第15章細(xì)胞破碎

1、第15章細(xì)胞破碎生物分離過程的一般流程本章內(nèi)容2常見的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)細(xì)胞破碎技術(shù)包涵體的純化方法本章的主要內(nèi)容3概述不同類型的細(xì)胞分泌目標(biāo)產(chǎn)物的類型：動物細(xì)胞多分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)液植物細(xì)胞多為胞內(nèi)產(chǎn)物微生物（細(xì)菌/酵母/真菌）胞內(nèi)、胞外 對于胞內(nèi)產(chǎn)物需要收集菌體或細(xì)胞進(jìn)行破碎。4概述大多數(shù)情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目標(biāo)產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中。有些目標(biāo)產(chǎn)物存在于生物體中。尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質(zhì)是在細(xì)胞內(nèi)沉積。脂類物質(zhì)和一些抗生素包含在生物體中。5概 述細(xì)胞破碎（cell rupture）技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)。細(xì)胞破碎

2、技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。為了研究細(xì)胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各種微生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)。615.1 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)對破碎的影響微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞外層均為細(xì)胞壁，細(xì)胞壁里面是細(xì)胞膜，動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜。通常細(xì)胞壁較堅(jiān)韌，細(xì)胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細(xì)胞破碎的阻力主要來自于細(xì)胞壁。不同細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不完全相同，故細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度不同，細(xì)胞破碎的難易程度也就不同。7細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)幾乎所有細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由肽聚糖組成，它是難溶性的聚糖鏈；相鄰聚糖鏈上的短肽又交叉相聯(lián)，構(gòu)成了細(xì)胞壁的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細(xì)胞周圍；使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)度

3、。8細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破碎細(xì)菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏陽性菌有很大不同。 革蘭氏陰性菌典型的生物是大腸桿菌，通過這種細(xì)胞生產(chǎn)了很多細(xì)胞重組的產(chǎn)物。藥物名稱宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長激素大腸桿菌治療侏儒病-干擾素大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病等9 酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的形狀，上面的是一層糖蛋白，最外層是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯鍵連接成網(wǎng)狀。在該層的內(nèi)部，有甘露聚糖-酶的復(fù)合物。破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決

4、定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。10真菌的細(xì)胞壁真菌的細(xì)胞壁較厚，主要由多糖組成，其次還含有較少量的蛋白質(zhì)和脂類。不同的真菌，細(xì)胞壁的組成有很大的不同，其中大多數(shù)真菌的多糖壁是由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成，少數(shù)含纖維素。與酵母和細(xì)菌的細(xì)胞壁一樣，真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度和聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，不僅如此，它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以強(qiáng)度有所提高。11紅面包霉菌細(xì)胞壁具有同心圓層狀結(jié)構(gòu)主要存在三種聚合物最外層(a)是-和-葡聚糖的混合物，第2層(b)是糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)第3層(c)主要是蛋白質(zhì)，最內(nèi)層(d)主要是幾丁質(zhì)。紅面包霉菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖12微生物革蘭氏陽性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌酵母菌霉菌壁厚

5、20-80 nm10-13 nm100-300nm100-250nm層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖(1-4%)肽聚糖 (5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白質(zhì)(6-8%)脂類(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂類蛋白質(zhì)細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)微生物革蘭氏陽性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌酵母菌真菌壁厚20-80 nm10-13 nm100-300nm100-250nm層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖(1-4%)肽聚糖 (5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂

6、蛋白質(zhì)葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白質(zhì)(6-8%)脂類(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂類蛋白質(zhì)細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)13植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)對于已生長結(jié)束的植物細(xì)胞壁可分為初生壁和次生壁兩部分。初生壁是細(xì)胞生長期形成的。初生壁一般較?。?3m），富有彈性。由多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，多糖主要成分為纖維素、半纖維素和果膠類物質(zhì)。纖維素是長鏈D-葡聚糖，許多這樣的長鏈形成微纖絲。它是構(gòu)成細(xì)胞壁的骨架，細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度主要來自于微纖絲。14植物次生細(xì)胞壁 某些植物細(xì)胞，當(dāng)生長停止后，在細(xì)胞質(zhì)和初生細(xì)胞壁之間形成了次生細(xì)胞壁。次生壁一般較厚(4m以上)，常有三層組成。在次生壁中，纖維素和半

7、纖維素含量比初生壁增加很多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則，而且存在木質(zhì)素的沉積。 因此次生壁的形成提高了細(xì)胞壁的堅(jiān)硬性，使植物細(xì)胞具有很高的機(jī)械強(qiáng)度。15研 磨15.2 細(xì)胞破碎技術(shù)16機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲法 物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：表面活性劑：酸堿酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理17一機(jī)械法機(jī)械破碎法又可分

8、為高壓勻漿破碎法（homogenization）高速珠研磨破碎法（bead grinding）超聲波破碎法（ultrasonication）18采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成）。1.高壓勻漿法（High-pressure homogenization）細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)動過程中經(jīng)歷了高速剪切、碰撞及壓力驟降，造成細(xì)胞破碎。1920高壓勻漿器的種類高壓勻漿器的種類較多：WAB公司的AVP Gaulin 31MR型Bran and luebbe 公司SHL40型意大利Niro

9、Soavi高壓勻漿機(jī)21高壓勻漿法使用時注意事項(xiàng)高壓勻漿器的操作溫度上升約-/10MPa為了控制溫度的升高，可在進(jìn)口處用干冰調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在20左右。可以采用單次通過勻漿器或多次循環(huán)通過等方式。在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細(xì)胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。22高壓勻漿法適用的范圍大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法高壓勻漿法適用的范圍：酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎；料液細(xì)胞濃度可以很高，20%左右。不宜使用高壓勻漿法。易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性菌，含有包含體的基因工程菌（因包含體堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥）23影響高壓勻漿器細(xì)胞破碎因素被破碎的細(xì)胞分

10、率符合如下公式： ln1/(1-R)=KNP (15-1) 式中 R 破碎率，為N次循環(huán)后，蛋白質(zhì)的釋放量Rn與最大釋放量Rm之比； K 與溫度有關(guān)的速度常數(shù)； P 操作壓力，MPa； 與微生物種類有關(guān)的常數(shù)。24升高壓力有利于破碎，減少細(xì)胞的循環(huán)次數(shù)，甚至一次通過勻漿閥就可達(dá)到幾乎完全的破碎，這樣就可避免細(xì)胞碎片不至過小。但p大到一定值時對勻漿器的磨損增加，也有實(shí)驗(yàn)表明p超生一定值時，R增加但很慢。在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為5570Mpa。破碎性能還隨菌體種類和生長環(huán)境的不同而不同大腸桿菌的細(xì)胞比酵母細(xì)胞容易破碎，生長在簡單的合成培養(yǎng)基上的大腸桿菌比生長在復(fù)雜培養(yǎng)基上容易破碎。影響高壓勻

11、漿器細(xì)胞破碎因素25高壓勻漿法-X-擠壓器改進(jìn)的高壓方法：將濃縮的菌體懸液冷卻至-25至-30形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體在受壓時的相變，包埋在冰中的細(xì)胞變形所引起的。主要用于實(shí)驗(yàn)室中。優(yōu)點(diǎn)是適用的范圍廣，破碎率高，細(xì)胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高對冷凍一融解敏感的生化物質(zhì)不適用。262）珠磨法 bead mill珠磨是常用的方法細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機(jī)WSK臥

12、式高效全能珠磨機(jī)27高速珠磨機(jī)工作原理磨室內(nèi)放置玻璃小珠，裝在同心軸上的園盤攪拌器高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞懸浮液和玻離小珠相互攪動；細(xì)胞破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料滾動引起在出口處，旋轉(zhuǎn)園盤和出口平板之間的狹縫很小，可阻擋玻離小珠，使不被料液帶出。由于操作過程中會產(chǎn)生熱量，故磨室還裝有冷卻夾套，以冷卻細(xì)胞懸浮液和玻離小珠。28Netzsch LM-20型珠磨機(jī)A-具有冷卻夾套的圓筒形磨室B-具有冷卻裝置的攪拌軸和圓盤C-環(huán)形震動俠縫分離器D-變速馬達(dá)1和2料液進(jìn)出口3和4 攪拌冷卻劑進(jìn)出口5和6磨室冷卻劑進(jìn)出口園盤以兩種位置交錯地安裝在軸上，一種處于徑向，一種與軸傾斜，徑向盤使磨料沿徑向運(yùn)動，傾斜

13、盤則產(chǎn)生軸向運(yùn)動。由于交錯的運(yùn)動，提高了破碎效率。29珠磨機(jī)破碎作用方程破碎作用是相對于時間的一級反應(yīng)速度過程，符合下列公式： ln1/(1-R)=Kt 15-2 R 破碎率；K一 一級反應(yīng)速度常數(shù)；t一 時間。K與攪拌轉(zhuǎn)速、細(xì)胞懸浮液濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠裝量和珠體直徑，以及溫度等相關(guān)。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、減少大分子目的產(chǎn)物的失活、減少由于高破碎率產(chǎn)生的細(xì)胞小碎片不易分離而給后續(xù)操作帶來的困難。303）超聲波破碎超聲波破碎法（Ultrasonication)利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)

14、兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。31超聲波破碎的機(jī)理JY92-II D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)一般認(rèn)為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation),液體中局部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，引起的粘滯性旋渦在細(xì)胞上造成了剪切力，使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細(xì)胞破碎。操作過程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或外部冷卻的容器中進(jìn)行。32超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對酵母菌的效果較差。但超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活

15、性物質(zhì)失活。超聲波破碎的有效能量利用率極低由于對冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，但在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用。33技術(shù)原理效果成本舉例勻漿法(孔型)須使細(xì)胞通過的小孔，使細(xì)胞受到剪切力而破碎劇烈適中細(xì)胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理超聲波法用超聲波的空穴作用使細(xì)胞破碎適中昂貴細(xì)胞懸浮液小規(guī)模處理研磨法細(xì)胞被研磨物磨碎適中便宜勻漿法(片型)細(xì)胞被攪拌器劈碎適中適中動物組織及動物細(xì)胞不同機(jī)械破碎方法的比較34非機(jī)械破碎方法酶溶破碎法（enzyme lysis）化學(xué)破碎法（chemical treatment）去垢劑破碎法（deterge

16、nts）滲透壓沖擊破碎法（osmotic shock）凍融破碎法（freezing and thawing）35二 非機(jī)械法非機(jī)械方法很多1 酶解2 化學(xué)法溶胞3 物理法滲透壓沖擊凍結(jié)和融化干燥法其中酶法和化學(xué)法溶胞應(yīng)用最廣。二36 1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis)酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜。1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等37外加酶法酶解法的特點(diǎn)是專一性強(qiáng)，因此在選擇酶系統(tǒng)時，必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成來選擇。溶菌酶（lyso

17、zyme)能專一性地分解細(xì)胞壁上肽聚糖分子的-1,4糖苷鍵，因此主要用于細(xì)菌類細(xì)胞壁的裂解。革蘭氏陽性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象。但對于革蘭氏陰性菌，單獨(dú)采用溶菌酶無效果，必須與螯合劑EDTA一起使用。放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶，酵母和真菌由于細(xì)胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。38外加酶法有時采用幾種酶的混合物會產(chǎn)生更好的效果，加入時需確定相應(yīng)的次序。 對酵母細(xì)胞采用酶法破碎時，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，

18、再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細(xì)胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。39酶解法的特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：發(fā)生酶解的條件溫和能選擇性地釋放產(chǎn)物胞內(nèi)核酸等泄出量少，細(xì)胞外形較完整缺點(diǎn)：溶酶價格高，溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶)產(chǎn)物抑制的存在。 40酶解-自溶作用 自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續(xù)下去。自溶作用：改變其生長環(huán)境（溫度、緩沖液），可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。缺點(diǎn)是：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，

19、自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。41某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。2 化學(xué)滲透法（Chemical permeation）該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。 42酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。堿能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來。成本低，反應(yīng)激烈，不具選擇性。（1）酸、堿處理法43細(xì)胞破碎常用的表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（SDS，陰離子型）；。非離子型如Triton X-100和吐溫（Tween）等對疏水性物質(zhì)具有很

20、強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。（2）表面活性劑無論表面活性劑是陰離子、陽離子還是非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，能與細(xì)胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解44能分解細(xì)胞壁中的磷脂，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。有機(jī)溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 （3）有機(jī)溶劑（4）EDTA螯合劑處理G-細(xì)菌，對細(xì)胞壁外層有破壞作用。G-細(xì)菌的壁外層結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。45通用性差；時間長

21、，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50%；有些化學(xué)試劑有毒?；瘜W(xué)試劑的加入常會給隨后產(chǎn)物的純化帶來困難， 并影響最終產(chǎn)物純度化學(xué)滲透法特點(diǎn)：缺點(diǎn)對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。優(yōu)點(diǎn)463 物理法滲透壓沖擊法凍結(jié)-融化法干燥法471）滲透壓沖擊法 滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓

22、的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。 僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。48 2）凍結(jié)-融化法 將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。 49使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。

23、氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30的氣流中吹干；真空干燥多用于細(xì)菌。冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)3）干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥5051選擇破碎方法的依據(jù)：細(xì)胞處理量； 細(xì)胞壁強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)(高聚物交聯(lián)程度、種類和壁厚度)；目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性； 破碎程度；目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放52選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物的一般原則僅破壞或破碎存在目標(biāo)產(chǎn)物的位置周圍當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞膜附近時，可采用較混和的方法，如酶溶法、滲透壓沖擊法和凍結(jié)融化法等。當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)時，則需采用強(qiáng)烈的機(jī)械破碎法當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物處于與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合的狀態(tài)時，調(diào)節(jié)溶液PH值，離子強(qiáng)度或添加與目標(biāo)產(chǎn)物具有親和性

24、的試劑如：螯合劑、表面活性劑等，使目標(biāo)產(chǎn)物容易溶解釋放。(2)機(jī)械破碎法和化學(xué)法并用可使操作條件更加溫和，在相同的目標(biāo)產(chǎn)物釋放率條件下，降低細(xì)胞的破碎程度。53 討論題：青霉素?；讣?xì)胞破碎的研究 一. 化學(xué)法 20%(W/V)大腸桿菌懸浮液 + B.A 37攪拌 高速離心 測上清液酶活。1.處理時間 R% 2.5h2. 丁酯用量條件：37 ，攪拌3小時適宜的B.A加量為12% ，釋放率R=55%12%55%R12%2.03U/mg比活54二. 化學(xué)法凍融法結(jié)合 加B.A(12%,37攪拌3h） 菌懸液 凍融(凍結(jié)14h 融化) 釋放率70%；比活2.69 u/mg 三. 化學(xué)超聲波振蕩法結(jié)合

25、 先丁酯處理，再超聲波（90秒），釋放率72% 小型設(shè)備，不能工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。四. 高壓勻漿法 20%(W/V)菌懸液，P=50MPa，N=3。釋放率R=38.4%， 原因:細(xì)胞破碎后,仍有較多酶吸附在細(xì)胞碎片上。五. 高壓勻漿化學(xué)法結(jié)合 先高壓勻漿，再加10%丁酯，37攪拌3h，高速離心(3萬rpm)，釋放率：R=60%六. 珠磨 直徑0.4mm玻璃珠。釋放率：R=95%55破碎率的測定細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。 直接測定法目的產(chǎn)物測定法導(dǎo)電率測定法采用染色法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開來。如破碎的革蘭氏陽性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；采用革蘭氏染色法染色

26、酵母破碎液，完整的細(xì)胞呈紫色，而受損害的細(xì)胞呈亮紅色。將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心，測定上清液中目的產(chǎn)物含量或活性，并與100%破碎率的標(biāo)準(zhǔn)值比較，計(jì)算其破碎率。56破碎技術(shù)的研究方向多種破碎方法相結(jié)合化學(xué)法、酶法、機(jī)械法相結(jié)合。酶法與高壓勻漿、超聲波震蕩、鰲合劑、滲透壓法結(jié)合如用溶解酶預(yù)處理面包酵母，然后高壓勻漿，95MPa壓力下勻漿4次，總破碎率接近100%。而單獨(dú)采用高壓勻漿法，同樣條件下破碎率只有32%。有機(jī)溶劑與凍融法、干燥法結(jié)合57破碎技術(shù)的研究方向-與上游過程相結(jié)合在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基、生長期、操作參數(shù)（如pH、溫度、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、稀釋率等）等因素都對細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成有一

27、定的影響。在生長后期，加入某些能抑制或阻止細(xì)胞壁物質(zhì)合成的抑制劑(如青霉素)，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后，新分裂的細(xì)胞其細(xì)胞壁有缺陷，利于破碎；選擇較易破碎的菌種作為寄主細(xì)胞，如革蘭氏陰性細(xì)菌；用基因工程的方法對菌種進(jìn)行改造，如在細(xì)胞內(nèi)引進(jìn)噬菌體基因，培養(yǎng)結(jié)束后，控制一定條件（如溫度等），激活噬菌體基因，使細(xì)胞自內(nèi)向外溶解，釋放出內(nèi)含物。58破碎技術(shù)研究方向-與下游工程相結(jié)合舉例：萃取破碎法提取酵母醇脫氫酶59（ inclusion bodies IBs)15.4 基因工程包含體的純化基因工程菌培養(yǎng)液不同表達(dá)形式的前處理胞外分泌型表達(dá)：離心,收集液相濃縮純化。胞內(nèi)表達(dá)：胞內(nèi)可溶性表達(dá)：離心,收集菌體細(xì)

28、胞破碎離心，收集上清純化胞內(nèi)周質(zhì)表達(dá)：離心,收集菌體低濃度溶菌酶或滲透壓沖擊等溶解目標(biāo)物離心,收集上清液純化。不溶性包涵體：離心,收集菌體細(xì)胞破碎離心,收集沉淀包涵體洗滌目標(biāo)蛋白變性溶解復(fù)性純化。60外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白外源蛋白的積累人胰島素50%形成包涵體 -丙酰胺酶20%在細(xì)胞間區(qū)-人體干擾素25%形成包涵體凝乳酶原形成包涵體牛生長激素30%形成包涵體 -內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包涵體人胰島素原5%26%形成包涵體61包涵體：一種蛋白質(zhì)不溶性聚集體，包括目標(biāo)蛋白、菌體蛋白等。目標(biāo)蛋白一級結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯誤的，所以沒有生物活性。包涵體的形成：大腸桿菌中目標(biāo)產(chǎn)物的

29、表達(dá)水平過高，超過正常代謝水平，過多表達(dá)產(chǎn)物聚集在細(xì)胞內(nèi)，形成不溶性的包涵體。高表達(dá)產(chǎn)生的積聚物在細(xì)胞內(nèi)部形成不溶物原因？蛋白過量積聚，超過溶解度，導(dǎo)致沉淀；蛋白生成太快，分子間疏水基團(tuán)相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子內(nèi)部二硫鍵的錯誤連接導(dǎo)致沉淀；表達(dá)蛋白過多，與其結(jié)合/誘導(dǎo)組分不足，不能形成溶解狀態(tài) 蛋白質(zhì)自身不穩(wěn)定。包含體的構(gòu)成62基因工程包涵體的純化方法收集菌體細(xì)胞細(xì)胞破碎包涵體的洗滌目標(biāo)蛋白的變性溶解目標(biāo)蛋白的復(fù)性包含體的出現(xiàn)不僅增加了生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為蛋白質(zhì)折疊機(jī)理研究提出了新的課題。欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然

30、活性。63包涵體獲得幾種常見的工藝路線(一)機(jī)械破碎(高壓勻漿、高速珠磨）離心提取包含體加變性劑溶解除變性劑復(fù)性64特點(diǎn):是利用了包含體與細(xì)胞碎片的密度差，用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，獲得了干凈的包含體，再對包含體溶解復(fù)性。優(yōu)點(diǎn)：擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡單了。從這個角度上講，包含體的形成對分離純化亦有好處。缺點(diǎn):要經(jīng)過幾次離心才能除去大部分的細(xì)胞碎片，加工時間較長。路線1 的特點(diǎn)65包涵體獲得幾種常見的工藝路線（二）機(jī)械破碎膜分離獲得包涵體加變性劑溶解包含體除變性劑復(fù)性66 路線（二）應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)是封

31、閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量消耗也比離心法少。缺點(diǎn)：細(xì)胞碎片和包含體一起被膜擋住，難以分開；而且膜的堵塞和濃差極化常常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留。路線2 的特點(diǎn)67包涵體獲得幾種常見的工藝路線（三）化學(xué)破碎（加變性劑）離心除細(xì)胞碎片除變性劑復(fù)性68用化學(xué)法破碎，所采用的試劑既可以破碎又可以溶解包含體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設(shè)備和時間，比前兩者更適合于實(shí)驗(yàn)室操作。缺點(diǎn)是所有的可溶性雜質(zhì)都沒有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給后續(xù)分離帶來困難。 路線三：691）包涵體的洗滌細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復(fù)性時

32、會與目標(biāo)蛋白一起復(fù)性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來困難。洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質(zhì)類雜質(zhì)。洗滌劑濃度以溶解雜質(zhì)，不溶解包涵體中表達(dá)產(chǎn)物為原則。70 2）目標(biāo)蛋白的變性溶解 包涵體中不溶性的目標(biāo)蛋白必須溶解到液相中，才能進(jìn)一步純化。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質(zhì)變性才能使其形成可溶性的形式。 常用變性劑： 5-8 mol/L鹽酸胍和6-8 mol/L尿素, 作用：破壞離子間相互作用； 表面活性劑如1-2 SDS，作用：破壞蛋白質(zhì)肽鏈間的疏水相互作用。 PH9.0的堿溶液和有機(jī)溶劑，使用較少。影響變性因素：時間、p

33、H、離子強(qiáng)度、變性劑種類和濃度。71原理：在變性劑溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)被破壞，但一級結(jié)構(gòu)和共價鍵沒有破壞。當(dāng)部分變性劑被除去后，蛋白質(zhì)會重新折疊成具有活性的正確構(gòu)型，該過程稱復(fù)性。復(fù)性方法：稀釋法除變性劑 加入大量水或緩沖液。膜分離法除變性劑 透析、超濾、電滲析。層析法：凝膠層析，高效疏水層析 3） 目標(biāo)蛋白的復(fù)性72 蛋白質(zhì)復(fù)性影響因素：變性劑濃度目標(biāo)蛋白濃度；pH和離子強(qiáng)度； 氧化還原條件。 還原劑： 二硫蘇糖醇、-巰基乙醇、還原型谷胱甘肽；氧化劑： 氧化型谷胱甘肽; 堿性下通空氣。 復(fù)性區(qū) 多聚物生成區(qū) 絮凝沉淀區(qū)鹽酸胍濃度mol/L紅血球碳酐酶復(fù)性操作中變性劑與蛋白質(zhì)濃度對復(fù)性的影響蛋白質(zhì)濃度 mol/L73腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白在E.coli中的高密度發(fā)酵過程中以兩種形式表達(dá)： 細(xì)胞內(nèi)有活性的可溶性蛋白形式（約占目標(biāo)蛋白的30%） 無活性的包涵體形式（約占目標(biāo)蛋白的7