二硫鍵的aa? （三）人體所需的八種必需氨基酸 賴氨酸(Lys) 纈氨酸(Val) 蛋氨酸(Met) 色氨酸(Trp) 亮氨酸(Leu) 異亮氨酸(Ile) 蘇氨酸(Thr) 苯丙氨酸(Phe) 嬰兒時期所需: 精氨酸(Arg)、組氨酸(His) 早產(chǎn)兒所需：色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)必需氨基酸 生命活動所必需的，但人體自身不能合成，必須從食物中攝取的氨基酸。半必需氨

12、基酸 在人體內(nèi)合成速度很低，特別是新生兒或患病期，但又需要給予補充的氨基酸。非必需氨基酸 人體自身能夠合成的氨基酸。（四）幾種特殊的氨基酸 脯氨酸（唯一的亞氨基酸） 什么是亞氨基酸？ 半胱氨酸+胱氨酸二硫鍵-HH 氨基酸衍生物課后思考！非蛋白質(zhì)氨基酸有哪些？什么是天然氨基酸？D-型氨基酸的存在？二、氨基酸的重要理化性質(zhì)1. 兩性解離及等電點氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。等電點(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。pH=pI+OH-pHp

13、I+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性離子 陽離子陰離子 氨基酸等電點的計算側(cè)鏈不含離解基團的中性氨基酸：pI = (pK1 + pK2 )/2 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 堿性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 An acidic amino acid pI=(pK1+pKR)/2A basic amino acid pI=(pKR+pK2)/22. 紫外吸收 大多數(shù)蛋白質(zhì)含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸這三種氨基酸殘基，所以在280nm有最大吸收，測定蛋白質(zhì)溶液的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收 氨基

14、酸與水合茚三酮共熱，發(fā)生氧化脫氨反應，生成NH3與酮酸。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮；加熱過程中酮酸裂解，放出CO2，自身變?yōu)樯僖粋€碳的醛。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮；NH3與水合茚三酮及還原型茚三酮脫水縮合，生成藍紫色化合物。3. 與茚三酮的反應 反應要點：A. 該反應由NH2與COOH共同參與，-氨基酸特有的反應；B. 茚三酮是強氧化劑；C. 該反應非常靈敏，可在570nm測定吸光值；D. 測定范圍：0.550g/mL；E. 脯氨酸與茚三酮直接生成黃色物質(zhì)，在440nm測定（不釋放NH3），谷氨酰胺和天門冬酰胺與茚三酮直接生成棕色物質(zhì)。應用：A. 氨基酸定量分析（先用層析法分離）B. 氨基酸

15、自動分析儀： 用陽離子交換樹脂，將樣品中的氨基酸分離，自動定性定量，記錄結(jié)果。蛋白質(zhì)的水解性質(zhì)酸水解：可以獲得除Trp外的全部氨基酸堿水解：目的是測定Trp，消旋酶水解：慢，但不破壞任何氨基酸課后比較三種水解方法的優(yōu)缺點？蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括： 一級結(jié)構(gòu)(primary structure)二級結(jié)構(gòu)(secondary structure)三級結(jié)構(gòu)(tertiary structure)四級結(jié)構(gòu)(quaternary structure)高級結(jié)構(gòu)第三節(jié)、蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（一）基本概念* 肽鍵(peptide bond)是由一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學鍵。一、肽(

16、peptide)+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵* 肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。* 兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽* 肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。* 由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。N 末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C 末端：多肽鏈中有自由羧基的一端多肽鏈的表示方法：從N端開始到C端 可用aa中文第一個字或英文連字體或單字母 中間用 “”或”-”連接 多肽有兩端：多肽鏈(polypeptide chain)是指許多氨基酸之間

17、以肽鍵連接而成的一種結(jié)構(gòu)。氨基酸順序是指在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列。N末端C末端牛核糖核酸酶環(huán)狀肽：指沒有自由的-氨基端和- 羧基 端的肽。（一）定義蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸的排列順序，指蛋白質(zhì)的aa組成和排序、二硫鍵數(shù)目、肽鏈數(shù)目、末端aa的種類等等。二、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu) 主要的化學鍵肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。 目 錄（二）、多肽鏈中氨基酸序列分析 分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成 測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基 把肽鏈水解成片段，分別進行分析 測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)

18、過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序結(jié)果。蛋白質(zhì)順序測定的基本戰(zhàn)略將肽段順序進行疊聯(lián)以確定完整的順序 將肽段分離并測出順序?qū)Ｒ恍粤呀饽┒税被釡y定二硫鍵拆開純蛋白質(zhì)測定N末端AA的方法DNFB法 PITC法 DNS-氯法 反應特點: A. 為- NH2的反應； B. 氨基酸- NH2的一個H原子可被烴基取代(鹵代烴)； C. 在弱堿性條件下，與DNFB發(fā)生芳環(huán)取代，生成二硝基苯 氨基酸。應用： 鑒定多肽或蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸，首先由Sanger應用，確定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)，肽分子與DNFB反應，得DNP-肽，水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游離氨基酸，分離DNP-氨基酸。(

19、1) 與2，4-二硝基氟苯（DNFB）反應 Edman 降解法（苯異硫氰酸酯法）:氨基酸順序分析法實際上也是一種N-端分析法。此法的特點是能夠不斷重復循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。肽鏈（N端氨基酸）與PITC偶聯(lián)，生成PTH-氨基酸，分離PTH-氨基酸。氨基酸自動測序儀就是根據(jù)這個原理設計的。(2) 與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應 用DNS-氯(二甲基萘磺酰氯)測定N端氨基酸水解后的DNS-氨基酸不需分離，可直接用電泳或?qū)游龇ㄨb定，由于DNS有強烈熒光，靈敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高幾到十幾倍，可用于微量氨基酸的定量。(3) DNS-氯法C末端測定法肼解法羧

20、肽酶法（重點） 羧肽酶A 羧肽酶B常用的斷裂多肽鏈的方法溴化氰裂解法： 專一性水解Met的羧基端；胰蛋白酶水解法： 專一性水解Lys、Arg的羧基端；胰凝乳蛋白酶水解法： 專一性水解Tyr、Phe、Trp的羧基端； 胃蛋白酶水解法： 專一性斷裂鍵兩端都是疏水氨基酸；金黃色葡萄球菌蛋白酶水解法：專一性水解Glu、 Asp的羧基 端； 梭狀芽孢桿菌蛋白酶水解法： 專一性水解Arg的羧基端；用于氨基酸順序分析的其他顏色反應坂口反應Arg米倫反應tyr福林反應 tyr乙醛酸反應trp半胱氨酸反應cysPauly反應 tyr,his例如：p70第5題三、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)

21、構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架盤繞折疊，依靠氫鍵維持固定所形成的有規(guī)律性的結(jié)構(gòu)。它并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。定義 主要的化學鍵： 氫鍵 （一）肽單元參與肽鍵的6個原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所處的位置為反式(trans)構(gòu)型，此同一平面上的6個原子構(gòu)成了所謂的肽單元 (peptide unit) 。 組成肽鍵的原子處于同一平面；肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)；在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。肽鍵的特點幾個基本概念肽單位：指多肽鏈上從一個a-碳原子到相鄰的a-碳原子之間的結(jié)構(gòu)，它是肽鏈主鏈骨架中的重復結(jié)構(gòu)。肽平面：由于肽鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)，因而不能

22、自由旋轉(zhuǎn)，使得肽鍵所連接的6個原子處于同一個平面上。這個平面稱為肽平面。a-碳原子的二面角：多肽鏈中C-N和C-C之間都是單鍵，可以自由旋轉(zhuǎn)，其中C-N旋轉(zhuǎn)角度由表示。 C-C間旋轉(zhuǎn)角度由表示，它們被稱為a-碳原子的二面角。肽單位的三個顯著特征：肽平面、a-碳原子的二面角、反式結(jié)構(gòu)。一級結(jié)構(gòu)的最小單位是aa殘基，高級結(jié)構(gòu)的最小單位是肽單位。 （二）、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式 -螺旋 ( -helix ) -折疊 ( -pleated sheet ) -轉(zhuǎn)角 ( -turn ) 無規(guī)則卷曲 ( random coil ) 1. -螺旋（1） 什么是a-螺旋結(jié)構(gòu)?定義 指肽鏈主鏈骨架圍繞中心軸盤繞

23、折疊所形成的有規(guī)則的結(jié)構(gòu)，每圈螺旋含3.6個aa殘基。螺旋的螺距為0.54nm，結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定是靠鏈內(nèi)的氫鍵。結(jié)構(gòu)特征 * 類似棒狀結(jié)構(gòu)，緊密卷曲的多肽鏈構(gòu)成了棒的中心部 分，側(cè)鏈R伸出到螺旋的外面，完成一個螺旋需3.6個氨 基酸殘基，螺旋每上升一圈，螺距為0.54nm，相鄰兩個 氨基酸殘基之間的軸心距為0.15nm； * a-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要靠鏈內(nèi)氫鍵，氫鍵形成于第一個 氨基酸殘基的羧基與線性順序中的第五個氨基酸的氨 基，氫鍵環(huán)內(nèi)包含13個原子，因此a-螺旋通常的表示法為 ns(n為每螺旋中包含的氨基酸殘基數(shù)，s為氫鍵環(huán)內(nèi)包含的 原子數(shù)）； * 大多數(shù)蛋白質(zhì)中的a-螺旋為右手螺旋。* 有些結(jié)構(gòu)

24、不易形成a-螺旋Gly和Pro不易形成a-螺旋；多聚大側(cè)鏈aa；多聚相同電荷aa。2.-折疊什么是 -折疊結(jié)構(gòu)？ 定義 指是由兩條或兩條以上幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間氫鍵交聯(lián)而成。肽鏈的主鏈成鋸齒狀折疊構(gòu)象。 結(jié)構(gòu)特征 在 -折疊中，-碳原子總是處于折疊線上，氨基酸的側(cè)鏈都垂直于折疊片平面，交替地分布在片狀平面的上面或下面，以避免R基團的空間障礙；相鄰兩個氨基酸之間的軸心距為0.35nm；幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。有鏈內(nèi)氫鍵和鏈間氫鍵；-折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。3. -轉(zhuǎn)角

25、和無規(guī)則卷曲-轉(zhuǎn)角無規(guī)則卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)。 b turn (b -bend or hairpin發(fā)卡 turn) is also a common secondary structure found where a polypeptide chain abruptly reverses its direction.Relative probabilities that a given amino acid will occur in the three common types of secondary structure.(三) 超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域（）超二級結(jié)構(gòu)在

26、蛋白質(zhì)分子中，由若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的、在空間上能辨認的二級結(jié)構(gòu)組合體。幾種類型的超二級結(jié)構(gòu)： ；Rossmann卷曲 在球狀蛋白質(zhì)中，常見兩個聚集體連在一起，形成 結(jié)構(gòu)。 （）結(jié)構(gòu)域 對于較大的蛋白質(zhì)分子或亞基，多肽鏈往往由兩個或兩個以上相對獨立的三維實體締合而成三級結(jié)構(gòu)。這種相對獨立的三維實體就稱結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域通常是幾個超二級結(jié)構(gòu)的組合，對于較小的蛋白質(zhì)分子，結(jié)構(gòu)域與三級結(jié)構(gòu)等同，即這些蛋白為單結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域一般由100200個氨基酸殘基組成，氨基酸可以是連續(xù)的，也可以是不連續(xù)的結(jié)構(gòu)域之間常形成裂隙，比較松散，往往是蛋白質(zhì)優(yōu)先被水解的部位。酶的活性中心

27、往往位于兩個結(jié)構(gòu)域的界面上結(jié)構(gòu)域之間由“鉸鏈區(qū)”相連，使分子構(gòu)象有一定的柔性，通過結(jié)構(gòu)域之間的相對運動，使蛋白質(zhì)分子實現(xiàn)一定的生物功能。纖連蛋白分子的結(jié)構(gòu)域 Structural domains in the polypeptide troponin (肌鈣蛋白) C, two separate calcium-binding domains（3）分子伴侶(chaperon)分子伴侶通過提供一個保護環(huán)境從而加速蛋白質(zhì)折疊成天然構(gòu)象或形成四級結(jié)構(gòu)。* 分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水部分結(jié)合隨后松開，如此重復進行可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確折疊； * 分子伴侶也可與錯誤聚集的肽段結(jié)合，使之解

28、聚后，再誘導其正確折疊； * 分子伴侶在蛋白質(zhì)分子折疊過程中二硫鍵的正確形成起了重要的作用。 四、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)疏水鍵、離子鍵、氫鍵和 Van der Waals力等 主要的化學鍵：整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。（一） 定義 亞基之間的結(jié)合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。五、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的亞基 (subunit)。 血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)的測定由佩魯茨 1958年完成，其結(jié)構(gòu)要點為

29、：球狀蛋白，寡聚蛋白，含四個亞基兩條鏈，兩條鏈，22 鏈：141個殘基； 鏈：146個殘基分子量65 000含四個血紅素輔基親水性側(cè)鏈基團在分子表面，疏水性基團在分子內(nèi)部蛋白質(zhì)分子中的結(jié)構(gòu)層次:一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)超二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)亞基 四級結(jié)構(gòu)目 錄維系蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)：肽鍵、二硫鍵維系蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)：氫鍵維系蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)：疏水相互作用力 氫鍵 范德華力 鹽鍵維系蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵第四節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）一級結(jié)構(gòu)決定其空間結(jié)構(gòu) 一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)二硫鍵 天然狀態(tài)，有催化活性 尿素、 -巰基乙醇去除尿素、-巰

30、基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性如何證明？ Anfinsen的實驗Anfinsen的實驗 有活性球狀分子核糖核酸酶（氫鍵、二硫鍵）8M尿素、巰基乙醇變性為伸展的分子，生物活性消失透析除去變性劑和還原劑酶的活性大部分恢復，伸展的多肽鏈重新折疊，二硫鍵正確配對；還原后的核糖核酸酶8M尿素重新氧化無活性錯亂的核糖核酸酶微量巰基乙醇有活性核糖核酸酶（二硫鍵正確配對）。說明什么問題？A：蛋白質(zhì)的變性是可逆的，變性蛋白質(zhì)在一定條件下是 可以恢復活性的；B：恢復的原因是在一定條件下可自身折疊成天然構(gòu)象；C：前兩項根源是蛋白質(zhì)之所以能形成復雜的三級結(jié)構(gòu)， 所需要的全部信息都包含在一級結(jié)構(gòu)中；D：一級結(jié)構(gòu)決定它的高級結(jié)

31、構(gòu)。 （二）一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 1、同源蛋白質(zhì)的研究：也叫同功能蛋白質(zhì)，有助于研究生物進化。 A、同源蛋白質(zhì)的概念： 是指在不同生物體中實現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì)。它的一級結(jié)構(gòu)中有許多位置的aa對所有種屬來說都是相同的，稱為不變殘基。其他位置的aa差異較大，稱為可變殘基。這種aa順序中的相似性稱為順序同源現(xiàn)象。 B、舉例： 如細胞色素c，120個物種，28個aa位置不變，是維持構(gòu)象上發(fā)揮功能的必要部位?？勺儦埢S進化而變異，親緣關(guān)系越近，aa差異越?。ɡL出進化樹）。2、一級結(jié)構(gòu)相同，功能相同，一級結(jié)構(gòu)的細小變化導致功能完全不同。 A、分子病的概念：由于遺傳基因的突變導致蛋白質(zhì)分子 結(jié)構(gòu)的改變或某種

32、蛋白質(zhì)缺乏引起的疾病。B、例如：鐮刀性貧血病N-val his leu thr pro glu glu C(146) HbS 肽鏈HbA 肽 鏈N-val his leu thr pro val glu C(146) Mutation and molecular interactions changes二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)具有特有的空間構(gòu)象，因而就有相應的生物學功能。 舉例說明：不同的aa順序可以產(chǎn)生相同的空間構(gòu)象，因而執(zhí)行相同的生物學功能。（一）肌紅蛋白與血紅蛋白的結(jié)構(gòu) 與功能 1、結(jié)構(gòu) 肌紅蛋白： 一條肽鏈。一個血紅素輔基，75%為-螺旋，內(nèi)部為非極性aa，血紅素在表面，

33、通過His93和His64與內(nèi)部相連，His64存在于第六位配位鍵上，可避免Fe2+氧化。血紅蛋白： 四條肽鏈。2條鏈，2條鏈，4個血紅素輔基，每條1個，由4個原卟啉和1個鐵原子組成，形成6個配位鍵，4個與原卟啉的N原子結(jié)合，1個與His93結(jié)合，另1個可與O2或水結(jié)合，當未與O2結(jié)合時。Fe2+處于高自旋狀態(tài)，使這種6位結(jié)合形成一個“圓屋頂”，F(xiàn)e2+高出屋頂，不穩(wěn)；當與O2結(jié)合后，F(xiàn)e2+變?yōu)榈妥孕隣顟B(tài)，F(xiàn)e2+落入環(huán)中而不穩(wěn)。構(gòu)象改變也影響其它亞基結(jié)合O2。2、氧合曲線不同，血紅蛋白的結(jié)合O2曲線為S型， 肌紅蛋白為雙曲線，也就是血紅蛋白與O2結(jié)合具 有協(xié)同性，為什么？ 血紅蛋白由四個亞

34、基組成，脫氧時，四條鏈的C端均參與鹽橋的形成，多個鹽橋的存在使它處于高度約束狀態(tài)，當一個氧分子沖破某種阻力與血紅蛋白的一個亞基結(jié)合后，這些鹽橋打斷，使亞基構(gòu)象發(fā)生改變，而引起鄰近亞基的構(gòu)象發(fā)生改變，這種變化易于和O2的結(jié)合，并繼續(xù)影響第三個和第四個亞基與O2的結(jié)合。由此Monod提出了蛋白質(zhì)的變構(gòu)作用。Hb與Mb一樣能可逆地與O2結(jié)合， Hb與O2結(jié)合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數(shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線* 協(xié)同效應(cooperativity) 一個寡聚體蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結(jié)合

35、能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應。 如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應 (positive cooperativity)如果是抑制作用則稱為負協(xié)同效應 (negative cooperativity)O2血紅素與氧結(jié)合后，鐵原子半徑變小，就能進入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。什么是波爾（Bohr）效應？ 它主要描述pH值或H+濃度和CO2分壓的變化對血紅蛋白結(jié)合氧能力的影響，在pH值一定的情況下，CO2分壓升高，血紅蛋白對氧的結(jié)合能力降低；降低pH值（H+濃度升高），促進血紅蛋白釋放氧，此現(xiàn)象由丹麥科學家C. Bohr發(fā)現(xiàn)，因此稱為Bohr效應。 Bohr效應的生理意義 A：當血液流經(jīng)組織，特別

36、是代謝旺盛的組織如肌肉 時，這里的pH較低，CO2濃度較高，氧合血紅蛋 白釋放O2，使組織獲得更多O2，供其需要，而O2 的釋放，又促使血紅蛋白與H+與CO2結(jié)合，以緩 解pH降低引起的問題。B：當血液流經(jīng)肺時，肺O2升高，因此有利于血紅蛋 白與O2結(jié)合，促進H+與CO2釋放，CO2的呼出又有 利于氧合血紅蛋白的生成。 為什么2，3-二磷酸甘油的存在可以降低血紅蛋白與O2的親和力，有何生理意義？ A：BPG是紅細胞在無氧或缺氧情況下的代謝產(chǎn)物。Hb與BPG結(jié)合后，氧曲線向右移，降低了血紅蛋白與O2的結(jié)合能力，釋放O2供組織需要。它在血液中與血紅蛋白等摩爾存在。B：BPG只影響Hb與O2的結(jié)合，

37、不影響Hb O2與O2的親和力。C：為什么？*血紅蛋白四個亞基中央有一個孔穴，BPG就結(jié)合在這個孔穴中，在生理條件下，BPG帶負電荷，可與血紅蛋白兩條鏈上帶正電荷的堿性aa形成鹽鍵，加上原來的八個鹽鍵，使血紅蛋白結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，不易結(jié)合O2(脫氧情況下)。*氧合情況下，O2的結(jié)合已經(jīng)打斷了鹽鍵，使鏈相互接近，中央孔穴變小，無法再容納BPG分子，同時構(gòu)象變化使BPG無法與鏈上堿性aa形成鹽鍵，因此BPG無法結(jié)合進入Hb O2分子內(nèi)。第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離（一）蛋白質(zhì)的兩性電離 一、理化性質(zhì) 蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電

38、荷或正電荷的基團。 * 蛋白質(zhì)的等電點( isoelectric point, pI) 當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。* 處于等電點的蛋白質(zhì)溶解度最低.（二）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。 * 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素雙電層水化層 蛋白質(zhì)膠體性質(zhì) 由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的顆粒，因而具有膠體溶液的特征?？扇苄缘鞍踪|(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對水有很高的親和性，通過水合作用在蛋白質(zhì)顆粒

39、外面形成一層水化層，同時這些顆粒帶有電荷，因而蛋白質(zhì)溶液是相當穩(wěn)定的親水膠體。 蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應用 透析法:利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的的性質(zhì)，將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋再置于流水中，小分子雜質(zhì)被透析出，大分子蛋白質(zhì)留在袋中，以達到純化蛋白質(zhì)的目的。這種方法稱為透析（dialysis）。 鹽析法:在蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的硫酸銨、氯化鈉等中性鹽，可有效地破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化層。同時又中和了蛋白質(zhì)表面的電荷，從而使蛋白質(zhì)顆粒集聚而生成沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析（salting out）。（三）蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固 * 蛋白質(zhì)的變性(denaturation)在某些物理和化學因素作用下

40、，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。 造成變性的因素如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等 。 變性的本質(zhì)破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。變性后蛋白質(zhì)的特征處于伸展狀態(tài)，溶解度降低，易酶解，分子的不對稱性增加。 應用舉例臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。此外，防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。 若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復或部分恢復其原有的構(gòu)象和功能，稱為復性(renaturation) 。 天然狀態(tài)，有催化活性 尿素、 -巰基乙醇

41、去除尿素、-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性* 蛋白質(zhì)沉淀 在一定條件下，蛋白質(zhì)疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。 可分為兩種類型： 可逆性沉淀作用：蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀后，用透析等方法除去 沉淀劑，可使蛋白質(zhì)重新溶于原來的溶 液中。不可逆性沉淀作用：蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀后，不能用透析等方法 除去沉淀劑使蛋白質(zhì)重新溶于原來的溶 液中。 主要沉淀因素及機理： 無機鹽類：如硫酸銨，破壞其雙電層，使蛋白質(zhì)失去 電荷而析出。 重金屬鹽類：在堿性條件下，蛋白質(zhì)帶負電荷，可以 與重金屬離子結(jié)合，形成不溶性重金屬 蛋白鹽沉淀，如醋酸鉛、硫酸銅等。

42、 有機溶劑：破壞水化層，使蛋白質(zhì)分子間靜電作用增 加而聚焦沉淀，如乙醇、丙酮等。 生物堿試劑：在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電荷，與生 物堿試劑結(jié)合形成溶解度極小的鹽類， 如三氯乙酸、單寧酸等。 （四）蛋白質(zhì)的含量測定方法（1) 紫外吸收法（2）考馬斯亮藍G-250法（3）Folin法（五）蛋白質(zhì)的呈色反應 茚三酮反應(ninhydrin reaction) 蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應。 雙縮脲反應(biuret reaction)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。雙縮脲反應 蛋白質(zhì)在堿性溶液中

43、也能與硫酸銅發(fā)生相同反應，產(chǎn)生紅紫色絡合物紅紫色絡合物(鹼性溶液)Cu2+二、蛋白質(zhì)的分離和純化（一）、 一般步驟 1、材料的預處理 2、破碎細胞 3、蛋白質(zhì)的粗提（與雜質(zhì)分開） 4、將蛋白質(zhì)沉淀出來（等電點、鹽析法、 有機溶劑法） 5、粗制品的純化（凝膠過濾法、纖維素柱 色譜法、親和層系法）Protein PurificationSelection of a protein sourceHomogeniza-tion and solubilizationAmmonium sulfate precipitationDialysisFurther purificationUltracentrif

44、ugationElectrophoresisChromatography （二）、蛋白質(zhì)的純化方法（1）透析及超濾法* 透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。* 超濾法 應用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。（2）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀 *使用丙酮沉淀時，必須在04低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 *鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白

45、質(zhì)沉淀。 * 免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。 （3）電泳蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù), 稱為電泳(electrophoresis) 。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。 幾種重要的蛋白質(zhì)電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。*等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學研究的重要技術(shù)。Native PAGESDS（4）層析 層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固