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文檔簡介
1、第四講細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物教研室李想第三節(jié) 細(xì)胞組分的分級分離(一)破壞細(xì)胞的方法:低滲透壓、超聲震蕩、機(jī)械破碎等細(xì)胞懸浮液勻漿液 微粒體:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成的小泡 膜細(xì)胞器大分子(二)細(xì)胞組分的分級離心差速離心速度沉降平衡沉降1 差速離心 分離細(xì)胞核與細(xì)胞器根據(jù)組分的大小和形狀分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心 在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為:核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。差速離心的原理2、速度沉降用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。 樣品置于含有蔗糖的稀鹽液上層,生物顆粒(細(xì)胞或細(xì)胞器)在十分平緩的密度梯度介質(zhì)(5
2、%20%蔗糖)中按各自的沉降系數(shù)(大小與形狀)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。(2)等密度(平衡)沉降取決于細(xì)胞成分的浮力密度,與大小形狀無關(guān)制備較高濃度差的介質(zhì)(20%70%蔗糖或氯化銫),將待分離樣品均勻分布在介質(zhì)中,高速或超速離心,離心時(shí)間也較長。非細(xì)胞體系:從分級分離得到的具有生物功能的細(xì)胞抽提物,用于研究其生物學(xué)功能。柱層析:使蛋白質(zhì)混合液通過含有多孔固體基質(zhì)的柱中,不同蛋白質(zhì)與基質(zhì)相互作用被不同程度 的滯留,這樣可在柱底將它們分別收集。(三)、分離蛋白質(zhì)柱層析據(jù)填充顆粒不同分為:(1)離子交換層析 : 電荷(2)凝膠過濾層析: 大?。?)親和性層析: 與蛋白質(zhì)表面特異結(jié)合(4)疏水性層
3、析: 疏水性基團(tuán)(四)、檢測蛋白質(zhì)電泳1. SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS) 按蛋白質(zhì)分子量大小分離,適用分析任何種類的蛋白質(zhì),能確定蛋白分子量和亞基組成,但是,電泳是在變性條件下分離,功能多已喪失。 (2)蛋白印跡利用特異抗體來鑒定相應(yīng)的蛋白質(zhì)1.原理 待分析的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上,并與所研究的蛋白質(zhì)特異抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。是在蛋白質(zhì)水平定量檢測基因表達(dá)改變的主要方法。2. 等電聚焦電泳按照蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同分離蛋白質(zhì)。 原理: 在丙烯酰胺凝膠兩端形成電場,含有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)在電場當(dāng)中形成PH梯度,樣品中所有的蛋白質(zhì)在電泳時(shí)都向自己的等
4、電點(diǎn)處移動、聚集。分離效果好步驟:1、等電聚焦電泳3. 雙向電泳按照蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和大小進(jìn)行分離等電聚焦與SDS結(jié)合分離效果好第四節(jié) 細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞內(nèi)分子示蹤技術(shù)細(xì)胞化學(xué)技術(shù):是在保持組織原有結(jié)構(gòu)的情況下,利用生物分子的物理和化學(xué)性質(zhì)來研究他們在細(xì)胞內(nèi)的分布、數(shù)量及動態(tài)變化。包括:酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 放射性自顯影技術(shù) 綠色熒光蛋白技術(shù)放射自顯影技術(shù).原理:將放射性同位素(如14C和3H)標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi),經(jīng)過一段時(shí)間后,將標(biāo)本制成切片或涂片,涂上鹵化銀乳膠,經(jīng)一定時(shí)間的放射性曝光,組織中的放射性即可使乳膠感光。然后經(jīng)過顯影、定影處理顯示還原的黑色銀顆粒,即可得知標(biāo)本中標(biāo)記
5、物的準(zhǔn)確位置和數(shù)量,放射自顯影的切片還可再用染料染色,這樣便可在顯微鏡下對標(biāo)記上放射性的化合物進(jìn)行定位或相對定量測定。一般常用3H胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TDR)來顯示DNA,用3H尿嘧啶核苷(3H-UDR)顯示RNA;用3H-亮基酸和35S-蛋氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì),研究多糖則用3H甘露糖、3H巖藻糖等。 2.綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)最早是在海洋生物水母中發(fā)現(xiàn)的。GFP蛋白的多肽鏈中含有特殊的生色團(tuán)結(jié)構(gòu),可在紫外光源下發(fā)出穩(wěn)定的綠色熒光。并這種熒光發(fā)射無需外加輔助因子或進(jìn)行任何特殊處理。GFP標(biāo)記分子最常作為標(biāo)記物來追蹤結(jié)合分子的表達(dá)水平和定位,或作
6、為檢測環(huán)境變化或蛋白相互作用的指標(biāo)。目前廣泛用于分子和細(xì)胞生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域。構(gòu)建與綠色熒光蛋白融合的蛋白Map of pEGFP-C1 vectorab馬丁沙爾菲(左)、下村修(中)和錢永健在發(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白方面做出貢獻(xiàn)而分享2008年諾貝爾化學(xué)獎第五節(jié) 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)一、核酸DNA技術(shù) (一)、分離DNA電泳技術(shù) 1 瓊脂糖凝膠電泳 樣品不需處理可直接電泳;分辨力低; 不適合分離100堿基以下的核酸分子 2 丙烯酰胺凝膠電泳 分辨力高,分離500堿基以下的DNA分子;操作復(fù)雜;所需時(shí)間長(二)、PCR技術(shù)1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( PCR):用于在體外將微量的目標(biāo)DNA大量擴(kuò)增,以便進(jìn)行分
7、析。(1)反應(yīng)體系:樣品DNA;引物是人工合成的一對寡核苷酸鏈(約15-20個(gè)核苷酸),用于擴(kuò)增夾在雙引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)之間的區(qū)域;4種dNTP;Tag DNA聚合酶,是從一種嗜熱水生菌)中分離出來的。此酶最適作用溫度7580,但短時(shí)間在95下不失活。適宜的緩沖體系和適量的Mg2+。(2)反應(yīng)過程:變性:(約90- 95)使DNA雙鏈解離復(fù)性:降溫(約60左右)退火,使引物與模板結(jié)合延伸:升溫度至70-75,在引物的引導(dǎo)下合成模板單鏈的互補(bǔ)鏈,從而形成DNA雙鏈片段重復(fù)上述“變性復(fù)性延伸”的過程。最初幾次 循環(huán)中形成的長鏈DNA較多,但隨著反應(yīng)的進(jìn)行,長鏈 DNA以算術(shù)級數(shù)增加,而夾在兩個(gè)
8、引物之間的目標(biāo)DNA以指數(shù)級數(shù)增長,經(jīng)大約2030次循環(huán)后,擴(kuò)增產(chǎn)物中主要是目標(biāo)DNA。二、核酸分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù) 在研究DNA分子復(fù)性變化基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)。1.原理:具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段,在適當(dāng)條件下,通過氫鍵結(jié)合,形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。2.探針:將一條已知序列的單鏈核酸片段用放射性核素或其它標(biāo)記物標(biāo)記3.DNA變性:當(dāng)溶液中的DNA分子處于高溫或高pH值(13)條件下,維持雙螺旋在一起的堿基互補(bǔ)對就被破壞,DNA雙鏈解離成兩條單鏈,這一過程叫DNA變性。4.DNA復(fù)性:當(dāng)溫度降低至合適溫度或恢復(fù)pH值至中性,兩
9、條裂解的單鏈按堿基互補(bǔ)配對原則重新形成雙鏈結(jié)構(gòu),這一過程叫DNA復(fù)性,又叫DNA雜交。(一)、原位雜交 用核苷酸探針在細(xì)菌、細(xì)胞、或組織切片上對特殊的核苷酸順序在其原位進(jìn)行雜交,叫原位雜交。對被雜交的DNA或RNA分子進(jìn)行定位和定量研究。人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片(二)、Northern blot將從組織細(xì)胞中提取的RNA混合物用瓊脂糖凝膠電泳按大小分離,分離后的核酸條帶原樣轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或尼龍膜上,再用特異的DNA探針檢測互補(bǔ)的RNA分子,這一過程稱為RNA-DNA用于基因表達(dá)的特異性分析和定量分析(三)、Southern blotDNA-DNA用于DNA重組子的鑒定;基因突變
10、分析;基因敲除與轉(zhuǎn)基因動物的鑒定轉(zhuǎn)化transformation: 載體導(dǎo)入原核細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)染transfection: 載體導(dǎo)入真核細(xì)胞表達(dá)三、外源基因表達(dá)技術(shù)四、生物芯片技術(shù)DNA芯片-基因芯片、DNA陣列、cDNA芯片或寡核苷酸陣列原理:是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接將大量預(yù)先合成的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物的表面,再與經(jīng)過熒光標(biāo)記的樣品進(jìn)行分子雜交,通過對雜交信號的檢測分析,得出樣品的相關(guān)信息。蛋白質(zhì)芯片:是將大量蛋白質(zhì)或多肽微固化支持物表面,通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(包括抗原抗體反應(yīng),受體配體識別等),對樣品中靶蛋白分子進(jìn)行高通量檢測的一種技術(shù)。原理:把熒光標(biāo)記的待檢樣品與芯片上的蛋白質(zhì)探針結(jié)合,洗脫未反應(yīng)成分后檢測特異的反應(yīng)信號。五、鑒定蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù) 質(zhì)譜:在真空狀態(tài)下,用電子轟擊氣態(tài)樣品使其離子化,或用高速粒子轟擊液相、固相成分,使樣品向氣態(tài)中逸脫并離子化,這些離子根據(jù)質(zhì)量數(shù)/電荷數(shù)(m/z)的順序在電場的作用下分離并被記錄用途 是測定小分子分子量最準(zhǔn)確的方法 用于檢測翻譯
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