分子生物學(xué)實驗報告(共17頁)

1、圍繞Southern雜交的系列分子實驗分子生物學(xué)實驗報告 題 目:圍繞Southern雜交的系列分子(fnz)實驗 院(系): 創(chuàng)新(chungxn)實驗學(xué)院(xuyun) 專業(yè)年級: 2013級生物技術(shù)基地班 姓 名: 姚國財 學(xué) 號: 2013015417 指導(dǎo)教師: 潘君風(fēng) 2015年7月9日目錄 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc424292279 摘 要 PAGEREF _Toc424292279 h 5 HYPERLINK l _Toc424292280 1.前言(qin yn) PAGEREF _Toc424292280 h 5 HYPERLINK

2、l _Toc424292281 2.實驗(shyn) PAGEREF _Toc424292281 h 5 HYPERLINK l _Toc424292282 2.1 實驗(shyn)材料 PAGEREF _Toc424292282 h 5 HYPERLINK l _Toc424292283 2.2 試劑 PAGEREF _Toc424292283 h 5 HYPERLINK l _Toc424292284 2.2.1RNA分離與純化 PAGEREF _Toc424292284 h 5 HYPERLINK l _Toc424292285 2.2.2 RT-PCR擴增目的基因cDNA PAGERE

3、F _Toc424292285 h 6 HYPERLINK l _Toc424292286 2.2.3 小麥基因組DNA提取、酶切及電泳分析 PAGEREF _Toc424292286 h 6 HYPERLINK l _Toc424292287 2.2.4 質(zhì)粒DNA提取 PAGEREF _Toc424292287 h 6 HYPERLINK l _Toc424292288 2.2.5 質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定 PAGEREF _Toc424292288 h 7 HYPERLINK l _Toc424292289 2.2.6 質(zhì)粒載體和外源DNA的連接反應(yīng) PAGEREF _Toc4

4、24292289 h 7 HYPERLINK l _Toc424292290 2.2.7感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 PAGEREF _Toc424292290 h 7 HYPERLINK l _Toc424292291 2.2.8地高辛標(biāo)記的Southern雜交 PAGEREF _Toc424292291 h 7 HYPERLINK l _Toc424292292 2.3 實驗器材 PAGEREF _Toc424292292 h 8 HYPERLINK l _Toc424292293 2.3.1RNA分離與純化 PAGEREF _Toc424292293 h 8 HYPERLINK l _Toc4

5、24292294 2.3.2 RT-PCR擴增目的基因cDNA PAGEREF _Toc424292294 h 8 HYPERLINK l _Toc424292295 2.3.3 小麥基因組DNA提取、酶切及電泳分析 PAGEREF _Toc424292295 h 9 HYPERLINK l _Toc424292296 2.3.4 質(zhì)粒DNA提取 PAGEREF _Toc424292296 h 9 HYPERLINK l _Toc424292297 2.3.5 質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定 PAGEREF _Toc424292297 h 9 HYPERLINK l _Toc4242922

6、98 2.3.6 質(zhì)粒載體和外源DNA的連接反應(yīng) PAGEREF _Toc424292298 h 9 HYPERLINK l _Toc424292299 2.3.7感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 PAGEREF _Toc424292299 h 9 HYPERLINK l _Toc424292300 2.3.8地高辛標(biāo)記的Southern PAGEREF _Toc424292300 h 9 HYPERLINK l _Toc424292301 2.4 實驗步驟 PAGEREF _Toc424292301 h 10 HYPERLINK l _Toc424292302 2.5實驗(shyn)結(jié)果 PAGERE

7、F _Toc424292302 h 10 HYPERLINK l _Toc424292303 2.6 分析(fnx)討論 PAGEREF _Toc424292303 h 13 HYPERLINK l _Toc424292304 3.總結(jié)(zngji) PAGEREF _Toc424292304 h 14 HYPERLINK l _Toc424292305 4.參考文獻 PAGEREF _Toc424292305 h 15 HYPERLINK l _Toc424292306 5.附 錄 PAGEREF _Toc424292306 h 16圍繞Southern雜交的系列分子實驗作者(zuzh)：姚

8、國財 指導(dǎo)老師：潘君風(fēng)摘 要：Southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列(xli)定位的通用方法。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原則特異性地雜交形成雙鏈。利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)預(yù)雜交的封閉作用，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。地高辛標(biāo)記的Southern雜交實驗是本次分子生物學(xué)實驗的核心環(huán)節(jié)，貫穿(gunchun)整個分子實驗。實驗報告將從獲取不同的目的基因（小麥cDNA，小麥全基因組，小麥

9、PCR基因組，小麥全基因組酶切產(chǎn)物，大腸桿菌質(zhì)粒及其質(zhì)粒PCR，質(zhì)粒酶切產(chǎn)物等），凝膠電泳分離DNA轉(zhuǎn)移到NC膜上，與標(biāo)記的DNA探針雜交這三個方面將本次分子實驗整理匯總成本篇實驗報告。關(guān)鍵詞：southern雜交；DNA提?。籔CR擴增；凝膠電泳1.前言：（略）2.實驗2.1 實驗材料暗培養(yǎng)7天的小麥幼苗（黃化苗），含質(zhì)粒的大腸桿菌P382.2 試劑2.2.1RNA分離與純化Trizol Reagent（Trizol試劑盒）氯仿，異丙醇，70%乙醇(y chn)，DEPC(含有RNA滅活酶)處理(chl)的ddH2O，溴乙錠（EB）10mg/ml，點樣緩沖液Loading buffer(10

10、)（0.25%溴酚藍(lán)，40%甘油(n yu)）。2.2.2 RT-PCR擴增目的基因cDNARNA模板，cDNA引物，反轉(zhuǎn)錄緩沖液，dNTP，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶，RNA抑制劑（RNasin），Taq酶及PCR緩沖液（10），引物（P1、P2）。2.2.3 小麥基因組DNA提取、酶切及電泳分析DNA抽提液（CT-AB）用時將下述三種溶液按1:1:0.4 (V/V)比例混勻，加入亞硫酸氫鈉（3.8g/L），即為抽提液。 DNA extraction（500ml）：31.885g sorbitol(山梨醇)6.05g Tris pH8.2(一般不調(diào)) Nuclei lysis buffer（500ml

11、）: 100ml 1M Tris pH7.5100ml 0.25M EDTA200ml 5M NaCl10g CTAB100ml ddH2O5OOml 5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基鈉鹽)氯仿：異戊醇（24：1） 70%乙醇 異丙醇 HindIII酶 EcoR酶2.2.4 質(zhì)粒DNA提取質(zhì)粒小提試劑盒（天安公司，中國產(chǎn)）LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白(dnbi)胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸餾水中，用NaOH調(diào)pH至7.0。高壓滅菌20分鐘。LB平板培養(yǎng)基：在每1000mL LB液體培養(yǎng)基中中加入(jir)15g瓊脂，高壓滅菌20分鐘。溶液(rngy)：5

12、0mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris-Hcl(pH8.0),冰箱保存，RNA酶要提前加入溶液中；溶液：0.2mol/L NaOH,1%SDS（堿性的NaOH使蛋白質(zhì)變性，SDS結(jié)合變性的蛋白質(zhì)）；溶液：Ph4.8的醋酸鉀溶液（5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml,水28.5ml）；TE緩沖液（pH8.0）：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTAl；無水乙醇和70%乙醇。2.2.5 質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定EcoR酶 DNATBE緩沖液（5）：用時需稀釋10倍點樣緩沖液Loading buffer（10）：0.25%

13、溴酚藍(lán)，40%甘油溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶 （注意：該試劑具致癌作用，用時要小心） 瓊脂糖1%2.2.6 質(zhì)粒載體和外源DNA的連接反應(yīng)目標(biāo)DNA片段（實驗九RT-PCR擴增產(chǎn)物）載體（pGEM-T Easy）2ligation 緩沖液T4 DNA連接酶2.2.7感受態(tài)細(xì)胞(xbo)的制備及轉(zhuǎn)化0.1mol/L CaCl2取20l PCR產(chǎn)物(chnw)進行1.2%瓊脂糖電泳分析。LB液體(yt)培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基氨芐青霉素（100mg/mL）2.2.8地高辛標(biāo)記的Southern雜交1.DIG Random Labeling Mix（高效）2.Anti-DIG-AP Conju

14、gate3.BCIP/NBT Stock Solution 4.Blocking Reagent5.20SSC：0.3M 檸檬酸鈉，3M NaCl6.2SSC：0.03M 檸檬酸鈉，0.3M NaCl7.0.2M EDTA8.變性液：0.5N NaOH，1.5M NaCl9.中和度：0.5M Tris-HCl，pH7.4，3M NaCl10.Standard buffer：5SSC，0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine, 0.02%(w/v) SDS, 1% Blocking Reagent。11.Standard buffer+50% formamide12.Anti-D

15、IG-AP堿性磷酸酶標(biāo)記抗地高辛單抗體13.BCIP/NBT儲備液：14.沖洗液：0.1M Tris-HCl，0.15M NaCl. pH=7.5.15.封閉液：1%Blocking Reagent/ 0.1M Tris-HCl，0.15M NaCl.16.顯色緩沖液：0.1mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH=9.5.17.TE緩沖液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.02.3 實驗(shyn)器材2.3.1RNA分離(fnl)與純化微量加樣器，離心管(1.5ml)，低溫(dwn)離心機(Eppendorf Centrifuge 5424 R)2.3.2 R

16、T-PCR擴增目的基因cDNAPCR擴增（GeneAmpPCRSystem9700,AppliedBiosystems,made in singapore），電泳儀，低溫離心機(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，恒溫水浴鍋2.3.3 小麥基因組DNA提取、酶切及電泳分析PCR擴增（GeneAmpPCRSystem9700,AppliedBiosystems,made in singapore）低溫離心機(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，恒溫水浴鍋，紫外分析儀，微量加樣器2.3.4 質(zhì)粒DNA提取Eppendorf管，離心管，10,100.100

17、0微量加樣器，臺式高速離心機(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，搖床、高溫滅菌鍋。2.3.5 質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定電泳儀系統(tǒng)，紫外燈，恒溫水浴箱2.3.6 質(zhì)粒載體(zit)和外源DNA的連接反應(yīng)低溫(dwn)離心機(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，恒溫(hngwn)移液器，恒溫水浴鍋2.3.7感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化低溫離心機(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，平衡天平(UX620H,Uni Bloc)，無菌操作臺，微量移液器2.2.8地高辛標(biāo)記的Southern雜交臺式低溫離心機(Eppendorf Ce

18、ntrifuge 5424 R)，恒溫水浴鍋，雜交管，玻璃板，磚頭，大型皿，電泳系統(tǒng)，硝酸纖維素膜，分子雜交儀（1339，北京賓達英創(chuàng)科技有限公司）2.4 實驗步驟（略）2.5實驗結(jié)果圖1 小麥RNA1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17注：泳道15是提取(tq)RNA的結(jié)果圖2 小麥(xiomi)RT-PCR1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1720001000500750注：泳道2是小麥(xiomi)RT-PCR的結(jié)果，泳道1是maker跑樣結(jié)果圖3 小麥全基因組與基因組PCR電泳對比1 2 3 4 5

19、 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1720001000500750圖4 基因組PCR產(chǎn)物電泳圖1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314151617181920212220001000500750注：泳道16分別(fnbi)是小麥全基因組和PCR的結(jié)果圖5 Genome & Genome-EcoRI-PCR電泳檢測(jin c)對比結(jié)果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1720007501000注：泳道(yn do)15,16是所得的小麥基因組和Genome-EcoRI-PCR分別的電泳結(jié)果。圖6 菌落P

20、CR電泳結(jié)果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 182000750100020005001000200050010002000500圖7 P38-EcoRI-PCR電泳(din yn)檢測結(jié)果圖7 大腸桿菌(d chn n jn)p381 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17注：泳道15是對于大腸桿菌進行(jnxng)體外擴增后所得電泳圖，泳道16是空白對照組圖8 p38的PCR產(chǎn)物電泳圖1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19200010005007

21、50注：泳道1為marker，泳道15是P38擴增產(chǎn)物的電泳條帶圖9 P38質(zhì)粒1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 172000注：泳道(yn do)1為marker，泳道15為P38質(zhì)粒提取的結(jié)果圖10 southern結(jié)果(ji gu)注：共有(n yu)三組材料，每組有質(zhì)粒DNA和質(zhì)粒PCR的產(chǎn)物轉(zhuǎn)膜得出的結(jié)果。2.6 分析討論圖1 小麥黃化苗提取的RNA顯示有4條條帶，說明RNA至少含有四種不同分子量的RNA，但是所得的條帶較寬，而且跑在前面的兩條條帶不是很清楚，說明存在部分RNA的降解，也可能存在蛋白的污染。圖2 泳道2的結(jié)果與maker對比

22、，所得小麥RT-PCR的分子量約為700，符合理論值。但是條帶遷移不規(guī)律，可能是由于在跑電泳前由于高溫等因素導(dǎo)致DNA變性，也可能是某些cos位點發(fā)生了復(fù)性。圖3和圖4 泳道16的結(jié)果(ji gu)對比maker可得兩條比較清晰條帶，其分子量分別約為1000和500，其中分子量1000的條帶清晰而且較為集中，結(jié)果較好；但是(dnsh)分子量為500的條帶出現(xiàn)了模糊而且寬度較寬的現(xiàn)象，可能是由于(yuy)電泳緩沖液陳舊及DNA上樣量過多造成的。對于基因組PCR結(jié)果分析，對比marker可得其分子量約為800，而且條帶也比較清晰，是基因組中分子量為700多的基因片段擴增而成。圖5 觀察所有的基因組

23、都出現(xiàn)了條帶遷移不規(guī)律且條帶無法聚集的現(xiàn)象，可能是在電泳前發(fā)生了DNA變性，也可能是因為電泳時間過長所引起的。對于Genome-EcoRI-PCR的電泳結(jié)果，對比marker可知其分子量約為700，可知在DNA連接以及變性復(fù)制過程中發(fā)生了部分參與復(fù)制形成子鏈，這樣的結(jié)果是正確的。圖6是P38酶切后電泳圖，泳道15是作為對照的質(zhì)粒，但未跑出條帶，除此之外，從圖中泳道12可以看出其余的酶切條帶較為成功。圖7是p38質(zhì)粒體外擴增的結(jié)果，泳道1是marker，觀察所有的電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)基本所有條帶都比較清晰，而且聚合度也非常好，條帶大都比較亮。但是也出現(xiàn)了條帶出現(xiàn)略微不平行的情況，可能是由于通電時膠為防止平衡的原因。圖8是大腸桿菌P38質(zhì)粒進行PCR擴增后的產(chǎn)物，經(jīng)與marker比較可得其