《基因工程論》word版

1、 基因工程課程設(shè)計(jì)題目：基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用姓名：王曉紅 學(xué)號(hào)：20103027 年級(jí)：10級(jí)3班 專業(yè)：生物技術(shù)專業(yè)指導(dǎo)教師：朱常香山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院二014年 選題依據(jù)課程設(shè)計(jì)目的了解工業(yè)生產(chǎn)中的新型育種技術(shù)并比較不同育種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)； 學(xué)習(xí)理解基因工程育種技術(shù)及其操作原理；研究基因工程育種技術(shù)在人干擾素生產(chǎn)中的創(chuàng)新。 基因工程作為21世紀(jì)的一種新型生物技術(shù)，應(yīng)用基因工程育種技術(shù)重組大腸桿菌BL21(pBAI)生產(chǎn)人干擾素a2b, 通過優(yōu)化補(bǔ)料分批培養(yǎng)時(shí)葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表達(dá)量和表達(dá)速率。利用這些技術(shù)，可以直接地、有針對(duì)性地在DNA分子水平上

2、改造生物的遺傳性狀。通過轉(zhuǎn)入外源基因，微生物和動(dòng)、植物細(xì)胞可以產(chǎn)生出自身原來沒有的蛋白質(zhì)。同樣，利用重組DNA技術(shù)，也可以使一些原來存在量極低但有重要工業(yè)或醫(yī)學(xué)用途的小分子(抗生素)或蛋白質(zhì)之外的大分子物質(zhì)得以大量生產(chǎn)。特別是隨著重組DNA技術(shù)的完善和發(fā)展，以基因水平為核心的現(xiàn)代分子定向育種技術(shù)越來越受到工業(yè)微生物育種學(xué)家的關(guān)注，并展示了良好的應(yīng)用前景。文獻(xiàn)綜述內(nèi)容1972年美國的Berg和Jackson等人將猿猴病毒基因組SV 40DNA、噬菌體基因以及大腸桿菌半乳糖操縱子在體外重組獲得成功。翌年，美國斯坦佛大學(xué)的Cohen和Boyer等人在體外構(gòu)建出含有四環(huán)素和鏈霉素連個(gè)抗性基因的重組質(zhì)粒

3、分子，將之導(dǎo)入大腸桿菌后，該重組質(zhì)粒得以穩(wěn)定復(fù)制，并賦予受體細(xì)胞相應(yīng)的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的誕生。在二十世紀(jì)八十年代以來，隨著大批大批成果的出現(xiàn)及應(yīng)用，基因工程帶來了一場(chǎng)新的革命。-干擾素具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞抑制功能和抗病毒活性功能,在臨床上有一定的應(yīng)用價(jià)值。由于天然-干擾素來源有限,產(chǎn)量甚微,因此有關(guān)-干擾素的基因工程技術(shù)研究1,2十分活躍,并帶動(dòng)了重組人干擾素-(rIFN-)下游技術(shù)的研究3。優(yōu)化發(fā)酵工藝以獲得穩(wěn)定的高質(zhì)量發(fā)酵產(chǎn)物,可以降低下游技術(shù)中分離純化的成本和難度。但是,不能得到穩(wěn)定的高效表達(dá)產(chǎn)物是基因工程中普遍存在的問題4,除表達(dá)系統(tǒng)本身因素外,還涉及諸多其它因素。通

4、過對(duì)pBV220IFN-DH5工程菌高效表達(dá)rIFN-因素的研究,并選擇合適條件分離包含體,獲得了rIFN-含量和活性都很高的粗提液。采用高效疏水色譜法(HPHIC)對(duì)rIFN-進(jìn)行一步同時(shí)純化與復(fù)性,方法不僅簡(jiǎn)單、快速,而且避免了采用大量溶劑稀釋復(fù)性和通過透析除去變性劑的麻煩?；蚬こ逃N基因工程育種是在基因水平上，運(yùn)用人為方法將所需的某一供體生物的遺傳物質(zhì)提取出來，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，與載體連接，然后導(dǎo)入另一細(xì)胞，使外源遺傳物質(zhì)在其中進(jìn)行正常復(fù)制和表達(dá)引，與前幾種育種技術(shù)相比，基因工程育種技術(shù)是人們?cè)诜肿由飳W(xué)指導(dǎo)下的一種自覺的、能像工程一樣可預(yù)先設(shè)計(jì)和控制的育種新技術(shù)，

5、它可實(shí)現(xiàn)超遠(yuǎn)緣雜交，因而是最新最有前途的一種育種新技術(shù)。基因工程技術(shù)的全部過程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段與基因載體的體外連接、外源基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞和目標(biāo)基因的表達(dá)等主 要環(huán)節(jié)。運(yùn)用基因工程進(jìn)行定向育種的新技術(shù)定點(diǎn)突變(sitespecific mutagenesis或sitedirected mutagenesis)是指在目的DNA片斷(例如：一個(gè)基因)的指定位點(diǎn)引入特定的堿基對(duì)的技術(shù)，其包括寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、盒式誘變以及以PCR為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變。近十年來，定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了長足的發(fā)展，并且在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了很多新技術(shù)。例如：重疊延伸PCR法(Overlap Exten

6、sion PCR簡(jiǎn)稱EOPCR)、大引物PCR法(Megaprimer PCR)、一步重疊延伸PCR(OnestepOverlap Extension PCR，簡(jiǎn)稱OOEPCR)、單管大引物PCR(Singletube Megaprimer PCR)、快速定點(diǎn)誘變法、多位點(diǎn)環(huán)狀誘變法TAMS(Targeted Amplification of Mutant Strand)定點(diǎn)誘變技術(shù)。在這些技術(shù)中，單管大引物PCRTAMS定點(diǎn)誘變技術(shù)最為簡(jiǎn)單和適用，并得到廣泛的應(yīng)用。TAMS定點(diǎn)誘變技術(shù) 2003年，Young等報(bào)道了一種有目的地?cái)U(kuò)增突變鏈的定點(diǎn)誘變技術(shù)(Targeted amplificat

7、ion of mutant strand，TAMS)。該技術(shù)能夠一次引入多個(gè)位點(diǎn)的突變，并且能夠有目的地?cái)U(kuò)增突變鏈，從而使突變效率幾乎達(dá)到100。定點(diǎn)突變技術(shù)已在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能改造上取得了很大成功。例如，利用定點(diǎn)突變改變酪氨酰-tRNA合成酶的活性中心，從而使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中加入二硫鍵，顯著提高了該酶的穩(wěn)定性。3.易錯(cuò)PCRDNA聚合酶在進(jìn)行擴(kuò)增目的DNA時(shí)會(huì)以一定的頻率發(fā)生堿基錯(cuò)配，這一現(xiàn)象恰好提供了一種對(duì)特定基因進(jìn)行隨機(jī)誘變的可能方法。利用PCR過程中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配進(jìn)行特定基因隨機(jī)誘變的技術(shù)就稱為易錯(cuò)PCR(Error_prone PCR，簡(jiǎn)稱EPPCR)。此方

8、法的原理與操作如圖3，其操作過程是在Taq DNA聚合酶催化的PCR反應(yīng)體系中，利用Mn替代天然的輔助因子Mg，使Taq DNA聚合酶缺乏校對(duì)活性，同時(shí)使反應(yīng)體系中各種dNTP的比例失衡，因此導(dǎo)致堿基的錯(cuò)配率大大增加，通常約為0.1。另外，還可以在該反應(yīng)體系中加入dITP等三磷酸脫氧核苷類似物來控制錯(cuò)配水平。這種方法可以將錯(cuò)配率最大提高至20?？讟s等利用易錯(cuò)PCR使D-海因酶對(duì)底物的水解活性提高了2.4倍；黃瑛等用易錯(cuò)PCR使短小芽孢桿菌YZ02脂肪酶活性提高了1.31倍，Km值由8.24mmol/L降低至7.717mmol/L，在pH8.0時(shí)的穩(wěn)定性也較野生型脂肪酶有所提高。DAN重排DNA

9、重排(DNA shufling)技術(shù)是一種利用重組文庫的體外定向進(jìn)化技術(shù)，Stemmer于1993年首先提出。Figure 4 The principle and operation process of DNA shuffling Zhao等在此基礎(chǔ)上發(fā)明了一種更加簡(jiǎn)化交叉延伸程序( STEP)。此技術(shù)是在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中以2個(gè)以上相關(guān)的DNA片段為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物先在一個(gè)模板鏈上延伸，隨之進(jìn)行多輪變性、短暫復(fù)性(延伸)過程。在每一輪PCR循環(huán)中，那些部分延伸的片段可以隨機(jī)地與含不同突變的模板進(jìn)行雜交，使延伸繼續(xù)，并由于模板轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復(fù)進(jìn)行直到獲得全長基因

10、片段，重組的程度可以通過調(diào)整時(shí)間和溫度來控制。此方法省去了將DNA酶切成片段這一步，致使DNA重排方法進(jìn)一步簡(jiǎn)化。近幾年來，提高DNA重排技術(shù)捕獲變異的能力一直是研究人員努力的方向。Ostermie等以核酸外切酶代替DNaseI對(duì)靶序列進(jìn)行消化，發(fā)明了遞減法建立雜交酶技術(shù)（ITCHY)，使得非同源性序列間也能發(fā)生重排，擴(kuò)大了該技術(shù)的用途。Hiraga等開發(fā)的SISDC技術(shù)在組件內(nèi)部引入了限制性內(nèi)切酶識(shí)別標(biāo)記，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶代替DNase I產(chǎn)生重排片段。Bergquist等開發(fā)的DOGS技術(shù)則是根據(jù)保守模體區(qū)序列特征設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，擴(kuò)增出保守同源區(qū)后再用重排操作生成突變富集體。由于此方法是

11、在突變耐受的保守區(qū)直接增加轉(zhuǎn)轍組的幾率，所以其產(chǎn)生的突變頻率大大增加。DNA重排的最大特點(diǎn)是在反復(fù)突變過程中引進(jìn)了重組這一自然進(jìn)化中最重要的過程，而且其對(duì)可操作的靶序列的長度沒有任何要求，可以達(dá)到幾萬kb。通過多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導(dǎo)致功能的明顯提高，同時(shí)還打破了傳統(tǒng)物種之間由于生殖隔離導(dǎo)致不能重組的界限。4.基因組重排基因組重排(genome shufling)技術(shù)是受DNA重排的啟發(fā)，于2l世紀(jì)出現(xiàn)的全基因組改組技術(shù)。這種技術(shù)將分子定向進(jìn)化的對(duì)象從單個(gè)基因擴(kuò)展到整個(gè)基因組，可以在更為廣泛的范圍內(nèi)對(duì)菌種的目的性狀進(jìn)行優(yōu)化組合。首先，利用經(jīng)典的誘變育種技術(shù)獲得含有目標(biāo)性狀的基

12、因組庫，然后利用原生質(zhì)體融合技術(shù)將這些發(fā)生正向突變的菌株的全基因組進(jìn)行多輪隨機(jī)重組，從而快速篩選表型得到較大改進(jìn)的雜交菌種。該技術(shù)巧妙地采用了多輪循環(huán)原生質(zhì)體融合技術(shù)，將各種親本制成原生質(zhì)體-融合-再生-再制成原生質(zhì)體-融合-再生)，即遞歸原生質(zhì)體融合(recursive protoplast fusion)的方法。Zhang等于2002年首次報(bào)道應(yīng)用基因組重排方法快速地使弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)產(chǎn)生泰樂菌素的能力得到提高。該方法以營養(yǎng)缺陷型為出發(fā)菌株，僅用了1年時(shí)間，通過兩輪基因組改組就從24 000株菌株中分離到2組共14株泰樂菌素高產(chǎn)菌株，其泰樂菌素產(chǎn)量高于

13、通過經(jīng)典誘變育種方法所篩得的生產(chǎn)菌株SF21，而后者(SF21)是用經(jīng)典誘變育種方法在長達(dá)20年的時(shí)間中先后篩選過約1 000 000個(gè)菌株后才獲得的。由此可見，此技術(shù)大大減少了工作量，并縮短了篩選時(shí)間。四川抗菌素工業(yè)研究所的徐波等以產(chǎn)量性狀為標(biāo)記特征，應(yīng)用基因組重排的方法在一年之內(nèi)使替考拉寧產(chǎn)量提高了65.3。2、基因工程育種技術(shù)在大腸桿菌種的應(yīng)用大腸桿菌是迄今為止研究的最為詳盡的原核細(xì)菌，其K-12MG1655株的4 000多kb的染色體DNA已測(cè)序完畢，全基因共含有4 405個(gè)開放閱讀框，其中大部分基因的生物功能已被鑒定。作為一種成熟的基因克隆表達(dá)受體，大腸桿菌被廣泛用于分子生物學(xué)研究的

14、各個(gè)領(lǐng)域，如基因的分離擴(kuò)增、DNA序列分析、基因的表達(dá)產(chǎn)物功能鑒定等。由于大腸桿菌繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制，大腸桿菌的分子遺傳學(xué)背景已相當(dāng)明了，不斷完善的基因操作技術(shù)可將大腸桿菌構(gòu)建成為用于異源蛋白生產(chǎn)的分子工廠。因此，利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌工程菌，以規(guī)?；a(chǎn)真核生物基因尤其是人類基因的表達(dá)產(chǎn)物，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值?，F(xiàn)在已有100多種異源蛋白通過大腸桿菌基因工程菌實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，其中包括一些結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜的人體蛋白，如HAS、pro-UK、MT、M-CSF及Hb等。工業(yè)中常用于生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白如人胰島素、人生長激素、人干擾素、人白細(xì)胞介素和抗體。以下以生產(chǎn)人干擾素為例介紹其應(yīng)用。人干擾素a

15、2b (Human Interferona2b,hIFNa2b)是由165個(gè)氨基酸組成的多肽,具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、修復(fù)DNA結(jié)構(gòu)損傷等作用。hIFNa2b在臨床上廣泛應(yīng)用,對(duì)肝炎、呼吸道病毒感染、皰疹病毒感染等均具有治療作用。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長快速、發(fā)酵成本低、表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn),是生產(chǎn)外源蛋白的理想表達(dá)體系。在大腸桿菌溫度誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白的發(fā)酵過程中,如何控制升溫誘導(dǎo)后菌體的生長,提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率,是實(shí)現(xiàn)高密度高表達(dá)的關(guān)鍵。本文采用大腸桿菌BL21(pBAI)表達(dá)hIFNa2b,其表達(dá)通過溫控型PL啟動(dòng)子調(diào)控?？疾炝搜a(bǔ)料方式對(duì)hIFNa2b生產(chǎn)速率的影響,hIFNa2b表達(dá)

16、水平達(dá)到6 540 mg/L。參考文獻(xiàn)：1 張惠展.基因工程.上海: 華東理工大學(xué)出版社,2005,82 朱筠,李志敏,張倩,甘人寶,葉勤.重組大腸桿菌BL21(pBAI)生產(chǎn)人干擾素a2b.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào),2008,3(2):184-1883 聶明,李懷波,萬佳蓉,周傳云.工業(yè)微生物遺傳育種的研究進(jìn)展.現(xiàn)代食品科技，2005,21(3):184-1874 王參軍,鄒文藝,張玲,范清林,宋禮華. 突變?nèi)烁蓴_素-2b基因5端提高其在大腸桿菌中的表達(dá).安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,45(2):149-1535 代云見,王明蓉,杜天飛.微生物基因工程育種技術(shù)的研究進(jìn)展.藥研動(dòng)態(tài)(國外醫(yī)藥抗生素分冊(cè))

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18、. coli BL21(DE3)BF-dcm ompT hsdS (r-Bm-B) gal(DE3),重組質(zhì)粒為pBAI,帶有氨芐青霉素耐藥性標(biāo)記,hIFNa2b基因表達(dá)受PL啟動(dòng)子和質(zhì)粒cI857編碼的蛋白調(diào)控。培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L,酵母抽提物5 g/L,NaCl 10 g/L),滅菌后加入100 mg/L氨芐青霉素鈉。分批發(fā)酵培養(yǎng)基為含葡萄糖5 g/L的LB培養(yǎng)基。未特別注明的補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)基均為含葡萄糖5 g/L的2LB培養(yǎng)基(蛋白胨20 g/L,酵母抽提物10 g/L,NaCl 10 g/L),補(bǔ)料液為400 g/L的葡萄糖。培養(yǎng)基配制所用蛋白胨和酵母抽

19、提物均為Oxoid產(chǎn)品,其余試劑為國產(chǎn)分析純,采用去離子水配制。2.1.2 培養(yǎng)方法種子培養(yǎng) 從-20C保藏的甘油管中取出1ml菌液,接入裝有30 ml種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶,于搖床200 r/min,30C下培養(yǎng)10 h,為一級(jí)種子;將一級(jí)種子以1.5%的接種量轉(zhuǎn)接至裝有70 ml LB培養(yǎng)基的500 ml錐形瓶中,相同條件培養(yǎng)9 h,為二級(jí)種子。發(fā)酵罐培養(yǎng) 將二級(jí)種子以6%的接種量接入5 L發(fā)酵罐(RIBE-5型)中。培養(yǎng)液裝量為2.5 L，生長階段控制溫度30C,表達(dá)階段控制溫度42C，發(fā)酵過程中控制pH為7.0,通氣量4 L/min，初始攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min,發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)速逐漸提高以維持溶氧大于20%。補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程中,初始葡萄糖耗盡后采用3種不同的葡萄糖流加方式，即恒pH流加、恒速流加、恒比供應(yīng)速率流加。恒pH方式為當(dāng)pH超過7.0時(shí)自動(dòng)補(bǔ)入葡萄糖；恒速流加以5.4 g/(Lh)的速率流加葡萄糖；恒比供應(yīng)速率(QG)為0.27 g/(gh)，每小時(shí)根據(jù)菌體濃度調(diào)整葡萄糖的流加速率。2.1.3 測(cè)定方法菌體濃度測(cè)定采用濁度法,測(cè)定波長600 nm處的光密度(OD600),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌體干重。葡萄糖測(cè)定采用葡萄糖測(cè)定試劑盒(上?？菩郎锛夹g(shù)研究所)測(cè)定。乙酸測(cè)定采用氣相色譜法5。hIFN