第五章體外培養(yǎng)基本技術

1、第五章體外培養(yǎng)基本技術一、培養(yǎng)操作基本要領和要（一）無菌操作 防止污染是決定培養(yǎng)成敗的首要條件。（二）培養(yǎng)前準備 操作野消毒 洗手和著裝 火焰消毒（三）培養(yǎng)操作：動作要準確敏捷，東西擺放在 正確位置，防止污染。 二、基本培養(yǎng)操作技術（一）取材： 含有維持液或BSS的無菌標本瓶 。 除去組織表面上的血塊和血跡，尤其開 放性器官來源的組織。 超凈工作臺內(nèi)進行操作。 1cm3組織塊。 取材后立即培養(yǎng)，否則4保存，以不超 過6h 為宜。（二）組織的分離 原則： 獲取單細胞 同時盡可能不損傷細胞 常用方法 機械法化學法 1離心分離法：適用于血液、羊水、胸腹水細 胞的培養(yǎng)。注意： 低速離心，通常50010

2、00 rpm/min， 510min. 懸液量大時，離心時間 適當延長。 淋巴細胞分層液適用于分離血中淋巴細胞。 利用各種血細胞比重不同，使各類細胞相 互分開。 微量全血法LC培養(yǎng)時，不必進行 LC分離。 根據(jù)組織種類和培養(yǎng)要求，采用相應的分離手段： 2切割分離法：用眼科剪剪切或手術刀切割。 組織塊培養(yǎng)時，剪切成1mm3大小的組織塊。 所取組織多為1cm3，注意用Hanks液漂洗。 3機械分散法： 擠壓法：適用于軟組織（如腦組織），用注 射器粉碎組織。 不銹鋼紗網(wǎng)（1mm、100m、20m網(wǎng)眼）壓取法：僅適用于處理軟組織，對較硬組織和纖維組織效果不好，網(wǎng)眼越小對組織的損傷越大。 4. 消化分離

3、法： 在把組織剪切成較小體積的基礎上，應用生化和化學手段進一步分散小塊組織的方法最終使被處理的組織分散成細胞團或單個細胞制成細胞懸液進一步培養(yǎng)。 （1）胰蛋白酶消化法： 與胰酶不同（胰酶除蛋白酶外， 還 包括淀粉酶和脂肪酶）適用于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織， 如胚胎組織、上皮組織、肝、腎等 組織； 對單層細胞的作用也較好，適用于細 胞傳代。 對纖維性組織和較硬的癌組織的消化作用 較差。 Ca2+、Mg2+對胰蛋白酶的活性有一定的抑 制作用，故需用D-Hanks液配制。 血清可抑制胰蛋白酶的活性，因此細胞傳 代時，用胰蛋白酶消化細胞后，不必用 Hanks 沖洗。 兩種消化方法 溫消化：37，30m

4、in 1h 冷消化：4 ，1220h胰蛋白酶消化細胞法如下： 剪切：在去除不需要的組織后，使用無鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織塊，重復清洗2到3次。用無菌的解剖刀和剪子把組織切成1-2mm3小塊。把組織塊置入容器內(nèi)，加入比組織量多3050倍的 的胰蛋白酶（預溫至37）。 消化： 37水浴或溫箱中消化3060min，每隔5 10min搖動1次；或在4孵育12到20小時，使胰蛋白酶盡可能滲透進去消化完畢，移入離心管中，800轉(zhuǎn)/分 離心6 8min，吸除上清液Hanks液漂洗2 3min，離心去上清，兩次800轉(zhuǎn)/分 離心5min，去上清，加入一定量營養(yǎng)液，通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)（100-200目）過濾，計

5、數(shù)和接種細胞，進行培養(yǎng) （2）膠原酶（Collagenase）消化法： Collagenase是一種由細菌提取出的酶，適用消化纖維組織、癌組織和上皮組織。消化作用緩和，無需振蕩。 使用濃度200u/ml或，可與胰蛋白酶混合應用 。 用無菌解剖刀和剪子把漂洗干凈的組織切成1-5mm3小塊，移入培養(yǎng)瓶中，加入一定量培養(yǎng)液，再加入膠原酶，終濃度為200u/ml37孵育4 48小時；如消化緩慢可延長到 3 5 天，無需搖動，可換液1次如見組織塊變軟，散于瓶底，振蕩后即散成細胞團和單個細胞，取培養(yǎng)液低速離心5min，去上清；重懸于BSS中，再低速離心5min，去上清膠原酶消化過程如下：加入新培養(yǎng)液制成細

6、胞懸液，計數(shù)后，接種進行培養(yǎng) Trypsin Collagenase 消化特性 適應于消化軟組織 消化纖維多的組織使用濃度 消化時間 2h 112hpH 8作用強度 強烈 緩和細胞影響 時間過長有影響 無大影響血清抑活 有 無Ca2+和Mg2+ 有影響 無影響 (3) EDTA消化法：非酶性消化物，用無Ca2+、Mg2+液體配制成 0.02% 的工作液。 螯合組織生存環(huán)境中的Ca2+、Mg2+，促進細胞相互 分離。與胰蛋白酶按1：1或2：1比例混合使用，消化作用更好 EDTA消化細胞后，一定要用Hanks液沖洗干凈，因培 養(yǎng)環(huán)境中殘留的EDTA對細胞生長有不良影響。 作用比胰蛋白酶緩和，消化傳

7、代細胞，不用來消化新鮮 組織 。（三）細胞計數(shù)法 以細胞數(shù)/毫升表示 1細胞活力檢查：0.4%Trypan Blue（臺盤藍） 與細胞懸液按1：10比例混合，健康的活細 胞胞體完整，透明不著色，凡著色細胞均 為不健康細胞。 2細胞計數(shù)： 如偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，按單個細胞計算，若細胞團數(shù)10%，說明消化不充分，細胞數(shù)少于200個/10mm2或大于500個/10 mm2說明稀釋不當。 3. 結果分析 細胞死亡后，細胞膜通透性增加，臺盤藍進入細胞，導致細胞藍染。 臺盤藍染色法是一種粗略檢測細胞存活的方法，不能準確反映細胞活力差異。 細胞活力（%）（總細胞數(shù)著色細胞數(shù)）總細胞數(shù)100%4.

8、 注意事項：含有臺盤藍的細胞懸液不宜放置時間過長，否則正常細胞可攝取染料，影響染色結果。(三) 細胞凍存1 原理：不附加任何條件下，直接凍存細胞 時，細胞內(nèi)外環(huán)境的水會結成冰晶， 能導致細胞發(fā)生一系列變化，如機 械損傷、電解質(zhì)升高，滲透壓改變、 脫水和PH改變等 細胞死亡。 如向細胞培養(yǎng)液中加入保護劑甘油或DMSO，可使冰點降低，在緩慢凍結條件下，能使細胞內(nèi) 水分在凍結前滲出細胞外，避免細胞損傷。2. 材料 儀器設備：液氮罐、超低溫冰箱（-7085） 凍存管：容量為12ml 消化液：0.25%胰蛋白酶或與0.02%EDTA混合 的消化液 凍存液: 培養(yǎng)液、FBS和DMSO或甘油 待凍存細胞3

9、注意： （1）細胞在-50最易受損 （2）為保存細胞最大存活率，一般都采用慢凍快融的方法，掌握好凍存速度。標準的冷凍速度為-1 -12 /分鐘；當溫度下降到-25 時，下降速度可增至-5 -10 /分鐘；到-100 時可迅速凍入液氮中。 （3）凍存一年后，應再復蘇培養(yǎng)1次，然后繼續(xù)凍存。 （4）待凍存細胞應具有較高的活力，即處于對數(shù)生長期的細胞。 （5）常溫下DMSO對細胞有毒副作用，因此凍存液需在4下放置4060min后使用。4 凍存程序： 選取對數(shù)生長期細胞（收集前24h換液1次）離心去上清，加細胞凍存液密封, 放入液氮，標明細胞名稱、存放日期分裝入2ml無菌螺口冷凍管，每管細胞懸液細胞計

10、數(shù)：常規(guī)法制成細胞懸液（107/ml） （四）細胞的復蘇 自液氮中取出細胞凍存管，迅速放入37 水浴離心管吹打、漂洗，5001000rpm離心5min吸出細胞懸液，補加10ml細胞培養(yǎng)液again 加適量培養(yǎng)液稀釋（1：10或1：20），分裝細胞培養(yǎng)瓶（細胞密度5105個/ml）37，次日換液【結果分析】 1. 細胞存活率 用臺盤藍染色法檢測復蘇細胞的活性，細胞存活率（%）未著色細胞總計數(shù)細胞100% 2. 復蘇效果取決于復溫速度?！咀⒁馐马棥?1. 必須在12min內(nèi)使凍存液完全融化，如果復溫速度太慢，則會造成細胞損傷。 2. 注意防護復蘇后細胞培養(yǎng)24h培養(yǎng)48h（四）細胞運送兩種方法 1

11、. 液氮或干冰保存，由于二者蒸發(fā)較快，用小 液氮罐較麻煩，只適于空運。 2. 充液法 ： 80%90%細胞匯合時，換新培養(yǎng)液。 到本實驗室后，留正常量培養(yǎng)液，37培 養(yǎng)，液體分批用。 二、常規(guī)細胞培養(yǎng)法 天然培養(yǎng)基培養(yǎng)法：取自動物體內(nèi)天然 成分培養(yǎng)細胞。 人工合成培養(yǎng)基培養(yǎng)法：合成培養(yǎng)基成 分清楚，便于分析和人工調(diào)控。 合成培養(yǎng)基單細胞培養(yǎng)為近代主要的培養(yǎng)方法。 特點：組織和細胞剛剛離體，生物學性狀尚未發(fā)生很大變化，具有二倍體遺傳性狀。在供體來源充分、生物條件穩(wěn)定情況下（年齡、性別），在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài)，適于做藥敏試驗。初代培養(yǎng)所有機能上的改變，主要是表型上的改變，不一定是體細胞突變。

12、初代培養(yǎng)細胞是研究基因表達的理想系統(tǒng)。是建立各種細胞系（株）的必經(jīng)階段。異質(zhì)性，初代培養(yǎng)的組織由多種細胞混合形成，在分析細胞生物特性時有一定困難。 （一）原代培養(yǎng)法：又稱初代培養(yǎng)，是從供體獲取組織 后的首次培養(yǎng)。1. 消化培養(yǎng)法 主要用品： 人或動物的新鮮組織 0.25%胰蛋白酶 Hanks液 含10%20%牛血清的培養(yǎng)液 眼科剪刀、眼科鑷 吸管、培養(yǎng)皿、瓶和不銹鋼篩網(wǎng)、計數(shù)板等。初代細胞培養(yǎng)主要方法：流程：（注意無菌操作）15cm3新鮮組織用Hanks液漂洗23次眼科剪將組織剪成約1mm3的小塊加30 50倍原組織塊的0.25%胰蛋白酶液溫消化37，14h 或 冷消化4 ， 624h 不銹鋼

13、網(wǎng)濾過除去大塊組織所得細胞懸液5001000rpm低速離心，5min 棄上清，加適量營養(yǎng)液（含血清），吹打均勻制成細胞懸液 計數(shù)（5105個/ml），細胞密度過大時，補加營養(yǎng)液調(diào)整 37培養(yǎng)，注意PH值（7.2 ） 冷消化 例：乳鼠腎細胞原代培養(yǎng) （1）準備工作： 培養(yǎng)用品消毒后，放在超凈工作臺內(nèi) 紫外線消毒，做好各項準備工作. 點燃酒精燈，用品按布局放置，安裝 吸管等 采用頸椎脫臼法，將一只新生乳鼠處死 將小鼠放入盛有70%酒精的燒杯中數(shù)秒 置超凈工作臺內(nèi)（二）取材： 打開消毒器械包 用鑷子掀起乳鼠腹部皮膚,用解剖剪剪開腹腔,充分暴露腹腔。 用另一鑷子輕輕夾起腸管,翻置一側(cè),充分暴露位于腹腔

14、背壁脊柱。 取下雙側(cè)腎臟，放入消毒培養(yǎng)皿中 用吸管吸取PBS加入培養(yǎng)皿中，清洗腎臟3次，盡量去掉血污。 將腎組織用解剖剪剪成幾塊，再用PBS漂洗，洗凈血液為止。（3）胰蛋白酶消化： 將洗凈的組織塊移入消毒小瓶中，用眼科剪剪切至0.5 mm 大小的組織塊。 加入1020倍體積的0.25%胰蛋白酶，放入37水浴中消化3060分鐘，注意應每隔1015分鐘振搖1次。 當組織塊變得疏松，顏色略白時，取出置于超凈工作臺內(nèi)用吸管反復吹打組織塊，使大部分組織塊分散成細胞團或單個細胞狀態(tài)。 加入12ml培養(yǎng)液終止消化，凈置片刻，讓未消化完的組織塊自然下沉，將上部的組織懸液移入無菌離心管中。（4）離心及計數(shù) 以8

15、001000r/min低速離心810min，超凈工作臺內(nèi)開蓋，取上清加入適量培養(yǎng)液，細胞計數(shù)后分裝。 在細胞瓶（板）上標明細胞名稱，代數(shù)，日期。 倒置顯微鏡下觀察細胞分散情況后置37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（5）細胞觀察 培養(yǎng)細胞每天觀察，檢查：A.污染與否? B.細胞生長狀態(tài) 如見培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且又混濁，為污染；如培養(yǎng)液為桔紅色，表明細胞狀況良好。在無污染時，4h內(nèi)有細胞貼壁，圓形懸浮狀的細胞延展成多角型。 培養(yǎng)34天，細胞生長繁殖，可見細胞島形成。細胞透明，顆粒少，界限清。 由于細胞生長旺盛，代謝產(chǎn)物堆積，CO2增多，培養(yǎng)液逐漸變酸呈黃色，但液體澄清，此時應換液。胰蛋白酶消化培養(yǎng)法特點：能把組織塊分

16、散成細胞團或單個細胞，便于細胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)和排出代謝產(chǎn)物，細胞能較快長成單層。尤其適用于培養(yǎng)大量組織，細胞產(chǎn)量高。用于經(jīng)常性小量培養(yǎng)工作稍顯繁瑣，易污染。2組織塊培養(yǎng)法 不用消化液 盡可能剪碎 兩種技術： 翻轉(zhuǎn)干涸法（37溫箱中） 薄層營養(yǎng)液培養(yǎng)法2h（不超過4h)小塊相互距離以為宜37加入培養(yǎng)液少許 小結 動物細胞的培養(yǎng)步驟： 切取擬培養(yǎng)的動物器官或大組織塊 洗去血污 剔除多余成分切成約1mm3大小的組織塊 將所有組織剪碎用于組織培養(yǎng) 蛋白酶溶液消化 機械方法吹打組織塊 離心、培養(yǎng)液懸浮 計數(shù)、調(diào)節(jié)細胞密度 用于分離細胞培養(yǎng)（二）傳代培養(yǎng)法： 細胞達到80%以上匯合或剛匯合時是理想的

17、傳代階段。 1. 用品： 80%以上匯合單層細胞 0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA Hanks液 細胞培養(yǎng)液 培養(yǎng)瓶 吸管 2流程：棄去細胞培養(yǎng)瓶中舊營養(yǎng)液加適量消化液胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大時終止消化 棄去消化液，加Hanks液輕洗單層細胞 用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕吹打瓶壁細胞，使之脫落制成單細胞懸液 分裝細胞培養(yǎng)瓶，37，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 3注意： 掌握好傳代時機，80-90%左右匯合最好（過早細胞數(shù)量少；過晚細胞健康狀態(tài)不佳） 消化時間適度（過短細胞不易從瓶壁脫落；過長細胞脫落流失受影響） 消化液濃度要適宜 不同細胞對消化液的反應不同三、特殊培養(yǎng)法 1二倍體細胞培養(yǎng)法：是指培養(yǎng)的細胞始終

18、維持二倍體生物學性狀的培養(yǎng)方法。 正常細胞的原代培養(yǎng)即為二倍體細胞，但長期旺盛地增殖生長，并保持二倍體性狀并非易事。 種細胞（stock）凍存細胞（stock-2）使用細胞凍存細胞（stock-1）使用細胞使用細胞凍存細胞（stock-2）凍存使用凍存使用凍存使用凍存使用 低溫凍存：措施： 采用妥善的培養(yǎng)方法：嚴格控制PH，最好在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。換液時間間隔不能太長，部分換液。掌握好傳代時機，傳代期不能過長，細胞不能過于密集，應及時傳代。高質(zhì)量血清和培養(yǎng)基，盡量維持不變。每次傳代均一分為二（細胞數(shù)量、營養(yǎng)液量、培養(yǎng)瓶空間和面積不變）進行培養(yǎng)。傳代后細胞如不用于實驗，立即低溫凍存。2加支

19、持物培養(yǎng)法：預先向培養(yǎng)容器內(nèi)加入各種可使細胞貼附的支持物，進行培養(yǎng)的方法。（1）玻璃片：便于進行各種固定、染色處理 和觀察。蓋玻片做支持物的處理：自來水浸泡24h 96% 酒精3060 min 蒸餾水浸泡30 60min 干凈軟布擦干凈 裝入培養(yǎng)皿 高壓滅菌備用（2）聚四氟乙烯：適于做電鏡技術，可以進行 包埋和切片。 特點： （1）可在任何時間取出支持物，做各種觀察和實驗。 （2）需將支持物處理干凈，不殘留任何對細胞有害成分，避免不利因素影響細胞貼附和生長。3單細胞分離培養(yǎng)（又稱細胞克?。?即把單個細胞從群體內(nèi)分離出來單獨培養(yǎng)，使之重新繁衍成一個新的細胞群體的培養(yǎng)技術。 細胞經(jīng)克隆后，形成純系

20、，稱細胞株。要點和原理 細胞群體單細胞培養(yǎng)新的細胞群體純系 基本原則：保證分離出的細胞確為一個而不是兩個或更多。 理論上各種培養(yǎng)細胞都可進行克隆培養(yǎng)，但原代培養(yǎng)細胞和有限細胞系（二倍體細胞）較困難，而無限細胞系、轉(zhuǎn)化細胞系和腫瘤細胞則較容易。細胞對營養(yǎng)液的同化作用，具有促克隆細胞生長作用。不同細胞同化營養(yǎng)液的能力不同。對培養(yǎng)環(huán)境適應性強和具有較強獨立生存能力的細胞均易做細胞克隆?？寺〖毎麜r，要把細胞制備成單細胞懸液，再接種到底物上進行培養(yǎng)，讓細胞單獨生長。適應性大和活力好的細胞能增殖形成細胞小群（Colony)克隆。原理： 無限細胞系，不低于10%； 原代細胞、有限細胞系，5%。 Coloni

21、ng Efficiency克隆形成率（Coloning Efficiency）： 細胞群中單個細胞形成克隆的百分數(shù)稱克隆形成率，也稱接種率（Seeding Efficiency)。用于表示細胞生活力和獨立生長能力?？寺⌒纬陕逝c細胞的密度成正比 培養(yǎng)基：自制適應性培養(yǎng)基是一種不含 細胞而已被細胞生活過或同化過的培養(yǎng)基。 選取同源指數(shù)生長期細胞（半?yún)R合）換培養(yǎng)液1次繼續(xù)培養(yǎng)2448h后，吸取所有培養(yǎng)液3000-4000rpm，離心10min 提高克隆形成率的措施上清用微孔濾膜過濾（避免形成假克?。?，低溫凍存?zhèn)溆糜脮r取1份適應性培養(yǎng)基+2份新配制培養(yǎng)基混合使用血清：胎牛血清小牛血清馬血清，滅活處理56，. 應先做克隆形成率實驗，選最佳者使用。激素：含110u/ml的胰島素培養(yǎng)液能促進很多 細胞克隆的形成。CO2：CO2對絕大多數(shù)細胞克隆形成率都有提高，多用5%，成纖維細胞和膠質(zhì)細胞2%.飼細胞（Feeder cells）：也稱滋養(yǎng)細胞，是一層經(jīng)過射線照射或絲裂霉素傷害處理的、用作克隆細胞附著底