第五章體外培養(yǎng)基本技術(shù)

1、第五章體外培養(yǎng)基本技術(shù)一、培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要（一）無(wú)菌操作 防止污染是決定培養(yǎng)成敗的首要條件。（二）培養(yǎng)前準(zhǔn)備 操作野消毒 洗手和著裝 火焰消毒（三）培養(yǎng)操作：動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，東西擺放在 正確位置，防止污染。 二、基本培養(yǎng)操作技術(shù)（一）取材： 含有維持液或BSS的無(wú)菌標(biāo)本瓶 。 除去組織表面上的血塊和血跡，尤其開(kāi) 放性器官來(lái)源的組織。 超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行操作。 1cm3組織塊。 取材后立即培養(yǎng)，否則4保存，以不超 過(guò)6h 為宜。（二）組織的分離 原則： 獲取單細(xì)胞 同時(shí)盡可能不損傷細(xì)胞 常用方法 機(jī)械法化學(xué)法 1離心分離法：適用于血液、羊水、胸腹水細(xì) 胞的培養(yǎng)。注意： 低速離心，通常50010

2、00 rpm/min， 510min. 懸液量大時(shí)，離心時(shí)間 適當(dāng)延長(zhǎng)。 淋巴細(xì)胞分層液適用于分離血中淋巴細(xì)胞。 利用各種血細(xì)胞比重不同，使各類細(xì)胞相 互分開(kāi)。 微量全血法LC培養(yǎng)時(shí)，不必進(jìn)行 LC分離。 根據(jù)組織種類和培養(yǎng)要求，采用相應(yīng)的分離手段： 2切割分離法：用眼科剪剪切或手術(shù)刀切割。 組織塊培養(yǎng)時(shí)，剪切成1mm3大小的組織塊。 所取組織多為1cm3，注意用Hanks液漂洗。 3機(jī)械分散法： 擠壓法：適用于軟組織（如腦組織），用注 射器粉碎組織。 不銹鋼紗網(wǎng)（1mm、100m、20m網(wǎng)眼）壓取法：僅適用于處理軟組織，對(duì)較硬組織和纖維組織效果不好，網(wǎng)眼越小對(duì)組織的損傷越大。 4. 消化分離

3、法： 在把組織剪切成較小體積的基礎(chǔ)上，應(yīng)用生化和化學(xué)手段進(jìn)一步分散小塊組織的方法最終使被處理的組織分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液進(jìn)一步培養(yǎng)。 （1）胰蛋白酶消化法： 與胰酶不同（胰酶除蛋白酶外， 還 包括淀粉酶和脂肪酶）適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織， 如胚胎組織、上皮組織、肝、腎等 組織； 對(duì)單層細(xì)胞的作用也較好，適用于細(xì) 胞傳代。 對(duì)纖維性組織和較硬的癌組織的消化作用 較差。 Ca2+、Mg2+對(duì)胰蛋白酶的活性有一定的抑 制作用，故需用D-Hanks液配制。 血清可抑制胰蛋白酶的活性，因此細(xì)胞傳 代時(shí)，用胰蛋白酶消化細(xì)胞后，不必用 Hanks 沖洗。 兩種消化方法 溫消化：37，30m

4、in 1h 冷消化：4 ，1220h胰蛋白酶消化細(xì)胞法如下： 剪切：在去除不需要的組織后，使用無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織塊，重復(fù)清洗2到3次。用無(wú)菌的解剖刀和剪子把組織切成1-2mm3小塊。把組織塊置入容器內(nèi)，加入比組織量多3050倍的 的胰蛋白酶（預(yù)溫至37）。 消化： 37水浴或溫箱中消化3060min，每隔5 10min搖動(dòng)1次；或在4孵育12到20小時(shí)，使胰蛋白酶盡可能滲透進(jìn)去消化完畢，移入離心管中，800轉(zhuǎn)/分 離心6 8min，吸除上清液Hanks液漂洗2 3min，離心去上清，兩次800轉(zhuǎn)/分 離心5min，去上清，加入一定量營(yíng)養(yǎng)液，通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)（100-200目）過(guò)濾，計(jì)

5、數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng) （2）膠原酶（Collagenase）消化法： Collagenase是一種由細(xì)菌提取出的酶，適用消化纖維組織、癌組織和上皮組織。消化作用緩和，無(wú)需振蕩。 使用濃度200u/ml或，可與胰蛋白酶混合應(yīng)用 。 用無(wú)菌解剖刀和剪子把漂洗干凈的組織切成1-5mm3小塊，移入培養(yǎng)瓶中，加入一定量培養(yǎng)液，再加入膠原酶，終濃度為200u/ml37孵育4 48小時(shí)；如消化緩慢可延長(zhǎng)到 3 5 天，無(wú)需搖動(dòng)，可換液1次如見(jiàn)組織塊變軟，散于瓶底，振蕩后即散成細(xì)胞團(tuán)和單個(gè)細(xì)胞，取培養(yǎng)液低速離心5min，去上清；重懸于BSS中，再低速離心5min，去上清膠原酶消化過(guò)程如下：加入新培養(yǎng)液制成細(xì)

6、胞懸液，計(jì)數(shù)后，接種進(jìn)行培養(yǎng) Trypsin Collagenase 消化特性 適應(yīng)于消化軟組織 消化纖維多的組織使用濃度 消化時(shí)間 2h 112hpH 8作用強(qiáng)度 強(qiáng)烈 緩和細(xì)胞影響 時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有影響 無(wú)大影響血清抑活 有 無(wú)Ca2+和Mg2+ 有影響 無(wú)影響 (3) EDTA消化法：非酶性消化物，用無(wú)Ca2+、Mg2+液體配制成 0.02% 的工作液。 螯合組織生存環(huán)境中的Ca2+、Mg2+，促進(jìn)細(xì)胞相互 分離。與胰蛋白酶按1：1或2：1比例混合使用，消化作用更好 EDTA消化細(xì)胞后，一定要用Hanks液沖洗干凈，因培 養(yǎng)環(huán)境中殘留的EDTA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有不良影響。 作用比胰蛋白酶緩和，消化傳

7、代細(xì)胞，不用來(lái)消化新鮮 組織 。（三）細(xì)胞計(jì)數(shù)法 以細(xì)胞數(shù)/毫升表示 1細(xì)胞活力檢查：0.4%Trypan Blue（臺(tái)盤藍(lán)） 與細(xì)胞懸液按1：10比例混合，健康的活細(xì) 胞胞體完整，透明不著色，凡著色細(xì)胞均 為不健康細(xì)胞。 2細(xì)胞計(jì)數(shù)： 如偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)數(shù)10%，說(shuō)明消化不充分，細(xì)胞數(shù)少于200個(gè)/10mm2或大于500個(gè)/10 mm2說(shuō)明稀釋不當(dāng)。 3. 結(jié)果分析 細(xì)胞死亡后，細(xì)胞膜通透性增加，臺(tái)盤藍(lán)進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞藍(lán)染。 臺(tái)盤藍(lán)染色法是一種粗略檢測(cè)細(xì)胞存活的方法，不能準(zhǔn)確反映細(xì)胞活力差異。 細(xì)胞活力（%）（總細(xì)胞數(shù)著色細(xì)胞數(shù)）總細(xì)胞數(shù)100%4.

8、 注意事項(xiàng)：含有臺(tái)盤藍(lán)的細(xì)胞懸液不宜放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則正常細(xì)胞可攝取染料，影響染色結(jié)果。(三) 細(xì)胞凍存1 原理：不附加任何條件下，直接凍存細(xì)胞 時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的水會(huì)結(jié)成冰晶， 能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一系列變化，如機(jī) 械損傷、電解質(zhì)升高，滲透壓改變、 脫水和PH改變等 細(xì)胞死亡。 如向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑甘油或DMSO，可使冰點(diǎn)降低，在緩慢凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi) 水分在凍結(jié)前滲出細(xì)胞外，避免細(xì)胞損傷。2. 材料 儀器設(shè)備：液氮罐、超低溫冰箱（-7085） 凍存管：容量為12ml 消化液：0.25%胰蛋白酶或與0.02%EDTA混合 的消化液 凍存液: 培養(yǎng)液、FBS和DMSO或甘油 待凍存細(xì)胞3

9、注意： （1）細(xì)胞在-50最易受損 （2）為保存細(xì)胞最大存活率，一般都采用慢凍快融的方法，掌握好凍存速度。標(biāo)準(zhǔn)的冷凍速度為-1 -12 /分鐘；當(dāng)溫度下降到-25 時(shí)，下降速度可增至-5 -10 /分鐘；到-100 時(shí)可迅速凍入液氮中。 （3）凍存一年后，應(yīng)再?gòu)?fù)蘇培養(yǎng)1次，然后繼續(xù)凍存。 （4）待凍存細(xì)胞應(yīng)具有較高的活力，即處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。 （5）常溫下DMSO對(duì)細(xì)胞有毒副作用，因此凍存液需在4下放置4060min后使用。4 凍存程序： 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（收集前24h換液1次）離心去上清，加細(xì)胞凍存液密封, 放入液氮，標(biāo)明細(xì)胞名稱、存放日期分裝入2ml無(wú)菌螺口冷凍管，每管細(xì)胞懸液細(xì)胞計(jì)

10、數(shù)：常規(guī)法制成細(xì)胞懸液（107/ml） （四）細(xì)胞的復(fù)蘇 自液氮中取出細(xì)胞凍存管，迅速放入37 水浴離心管吹打、漂洗，5001000rpm離心5min吸出細(xì)胞懸液，補(bǔ)加10ml細(xì)胞培養(yǎng)液again 加適量培養(yǎng)液稀釋（1：10或1：20），分裝細(xì)胞培養(yǎng)瓶（細(xì)胞密度5105個(gè)/ml）37，次日換液【結(jié)果分析】 1. 細(xì)胞存活率 用臺(tái)盤藍(lán)染色法檢測(cè)復(fù)蘇細(xì)胞的活性，細(xì)胞存活率（%）未著色細(xì)胞總計(jì)數(shù)細(xì)胞100% 2. 復(fù)蘇效果取決于復(fù)溫速度?！咀⒁馐马?xiàng)】 1. 必須在12min內(nèi)使凍存液完全融化，如果復(fù)溫速度太慢，則會(huì)造成細(xì)胞損傷。 2. 注意防護(hù)復(fù)蘇后細(xì)胞培養(yǎng)24h培養(yǎng)48h（四）細(xì)胞運(yùn)送兩種方法 1

11、. 液氮或干冰保存，由于二者蒸發(fā)較快，用小 液氮罐較麻煩，只適于空運(yùn)。 2. 充液法 ： 80%90%細(xì)胞匯合時(shí)，換新培養(yǎng)液。 到本實(shí)驗(yàn)室后，留正常量培養(yǎng)液，37培 養(yǎng)，液體分批用。 二、常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法 天然培養(yǎng)基培養(yǎng)法：取自動(dòng)物體內(nèi)天然 成分培養(yǎng)細(xì)胞。 人工合成培養(yǎng)基培養(yǎng)法：合成培養(yǎng)基成 分清楚，便于分析和人工調(diào)控。 合成培養(yǎng)基單細(xì)胞培養(yǎng)為近代主要的培養(yǎng)方法。 特點(diǎn)：組織和細(xì)胞剛剛離體，生物學(xué)性狀尚未發(fā)生很大變化，具有二倍體遺傳性狀。在供體來(lái)源充分、生物條件穩(wěn)定情況下（年齡、性別），在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài)，適于做藥敏試驗(yàn)。初代培養(yǎng)所有機(jī)能上的改變，主要是表型上的改變，不一定是體細(xì)胞突變。

12、初代培養(yǎng)細(xì)胞是研究基因表達(dá)的理想系統(tǒng)。是建立各種細(xì)胞系（株）的必經(jīng)階段。異質(zhì)性，初代培養(yǎng)的組織由多種細(xì)胞混合形成，在分析細(xì)胞生物特性時(shí)有一定困難。 （一）原代培養(yǎng)法：又稱初代培養(yǎng)，是從供體獲取組織 后的首次培養(yǎng)。1. 消化培養(yǎng)法 主要用品： 人或動(dòng)物的新鮮組織 0.25%胰蛋白酶 Hanks液 含10%20%牛血清的培養(yǎng)液 眼科剪刀、眼科鑷 吸管、培養(yǎng)皿、瓶和不銹鋼篩網(wǎng)、計(jì)數(shù)板等。初代細(xì)胞培養(yǎng)主要方法：流程：（注意無(wú)菌操作）15cm3新鮮組織用Hanks液漂洗23次眼科剪將組織剪成約1mm3的小塊加30 50倍原組織塊的0.25%胰蛋白酶液溫消化37，14h 或 冷消化4 ， 624h 不銹鋼

13、網(wǎng)濾過(guò)除去大塊組織所得細(xì)胞懸液5001000rpm低速離心，5min 棄上清，加適量營(yíng)養(yǎng)液（含血清），吹打均勻制成細(xì)胞懸液 計(jì)數(shù)（5105個(gè)/ml），細(xì)胞密度過(guò)大時(shí)，補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)液調(diào)整 37培養(yǎng)，注意PH值（7.2 ） 冷消化 例：乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng) （1）準(zhǔn)備工作： 培養(yǎng)用品消毒后，放在超凈工作臺(tái)內(nèi) 紫外線消毒，做好各項(xiàng)準(zhǔn)備工作. 點(diǎn)燃酒精燈，用品按布局放置，安裝 吸管等 采用頸椎脫臼法，將一只新生乳鼠處死 將小鼠放入盛有70%酒精的燒杯中數(shù)秒 置超凈工作臺(tái)內(nèi)（二）取材： 打開(kāi)消毒器械包 用鑷子掀起乳鼠腹部皮膚,用解剖剪剪開(kāi)腹腔,充分暴露腹腔。 用另一鑷子輕輕夾起腸管,翻置一側(cè),充分暴露位于腹腔

14、背壁脊柱。 取下雙側(cè)腎臟，放入消毒培養(yǎng)皿中 用吸管吸取PBS加入培養(yǎng)皿中，清洗腎臟3次，盡量去掉血污。 將腎組織用解剖剪剪成幾塊，再用PBS漂洗，洗凈血液為止。（3）胰蛋白酶消化： 將洗凈的組織塊移入消毒小瓶中，用眼科剪剪切至0.5 mm 大小的組織塊。 加入1020倍體積的0.25%胰蛋白酶，放入37水浴中消化3060分鐘，注意應(yīng)每隔1015分鐘振搖1次。 當(dāng)組織塊變得疏松，顏色略白時(shí)，取出置于超凈工作臺(tái)內(nèi)用吸管反復(fù)吹打組織塊，使大部分組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)。 加入12ml培養(yǎng)液終止消化，凈置片刻，讓未消化完的組織塊自然下沉，將上部的組織懸液移入無(wú)菌離心管中。（4）離心及計(jì)數(shù) 以8

15、001000r/min低速離心810min，超凈工作臺(tái)內(nèi)開(kāi)蓋，取上清加入適量培養(yǎng)液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后分裝。 在細(xì)胞瓶（板）上標(biāo)明細(xì)胞名稱，代數(shù)，日期。 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞分散情況后置37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（5）細(xì)胞觀察 培養(yǎng)細(xì)胞每天觀察，檢查：A.污染與否? B.細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài) 如見(jiàn)培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且又混濁，為污染；如培養(yǎng)液為桔紅色，表明細(xì)胞狀況良好。在無(wú)污染時(shí)，4h內(nèi)有細(xì)胞貼壁，圓形懸浮狀的細(xì)胞延展成多角型。 培養(yǎng)34天，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，可見(jiàn)細(xì)胞島形成。細(xì)胞透明，顆粒少，界限清。 由于細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，代謝產(chǎn)物堆積，CO2增多，培養(yǎng)液逐漸變酸呈黃色，但液體澄清，此時(shí)應(yīng)換液。胰蛋白酶消化培養(yǎng)法特點(diǎn)：能把組織塊分

16、散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，便于細(xì)胞從培養(yǎng)液中攝取營(yíng)養(yǎng)和排出代謝產(chǎn)物，細(xì)胞能較快長(zhǎng)成單層。尤其適用于培養(yǎng)大量組織，細(xì)胞產(chǎn)量高。用于經(jīng)常性小量培養(yǎng)工作稍顯繁瑣，易污染。2組織塊培養(yǎng)法 不用消化液 盡可能剪碎 兩種技術(shù)： 翻轉(zhuǎn)干涸法（37溫箱中） 薄層營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)法2h（不超過(guò)4h)小塊相互距離以為宜37加入培養(yǎng)液少許 小結(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)步驟： 切取擬培養(yǎng)的動(dòng)物器官或大組織塊 洗去血污 剔除多余成分切成約1mm3大小的組織塊 將所有組織剪碎用于組織培養(yǎng) 蛋白酶溶液消化 機(jī)械方法吹打組織塊 離心、培養(yǎng)液懸浮 計(jì)數(shù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞密度 用于分離細(xì)胞培養(yǎng)（二）傳代培養(yǎng)法： 細(xì)胞達(dá)到80%以上匯合或剛匯合時(shí)是理想的

17、傳代階段。 1. 用品： 80%以上匯合單層細(xì)胞 0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA Hanks液 細(xì)胞培養(yǎng)液 培養(yǎng)瓶 吸管 2流程：棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中舊營(yíng)養(yǎng)液加適量消化液胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大時(shí)終止消化 棄去消化液，加Hanks液輕洗單層細(xì)胞 用吸管吸取營(yíng)養(yǎng)液輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之脫落制成單細(xì)胞懸液 分裝細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 3注意： 掌握好傳代時(shí)機(jī)，80-90%左右匯合最好（過(guò)早細(xì)胞數(shù)量少；過(guò)晚細(xì)胞健康狀態(tài)不佳） 消化時(shí)間適度（過(guò)短細(xì)胞不易從瓶壁脫落；過(guò)長(zhǎng)細(xì)胞脫落流失受影響） 消化液濃度要適宜 不同細(xì)胞對(duì)消化液的反應(yīng)不同三、特殊培養(yǎng)法 1二倍體細(xì)胞培養(yǎng)法：是指培養(yǎng)的細(xì)胞始終

18、維持二倍體生物學(xué)性狀的培養(yǎng)方法。 正常細(xì)胞的原代培養(yǎng)即為二倍體細(xì)胞，但長(zhǎng)期旺盛地增殖生長(zhǎng)，并保持二倍體性狀并非易事。 種細(xì)胞（stock）凍存細(xì)胞（stock-2）使用細(xì)胞凍存細(xì)胞（stock-1）使用細(xì)胞使用細(xì)胞凍存細(xì)胞（stock-2）凍存使用凍存使用凍存使用凍存使用 低溫凍存：措施： 采用妥善的培養(yǎng)方法：嚴(yán)格控制PH，最好在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。換液時(shí)間間隔不能太長(zhǎng)，部分換液。掌握好傳代時(shí)機(jī)，傳代期不能過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞不能過(guò)于密集，應(yīng)及時(shí)傳代。高質(zhì)量血清和培養(yǎng)基，盡量維持不變。每次傳代均一分為二（細(xì)胞數(shù)量、營(yíng)養(yǎng)液量、培養(yǎng)瓶空間和面積不變）進(jìn)行培養(yǎng)。傳代后細(xì)胞如不用于實(shí)驗(yàn)，立即低溫凍存。2加支

19、持物培養(yǎng)法：預(yù)先向培養(yǎng)容器內(nèi)加入各種可使細(xì)胞貼附的支持物，進(jìn)行培養(yǎng)的方法。（1）玻璃片：便于進(jìn)行各種固定、染色處理 和觀察。蓋玻片做支持物的處理：自來(lái)水浸泡24h 96% 酒精3060 min 蒸餾水浸泡30 60min 干凈軟布擦干凈 裝入培養(yǎng)皿 高壓滅菌備用（2）聚四氟乙烯：適于做電鏡技術(shù)，可以進(jìn)行 包埋和切片。 特點(diǎn)： （1）可在任何時(shí)間取出支持物，做各種觀察和實(shí)驗(yàn)。 （2）需將支持物處理干凈，不殘留任何對(duì)細(xì)胞有害成分，避免不利因素影響細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)。3單細(xì)胞分離培養(yǎng)（又稱細(xì)胞克?。?即把單個(gè)細(xì)胞從群體內(nèi)分離出來(lái)單獨(dú)培養(yǎng)，使之重新繁衍成一個(gè)新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。 細(xì)胞經(jīng)克隆后，形成純系

20、，稱細(xì)胞株。要點(diǎn)和原理 細(xì)胞群體單細(xì)胞培養(yǎng)新的細(xì)胞群體純系 基本原則：保證分離出的細(xì)胞確為一個(gè)而不是兩個(gè)或更多。 理論上各種培養(yǎng)細(xì)胞都可進(jìn)行克隆培養(yǎng)，但原代培養(yǎng)細(xì)胞和有限細(xì)胞系（二倍體細(xì)胞）較困難，而無(wú)限細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞則較容易。細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)液的同化作用，具有促克隆細(xì)胞生長(zhǎng)作用。不同細(xì)胞同化營(yíng)養(yǎng)液的能力不同。對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)和具有較強(qiáng)獨(dú)立生存能力的細(xì)胞均易做細(xì)胞克隆。克隆細(xì)胞時(shí)，要把細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，再接種到底物上進(jìn)行培養(yǎng)，讓細(xì)胞單獨(dú)生長(zhǎng)。適應(yīng)性大和活力好的細(xì)胞能增殖形成細(xì)胞小群（Colony)克隆。原理： 無(wú)限細(xì)胞系，不低于10%； 原代細(xì)胞、有限細(xì)胞系，5%。 Coloni

21、ng Efficiency克隆形成率（Coloning Efficiency）： 細(xì)胞群中單個(gè)細(xì)胞形成克隆的百分?jǐn)?shù)稱克隆形成率，也稱接種率（Seeding Efficiency)。用于表示細(xì)胞生活力和獨(dú)立生長(zhǎng)能力?？寺⌒纬陕逝c細(xì)胞的密度成正比 培養(yǎng)基：自制適應(yīng)性培養(yǎng)基是一種不含 細(xì)胞而已被細(xì)胞生活過(guò)或同化過(guò)的培養(yǎng)基。 選取同源指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（半?yún)R合）換培養(yǎng)液1次繼續(xù)培養(yǎng)2448h后，吸取所有培養(yǎng)液3000-4000rpm，離心10min 提高克隆形成率的措施上清用微孔濾膜過(guò)濾（避免形成假克?。蜏貎龃?zhèn)溆糜脮r(shí)取1份適應(yīng)性培養(yǎng)基+2份新配制培養(yǎng)基混合使用血清：胎牛血清小牛血清馬血清，滅活處理56，. 應(yīng)先做克隆形成率實(shí)驗(yàn)，選最佳者使用。激素：含110u/ml的胰島素培養(yǎng)液能促進(jìn)很多 細(xì)胞克隆的形成。CO2：CO2對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞克隆形成率都有提高，多用5%，成纖維細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞2%.飼細(xì)胞（Feeder cells）：也稱滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過(guò)射線照射或絲裂霉素傷害處理的、用作克隆細(xì)胞附著底