固定化酶和固定化細胞(2)

1、關于固定化酶與固定化細胞 (2)第一張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1本章講授固定化生物催化劑的概念以及吸附法、包埋法、共價結合法、無載體固定化酶的基本技術和原理；細胞固定化的基本技術和原理；簡要介紹固定化酶基本性質的影響及輔因子的固定化方法和輔酶的再生體系。 第二張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2第三張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月31.酶是蛋白質，穩(wěn)定性差（熱、酸堿、有機溶劑對其有影響）。2.不能回收，使用成本高。3.酶在游離體系中更容易自水解4.分離純化困難，也使產物中混雜酶蛋白 游離酶的缺點：第四張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月4固定化酶（定義）

2、：用物理或化學手段定位在限定的空間區(qū)域，并使其保持催化活性，可重復利用的酶。（1971年在美國召開的第一屆國際酶工程會議）固定化細胞（定義）：將具有一定生理功能的生物細胞（如微生物細胞、植物細胞或動物細胞等），用一定的方法將其固定，作為固體生物催化劑而加以利用的一門技術。固定化細胞意義：用完整的細胞作為生物催化劑，以充分有效地利用生物細胞內的特定酶或多酶系統(tǒng)。 第五張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月5優(yōu)點省去對酶的提取過程，使酶的損失和生產成本降到最低程度；可以利用細胞的多酶系統(tǒng)直接生產有價值的產物。第六張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月6第一節(jié) 酶和細胞的固定化一、固定化酶和

3、細胞的定義及特點二、固定化方法三 細胞的固定化方法四 原生質體的固定化方法第七張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月7一、固定化酶和細胞的定義及特點 1.固定化酶(immobilized enzyme) 通過化學或物理的手段將酶定位于限定的空間區(qū)域內，使其保持活性并可反復利用。 第八張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月8什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術第九張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月9酶固定化方法要求不破壞酶活性中心的構象：酶的固定化不能破壞酶活性中心的構象，盡量防止活性部位的氨基酸殘基受到影響；載體要求：a.固定化的載體應與酶結合較

4、為牢固。B.載體不能與底物、產物等發(fā)生化學反應。C.載體必須有一定的機械強度，防止因機械攪拌而破碎。位阻應該較?。罕M可能不妨礙酶與底物的接近。成本低：酶固定化的成本要盡可能的低。 第十張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月10優(yōu)點：(1)可提高穩(wěn)定性。(2)能回收，易與產物分離，可反復使用。缺點：(1)存在擴散限制。適于催化小分子物質。(2)酶活性下降。第十一張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月11 2. 固定化細胞（immobilized cell） 固定在載體上并在一定空間范圍內進行生命活動（生長、繁殖、新陳代謝）的細胞。第十二張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月12優(yōu)越性

5、：(1)降低成本，省去酶的分離純化工作;(2)既可作為單一酶，也可作為復合酶系 完成部分代謝過程。局限性：(1)細胞內多種酶的存在，會形成不需要的副 產物。(2)細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限制 作用。第十三張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月133.固定化原生質體 意義：(1)固定化原生質體去除了細胞壁的擴散障礙，有利于氧的傳遞，營養(yǎng)成分的吸收和胞內產物的分泌。(2)原生質體不穩(wěn)定，容易破裂，固定化后，由于載體的保護作用，穩(wěn)定性提高。第十四張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月14 二、固定化方法固定化方法（一）酶的固定化方法吸附法共價偶聯(lián)法交聯(lián)法包埋法網格型微囊型離子交換吸附

6、物理吸附法 第十五張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月15依據帶電的酶或細胞和載體之間的靜電作用，使酶吸附于惰性固體的表面或離子交換劑上。1.吸附法（adsorption）第十六張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月16根據吸附劑的特點分: 1）物理吸附法（physical adsortion）作用力：氫鍵、疏水鍵常用載體：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、 硅膠、羥基磷灰石、纖維素等。2）離子結合法（ion binding）作用力：離子鍵常用載體：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM- 纖維素第十七張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月17優(yōu)點：條件溫和，操作簡便，酶

7、活力損失少。缺點：結合力弱，易解吸附。第十八張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月18 借助共價鍵將酶的活性非必需側鏈基團和載體的功能基團進行偶聯(lián)。2.共價偶聯(lián)法（covalent binding or covalent coupling） 第十九張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月19 1）載體：親水載體優(yōu)于疏水載體 如:天然高分子衍生物: 纖維素 葡聚糖凝膠 親和性好，機械性能差 瓊脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 機械性能好，但有疏水結構 尼龍第二十張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月202）偶聯(lián)方法：偶聯(lián)成功與否取決于：載體：功能基團：芳香氨基，羧基，羧甲基等。

8、酶分子:側鏈非必需基團：羧基，巰基，羥基，酚基，咪唑基。第二十一張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月21常用的偶聯(lián)反應有：重氮化法、疊氮法、溴化氰法、烷基化法等。第二十二張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月22優(yōu)點：酶與載體結合牢固，不會輕易脫落，可連續(xù)使用。缺點：反應條件較激烈，易影響酶的空間構象而影響酶的催化活性。 第二十三張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月233.交聯(lián)法（crosslinking） 借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)的固定化方法。雙功能試劑：常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H第二十四張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2

9、4 戊二醛有兩個醛基，均可與酶或蛋白質的游離氨基反應,使酶蛋白交聯(lián)。 此法與共價偶聯(lián)法利用的均是共價鍵，不同之處：交聯(lián)法不使用載體。 第二十五張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月25 交聯(lián)反應既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在分子內。 酶濃度低時，交聯(lián)發(fā)生在分子內，酶仍保持溶解狀態(tài)。 酶濃度高時，交聯(lián)發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)。第二十六張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月26缺點：(1)反應條件激烈，酶分子的多個基團被交聯(lián)，酶活力損失大。(2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來不便。 第二十七張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月274. 包埋法（entrapment） 將酶用物理的

10、方法包埋在各種載體（高聚物）內。分為：網格型：將酶包埋在高分子凝膠細微網格中。微囊型：將酶包埋在高分子半透膜中。第二十八張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月281）網格型包埋法（gel (lattic) entrapment） 又稱凝膠包埋法凝膠包埋條件酶活性強度天然凝膠瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠溫和不變差合成凝膠聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹脂聚合反應部分失活高使用的多孔載體及其特點第二十九張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月29海藻酸鈣凝膠包埋法： 滴至海藻酸鈉溶液E (or cell) CaCl2 溶液中 IE(or IC) 角叉菜膠包埋法： 滴至角叉菜膠E (or cell) K

11、Cl 溶液中 IE (or IC)聚丙烯酰胺凝膠包埋法： APAcr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) TEMED第三十張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月302）微囊型包埋法（microencapsulation）又稱半透膜包埋法 將一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜內 。 半透膜：直徑幾十微米到幾百微米，厚約25nm。 半透膜孔徑80%活性。第五十一張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月51 （三）酶的最適溫度 最適溫度與酶穩(wěn)定性有關。 多數酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升（有例外）。 （四）酶的最適pH 帶負電荷載體 ：最適pH 向堿性偏移。 帶正電

12、荷載體 ：最適pH 向酸性偏移。第五十二張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月52第五十三張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月53 固定化酶的表觀米氏常數Km隨載體的帶電性能變化。 固定化載體與底物電荷相反,固定化酶的表觀Km值降低。 固定化載體與底物電荷相同,固定化酶的表觀Km值顯著增加。（五）酶的動力學特征第五十四張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月54 與自然酶基本相同。但大分子底物難于接近酶分子，導致酶的專一性發(fā)生改變。（六）酶的作用專一性 第五十五張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月55 與固定化酶相比，固定化細胞的情況比較復雜。 （1）有活性升高的現象。（2）

13、穩(wěn)定性的增加 。（3）最適溫度和最適pH常保持不變。二、固定化細胞的性質 第五十六張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月56 (一)酶(細胞)的活力 固定化酶通常呈顆粒狀，一般用于測定自然酶活力的方法改進后才能用于測定固定化酶。 (二) 蛋白總量 1.雙辛可寧酸法(BCA法) 2.考馬斯亮藍法 三、固定化酶（細胞）的評價指標 第五十七張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月57 (三)偶聯(lián)率及相對活力 偶聯(lián)率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力100%活力回收=固定化酶總活力/加入酶的總活力100%相對活力=固定化酶總活力/ (加入酶的總活力-上清液中未偶聯(lián)酶活力)100%第

14、五十八張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月58 (四)半衰期 在連續(xù)測定條件下，固定化酶(細胞)的活力下降為最初活力一半所經歷的連續(xù)工作時間，以t1/2表示。 是衡量穩(wěn)定性的一項重要指標。第五十九張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月59不同固定化方法的比較carriersRecovery of enzyme activity(%) Agar 54.0po1yacrvlamldel5.24Gelatin40.77carragheenan69.13Glutaraldehyde0第六十張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月60第三節(jié) 固定化酶與固定化細胞的應用一、在工業(yè)生產上的應用二

15、、固定化酶在醫(yī)學上的應用三、在分析檢測中的應用第六十一張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月61乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酰 -D Ala 一、在工業(yè)生產上的應用 1. 氨基?；福ˋminoacylase） 世界上第一種工業(yè)化生產的固定化酶第六十二張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月62泵儲罐反應產物離心機消旋反應器固定化酶柱子晶體 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala第六十三張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月63 2.葡萄糖異構酶 世界上生產規(guī)模最大，應用最為成功的一種固定化酶。第六十四張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6

16、月64二、固定化酶在醫(yī)學上的應用 1. 消血栓：纖溶酶是異源蛋白質，在人體內引起免疫反應，無法長期使用。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時間內失活。 用包埋法制備的酶固定化技術可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質能自由進出。第六十五張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月652. 人工腎：原理：將病人血液中的尿素經脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微膠囊活性炭組成人工腎。第六十六張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月66第六十七張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月67酶傳感器 固定化酶和電化學傳感器的結合。 優(yōu)點：既有不溶性酶體系的優(yōu)點，又具有電化學電極的高靈敏度；酶

17、的專一反應性，使其具有較高的選擇性，能夠直接在復雜試樣中進行測定。 三、在分析檢測中的應用第六十八張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月68Sensitive and specific Rapid SimpleBiosensor第六十九張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月69 1967年Updike等采用酶的固定化技術，將葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧電極結合，組裝成了世界上第一個生物傳感器葡萄糖氧化酶電極。第七十張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月70 葡萄糖酶電極 酶電極示意圖D葡萄糖O2 D葡萄糖酸1，5內酯H2O2半透膜酶膠層感應電極第七十一張，PPT共九十四頁

18、，創(chuàng)作于2022年6月71GlucoseGluconic acidGlucose oxidaseOxygenHydrogen peroxideMembraneElectrode 根據反應中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧電極、pH電極和H2O2電極來測定葡萄糖的含量。 第七十二張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月72繼酶傳感器（enzyme sensor）后，又出現：細胞器傳感器（cell organelle sensor）組織傳感器（tissue sensor）微生物傳感器（microbe sensor）免疫傳感器（immunosensor）第七十三張，PPT共九十四

19、頁，創(chuàng)作于2022年6月731）酶傳感器的原理生物傳感器 由生物識別單元（如酶、微生物、抗體等）和物理轉換器相結合所構成的分析儀器。第七十四張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月74第七十五張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月75生物識別元件(Biological recognition element) 是酶、抗原(體)、細胞器、組織切片和微生物細胞等生物分子經固定化后形成的一種膜結構，對被測定的物質有選擇性的分子識別能力。第七十六張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月76 換能器(Transducer) 將識別元件上進行的生化反應中消耗或生成的化學物質，或產生的光或熱等轉換為

20、電信號，并呈現一定的比例關系。第七十七張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月77第七十八張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月78酶傳感器工作原理示意圖酶傳感器主要由固定化酶膜和變換器組成：固定化酶膜：選擇性地“識別”并催化被檢測物質發(fā)生化學反應；變換器：把催化反應中底物或產物的變量轉換成電信號，通過儀表顯示出來。第七十九張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月79第八十張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月802）酶傳感器的應用 水質監(jiān)測 用化學法測定酚時，硫化物、油類等可干擾其測定。 從馬鈴薯中提純、經吸附交聯(lián)得到的固定化多酚氧化酶與氧電極構成酚傳感器，可檢測大多數酚類化合物

21、。第八十一張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月81德國研發(fā)的環(huán)境廢水BOD分析儀第八十二張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月82醫(yī)療方面葡萄糖傳感器和血糖測定儀 用葡萄糖氧化酶（glucose oxidase,GOD）制成葡萄糖傳感器，可測定血液中葡萄糖濃度。 第八十三張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月83手掌型葡萄糖(glucose)分析儀第八十四張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月84SBA-50型單電極生物傳感分析儀第八十五張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月85SBA-70型血糖乳酸自動分析儀第八十六張，PPT共九十四頁，創(chuàng)作于2022年6月86食品鮮度魚鮮度傳感器 在日本、加拿大等國廣泛用于魚類鮮度的測定。魚死后體內ATP經酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黃嘌呤和尿酸。鮮度可用K值表示：K=肌苷+