國家飼料添加劑飼料用復合酶制劑標準

1、 . . . . 19/25 . . DB33浙江省質(zhì)量技術監(jiān)督局 發(fā)布2004-01-01實施2003-12-09發(fā)布飼料添加劑飼料用復合酶制劑Feed additivesComplex enzymatic preparation for feedDB33/T 4592003浙江省地方標準ICS 65.120B 46備案號：14778-2004目 次 TOC f h t 前言、引言標題,附錄標識,參考文獻、索引標題,章標題,附錄章標題HYPERLINK l _Toc83635499前言 PAGEREF _Toc83635499 h IIIHYPERLINK l _Toc83635500引言

2、PAGEREF _Toc83635500 h IVHYPERLINK l _Toc836355011圍 PAGEREF _Toc83635501 h 1HYPERLINK l _Toc836355022 規(guī)性引用文件 PAGEREF _Toc83635502 h 1HYPERLINK l _Toc836355033 術語和定義 PAGEREF _Toc83635503 h 1HYPERLINK l _Toc836355044 產(chǎn)品分類、酶種圍與安全性 PAGEREF _Toc83635504 h 2HYPERLINK l _Toc836355055 要求 PAGEREF _Toc8363550

3、5 h 2HYPERLINK l _Toc836355066 試驗方法 PAGEREF _Toc83635506 h 3HYPERLINK l _Toc836355077 檢驗規(guī)則 PAGEREF _Toc83635507 h 4HYPERLINK l _Toc836355088 標志、標簽 PAGEREF _Toc83635508 h 5HYPERLINK l _Toc836355099 包裝、運輸、貯存 PAGEREF _Toc83635509 h 5HYPERLINK l _Toc83635510A.1原理 PAGEREF _Toc83635510 h 6HYPERLINK l _Toc

4、83635511A.2 試劑和溶液 PAGEREF _Toc83635511 h 6HYPERLINK l _Toc83635512A.3 儀器和設備 PAGEREF _Toc83635512 h 7HYPERLINK l _Toc83635513A.4 測定步驟 PAGEREF _Toc83635513 h 7HYPERLINK l _Toc83635514A.5 酶活力計算 PAGEREF _Toc83635514 h 8HYPERLINK l _Toc83635515A.6 精密度 PAGEREF _Toc83635515 h 8HYPERLINK l _Toc83635516附錄B P

5、AGEREF _Toc83635516 h 9HYPERLINK l _Toc83635517B.1 原理 PAGEREF _Toc83635517 h 9HYPERLINK l _Toc83635518B.2 試劑和溶液 PAGEREF _Toc83635518 h 9HYPERLINK l _Toc83635519B.3 儀器和設備 PAGEREF _Toc83635519 h 9HYPERLINK l _Toc83635520B.4 測定步驟 PAGEREF _Toc83635520 h 10HYPERLINK l _Toc83635521B.5 酶活力計算 PAGEREF _Toc83

6、635521 h 11HYPERLINK l _Toc83635522B.6 精密度 PAGEREF _Toc83635522 h 11HYPERLINK l _Toc83635523附錄C PAGEREF _Toc83635523 h 12HYPERLINK l _Toc83635524C.1 原理 PAGEREF _Toc83635524 h 12HYPERLINK l _Toc83635525C.2 試劑和溶液 PAGEREF _Toc83635525 h 12HYPERLINK l _Toc83635526C.3 儀器和設備 PAGEREF _Toc83635526 h 12HYPER

7、LINK l _Toc83635527C.4 測定步驟 PAGEREF _Toc83635527 h 13HYPERLINK l _Toc83635528C.5 酶活力計算 PAGEREF _Toc83635528 h 14HYPERLINK l _Toc83635529C.6 精密度 PAGEREF _Toc83635529 h 14HYPERLINK l _Toc83635530附錄D PAGEREF _Toc83635530 h 15HYPERLINK l _Toc83635531D.1 原理 PAGEREF _Toc83635531 h 15HYPERLINK l _Toc836355

8、32D.2 試劑和溶液 PAGEREF _Toc83635532 h 15HYPERLINK l _Toc83635533D.3 儀器和設備 PAGEREF _Toc83635533 h 15HYPERLINK l _Toc83635534D.4 測定步驟 PAGEREF _Toc83635534 h 16HYPERLINK l _Toc83635535D.5 酶活力計算 PAGEREF _Toc83635535 h 17HYPERLINK l _Toc83635536D.6 精密度 PAGEREF _Toc83635536 h 17HYPERLINK l _Toc83635537附錄E PA

9、GEREF _Toc83635537 h 18HYPERLINK l _Toc83635538E.1 國際酶活力單位 PAGEREF _Toc83635538 h 18HYPERLINK l _Toc83635539E.2 輕工部行業(yè)標準酶活力單位 PAGEREF _Toc83635539 h 18HYPERLINK l _Toc83635540E.3 國其它資料酶活力單位 PAGEREF _Toc83635540 h 19前 言本標準的附錄A、附錄B、附錄C、附錄D為規(guī)性附錄，附錄E為資料性附錄。本標準由省飼料與動物保健品協(xié)會提出。本標準由省飼料工業(yè)標準化技術委員會歸口。本標準負責起草單位：

10、省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與微生物研究所。本標準參加起草單位：省飼料監(jiān)察所、王景寶飼料股份、長興藍鑫生物技術、長興大洋生物飼料。本標準主要起草人：許堯興、樓洪興、方阿慶、衛(wèi)琴、王有良、宣士榮、汪剛。引 言本標準是針對以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)、含有二種或二種以上主要功效酶成分、經(jīng)配置而成的飼料用復合酶制劑。考慮到市場上的飼料用復合酶制劑品種繁多，等級不一，酶活標示方法各不一樣，故制定本標準，以統(tǒng)一我省飼料用復合酶制劑中主要酶系的酶活力單位定義，相關酶系的酶活力測定方法的與產(chǎn)品中各種酶的最低酶活指標，便于科研、生產(chǎn)、銷售和使用單位的相互交流和使用。產(chǎn)品分類中，飼料用復合酶制劑根據(jù)畜禽種類和日糧類型不同而分為通

11、用、豬用、禽用與水產(chǎn)動物用幾種類型。而每種類型又可根據(jù)具體的日糧或畜禽生長階段細分成若干種類型。適用本標準中飼料用復合酶制劑的主要酶種有：酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木聚糖酶、-葡聚糖酶和纖維素酶。本標準特別強調(diào)了飼料用復合酶制劑的安全性，指出：由發(fā)酵法，特別是固體發(fā)酵法生產(chǎn)獲得的飼料用復合酶的酶源，需說明相應酶種的產(chǎn)生菌種與安全性。采用的產(chǎn)酶菌種應是我國農(nóng)業(yè)部105號公告公布的允許使用的12種飼料級微生物菌種，或應符合食品添加劑使用的菌株為酶源的發(fā)酵菌株。附錄A所述的“蛋白酶活力測定方法”是參照輕工部行業(yè)標準QB1805工業(yè)用蛋白酶制劑的有關規(guī)定執(zhí)行。附錄B、附錄C、附錄D是通過測定幾種非淀粉多

12、糖酶（木聚糖酶、葡聚糖酶、纖維素酶）分解相應底物生成的還原糖來反映幾種酶的總酶活力。附錄E是資料性附錄，將本標準中幾種非淀粉多糖酶的酶活力與國際酶活力與國其它單位表示方法所獲得的酶活力之間的換算。生產(chǎn)者和使用者可根據(jù)不同產(chǎn)品酶活力表示方法，進行相互換算，以資比較。由于飼料用酶制劑基本上采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)，酶系組成、相關濃度和化學結構的不確定性，以與作用底物（飼料原料）的多樣性，各種終產(chǎn)物的不斷形成與反饋控制等因素的影響，因此，各實驗室嚴格按照標準規(guī)定的底物、pH、反應時間與溫度等條件操作是十分重要的。本標準的衛(wèi)生指標部分參照了FAO/WHO下屬的JECF食品添加劑綱要第一卷中食品工業(yè)用酶制劑通

13、則中的“衛(wèi)生指標”,以與國家輕工部行業(yè)標準工業(yè)用酶制劑通用試驗方法中有關食品級酶制劑的衛(wèi)生指標；本標準酶活力的測定，參考了國家有關行業(yè)推薦的方法與國外、省外相關企業(yè)標準的測定方法和國外相關資料，通過反復試驗，修改而成。飼料添加劑飼料用復合酶制劑圍本標準規(guī)定了飼料添加劑飼料用復合酶制劑的術語和定義、產(chǎn)品分類、要求、試驗方法、檢驗規(guī)則和標志、標簽、包裝、運輸、貯存條件。本標準適用于在省境生產(chǎn)、銷售、使用的飼料用復合酶制劑產(chǎn)品。規(guī)性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)

14、議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T 191-2000 包裝、儲運、圖示標志GB/T 5917-1986配合飼料粉碎粒度測定方法GB/T 6435-1986飼料水分的測定方法GB 10648 飼料標簽GB/T 130791999飼料中總砷的測定GB/T 130801991 飼料中鉛的測定方法GB/T 130821991 飼料中鎘的測定方法GB/T 13091-2000 飼料中沙門氏菌的檢測方法GB/T 174801998飼料中黃曲霉毒素B1的測定酶聯(lián)免疫吸附法GB/T 18869-2002 飼料腸菌群的測定QB/T 1803工業(yè)用酶

15、制劑通用試驗方法國家技術監(jiān)督局(1995)第43號令定量包裝商品計量監(jiān)督規(guī)定術語和定義下列術語、定義適用于本標準。飼料用酶制劑 Enzymatic Preparation for Feed飼料用酶制劑是通過產(chǎn)酶微生物發(fā)酵工程或含酶動、植物組織提取技術生產(chǎn)加工而成，具有一種或幾種底物清楚的酶催化活性，有助于改善動物對飼料營養(yǎng)成分的消化、吸收等，并有生物學評定依據(jù)，符合安全性要求，作飼料添加劑用的酶制劑產(chǎn)品。飼料用復合酶制劑 Complex Enzymatic Preparation for Feed產(chǎn)品中含有二種或二種以上主要功效酶成分，這些酶是依據(jù)飼料原料和動物消化生理不同而特定復配，對飼料中

16、多種成分具有酶催化作用的飼料用酶制劑。原料酶 Material Enzyme以微生物為產(chǎn)酶菌種，采用固體發(fā)酵工程途徑生產(chǎn)，經(jīng)低溫干燥所獲得的、未添加任何其它載體的固體酶曲，定義為原料酶。酶活單位 Enzymatic Unite根據(jù)作用底物的不同，對飼料用復合酶中相關酶種的酶活單位作如下定義。蛋白酶 Protanase在（400.2）、相應的pH條件下(酸性蛋白酶pH3.5,中性蛋白酶pH7.0)，在1min水解酪蛋白底物，產(chǎn)生相當于1微克酚類化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，為1個酶活單位，以u/g(u/ml)表示。木聚糖酶 Xylanse在（400.2）、pH 5.0條件下，在1min水解

17、木聚糖底物，產(chǎn)生相當于1微克木糖的還原糖的酶量，為1個酶活單位，以u/g(u/ml)表示。-葡聚糖酶 -glucanase在（400.2）、pH 5.0條件下，在1min水解-葡聚糖底物，產(chǎn)生相當于1微克葡萄糖的還原糖的酶量，為1個酶活單位，以u/g (u/ml)表示。纖維素CMC酶 Cellulase在（400.2）、pH 4.2條件下，在1min水解羧甲基纖維素鈉底物，產(chǎn)生相當于1微克葡萄糖的還原糖的酶量，為1個酶活單位，以u/g(u/ml)表示。飼料用復合酶制劑的分類、酶種圍與安全性 飼料用復合酶制劑的分類飼料用復合酶制劑根據(jù)畜禽種類和日糧類型不同而分為通用、豬用、禽用與水產(chǎn)動物用幾種類

18、型。而每種類型又可根據(jù)具體的日糧或畜禽生長階段細分成若干種類型(詳見表1)。飼料用復合酶制劑的酶種圍適用本標準中飼料用復合酶制劑的主要酶種有：酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木聚糖酶、-葡聚糖酶和纖維素酶。其它酶種可根據(jù)需要適當調(diào)整。飼料用復合酶制劑的安全性由發(fā)酵法，特別是固體發(fā)酵法生產(chǎn)獲得的飼料用復合酶的酶源，需說明相應酶種的產(chǎn)生菌種與安全性。采用的產(chǎn)酶菌種應是我國農(nóng)業(yè)部105號公告公布的允許使用的12種飼料級微生物菌種，或應符合食品添加劑使用的菌株為酶源的發(fā)酵菌株。要求感官指標色澤均勻，無發(fā)霉變質(zhì)、結塊與異味異嗅。酶活力指標飼料用復合酶產(chǎn)品中的酶系與酶活力指標應符合表1規(guī)定。表中所示酶活力指標為產(chǎn)

19、品中最低酶活力指標（以該酶制劑產(chǎn)品在飼料中添加量0.1%計，若添加量大于或小于0.1%,其產(chǎn)品中的相應酶活可適當降低或增加）。表1飼料用復合酶制劑的酶活力指標產(chǎn)品型號產(chǎn) 品 成 份 標 簽 值(u/g)通用小麥型復合酶酸性蛋白酶1000木聚糖酶25000-葡聚糖酶5000纖維素酶2500 通用玉米型復合酶酸性蛋白酶2000 木聚糖酶10000-葡聚糖酶5000纖維素酶1500通用稻谷型復合酶酸性蛋白酶1000木聚糖酶15000纖維素酶3500 乳仔豬用復合酶酸性蛋白酶2500木聚糖酶10000中性蛋白酶1000纖維素酶1000豬用玉米型復合酶酸性蛋白酶2000木聚糖酶10000-葡聚糖酶100

20、00 纖維素酶2000豬用小麥型復合酶酸性蛋白酶1500木聚糖酶25000-葡聚糖酶10000纖維素酶2500豬用大麥型復合酶酸性蛋白酶1000木聚糖酶10000-葡聚糖酶20000纖維素酶2000禽用玉米型復合酶酸性蛋白酶2000木聚糖酶15000-葡聚糖酶10000纖維素酶1200禽用小麥型復合酶酸性蛋白酶1000木聚糖酶20000-葡聚糖酶10000纖維素酶2000肉雞用復合酶酸性蛋白酶1500木聚糖酶15000-葡聚糖酶10000纖維素酶1500蛋雞用復合酶酸性蛋白酶1000木聚糖酶20000-葡聚糖酶10000纖維素酶1500水產(chǎn)動物(甲魚)用復合酶酸性蛋白酶1500中性蛋白酶300

21、0注：以上各產(chǎn)品中的酶系與酶活力指標，可按應用原料的不同作適當調(diào)整。衛(wèi)生指標衛(wèi)生指標應符合表2的規(guī)定。表2飼料用復合酶制劑的衛(wèi)生指標砷，mg/kg,（以As 計）5.0鉛，mg/kg,（以 Pb計）10.0鎘，mg/kg,（以 Cd計）0.5沙門氏菌，不得檢出大腸菌群，MPN/100g3000黃曲霉毒素B1, mg/kg0.05注： 不得檢出國家明令禁止的藥物和物質(zhì)。粒度孔徑0.325mm（60目篩）分析篩篩上物，不大于20%。水分不大于10%。凈含量按國家技術監(jiān)督局（1995）第43號令執(zhí)行。試驗方法感官要求取樣品適量，進行感官檢驗，觀察、嗅聞或觸摸。酶活力蛋白酶活力（酸性、中性）按附錄A測

22、定。木聚糖酶活力按附錄B測定。-葡聚糖酶活力按附錄C測定。纖維素CMC酶活力按附錄D測定。砷（As）按GB/T13079-1999執(zhí)行。 鉛（Pb）按GB/T 13080-1991執(zhí)行。鎘（Cd）按GB/T13082-1991執(zhí)行。沙門氏菌按GB/T 13091-2000執(zhí)行。大腸菌群按GB/T 18869-2002執(zhí)行。黃曲霉毒素B1按GB/T17480-1998執(zhí)行。水分按GB/T6435-1986執(zhí)行。粒度按GB/T5917-1986執(zhí)行。凈含量用適宜感量的衡器進行檢驗。檢驗規(guī)則組批的定義生產(chǎn)廠以每一班次生產(chǎn)且經(jīng)包裝的、具有同樣工藝條件、同一產(chǎn)品名稱、批號、規(guī)格和同樣質(zhì)量證明書的產(chǎn)品為一

23、個組批。取樣方法從每批產(chǎn)品的包裝中隨機抽取。用清潔適用的取樣工具伸入所取樣品的四分之三深處，用交叉法取出足夠量的樣品，將采得的樣品充分混合均勻按四分法縮分至250g，平分裝入兩個清潔、干燥具有密閉性和避光性的具塞樣品瓶中，貼上標簽，注明生產(chǎn)廠名稱、產(chǎn)品名稱、批號、取樣日期等。檢驗分類產(chǎn)品分為出廠檢驗和型式檢驗。出廠檢驗出廠檢驗項目感官指標、酶活力、水分、粒度、凈重。判定方法對抽取的樣品按出廠檢驗項目進行檢驗，如果檢驗結果中有任何一項指標不合格時，應重新取樣進行復檢，取樣圍或樣品數(shù)量為第一次取樣量的兩倍，復檢結果中仍有指標不合格，則整批產(chǎn)品判為不合格，不能出庫。判定結論每批產(chǎn)品應由生產(chǎn)廠質(zhì)量檢驗

24、部門進行出廠檢驗，只有檢驗合格后方可簽發(fā)合格證出廠。型式檢驗型式檢驗項目型式檢驗的樣品必須從出廠檢驗合格產(chǎn)品中隨機抽取。型式檢驗項目為本標準“5要求”中各項指標。型式檢驗的圍有下列情況之一時，應進行型式檢驗：a).審發(fā)生產(chǎn)許可證、產(chǎn)品批準文號時；b).產(chǎn)品的原輔材料、工藝過程與主要設備有較大變化時；c).停產(chǎn)6個月以上，恢復生產(chǎn)時；d).出廠檢驗結果與上次型式檢驗有較大差異時；e).當用戶對產(chǎn)品質(zhì)量有較大異議時。判定方法對抽取的樣品按型式檢驗項目進行檢驗，如果檢驗結果中有任何一項指標不合格時，應重新取樣進行復檢，但衛(wèi)生指標如有一項不合格時，即判為不合格產(chǎn)品，不得復檢。復檢的取樣圍或樣品數(shù)量是第

25、一次取樣的兩倍。復檢結果仍有指標不合格，則判為不合格產(chǎn)品。標志、標簽標志產(chǎn)品的外包裝應有產(chǎn)品名稱、生產(chǎn)廠家、規(guī)格、注冊商標、生產(chǎn)許可證號、產(chǎn)品批準文號、凈重、防潮防曬標志，同時還應注明“飼料添加劑”字樣，并采用鮮明的飼料標簽，符合GB/T 191-2000規(guī)定。標簽按GB10648執(zhí)行。包裝、運輸、貯存包裝產(chǎn)品的包裝需具備：密封、防水、避光、一定的強度要求和一定的包裝規(guī)格等。運輸產(chǎn)品含有生物活性物質(zhì)，光線、溫度、濕度易引起失活。運輸工具必須清潔、干燥，有防雨防曬設施，搬運裝卸小心較放。不得與有毒有害與其它污染物品混裝混運。貯存產(chǎn)品需于陰涼、干燥、避光處貯存。貯存?zhèn)}庫需保持清潔、陰涼、干燥、通風

26、，防受熱、受潮。不得與有毒有害與其它污染物品混貯。保質(zhì)期產(chǎn)品原包裝需注明保質(zhì)期。在本標準規(guī)定條件下，保質(zhì)期為6個月。（規(guī)性附錄）蛋白酶活力的測定方法原理蛋白酶在一定的溫度和pH條件下，水解酪素底物產(chǎn)生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在堿性條件下，將福林試劑（Folin）還原，生成鉬藍與鎢藍，其顏色的深淺與酚基氨基酸含量成正比。通過在660nm測定其吸光度，可得到酶解產(chǎn)生的酚基氨基酸的量，計算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的總酶活力。酶活單位定義在（400.2）、相應的pH條件下(酸性蛋白酶pH3.5,中性蛋白酶pH7.0)，在1min水解酪蛋白底物，產(chǎn)生相當于1微克酚類化合物（由酪氨酸等同

27、物表示）的酶量，為1個酶活單位，以u/g(u/ml)表示。試劑和溶液 除非另有規(guī)定外，試驗中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。1 mol/L與0.1 mol/L鹽酸 (HCl)溶液取濃鹽酸85ml，加水稀釋并定容至1000 ml，即為1mol/L鹽酸溶液；取100ml 1mol/L鹽酸溶液，定容至1000 ml，即為0.1 mol/L鹽酸溶液。1mg/ml L-酪氨酸標準貯備溶液精確稱取預先于105 oC干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，用20ml 左右1mol/L鹽酸l溶解后，再用蒸餾水定容至100ml，即為1mg/ml酪氨酸標準溶液。L-酪氨酸標準使用溶液吸取1mg/ml酪

28、氨酸標準溶液10.0 ml用0.1 mol/L鹽酸定容至100 ml,即得到100 g/ml L-酪氨酸標準液。分別吸取100g/ml L-酪氨酸標準液0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0 ml于10ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，制成每ml分別含L-酪氨酸0g、10g、20g、30g、40g、50g、60 g的標準使用溶液。0.4 mol/L 碳酸鈉（Na2CO3）溶液稱取無水碳酸鈉（Na2CO3）42.4g，用蒸餾水溶解并定容至1000ml。福林（Folin）試劑于2000ml磨口回流裝置中加入鎢酸鈉(Na2WO4.2H2O)100g、鉬酸鈉(

29、Na2MoO4.2H2O)25g、蒸餾水700ml、85%磷酸50ml、濃鹽酸100ml。小火沸騰回流10h，取下回流冷卻器，在通風廚中加入硫酸鋰（ Li2SO4）50g，加蒸餾水50ml和數(shù)滴濃（99%）溴水，再微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有綠色需再加溴水，再煮沸除去過量的溴），冷卻后加蒸餾水定容至1000ml?；靹颉⑦^濾。試劑應呈金黃色，貯存于棕色瓶。使用時，以1份原Folin試劑與2份蒸餾水混勻，制成稀Folin試劑。乳酸緩沖液(pH=3.5),適用于酸性蛋白酶甲液：稱取80%90%乳酸10.6 g，加水稀釋并定容至1000ml。乙液：稱取70%乳酸鈉16 g，加水稀釋并定容至

30、1000ml。使用液：取甲液2份，加乙液1份，再準確稀釋1倍。用pH計校正pH至3.5。磷酸緩沖液（pH=7.0）,適用于中性蛋白酶 甲液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O ）71.64 g, 用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。 乙液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4.2H2O ）31.21 g，用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。. 使用溶液：取甲液610ml，加乙液390ml混合均勻，用pH計校正至pH為（7.0 0.05）,備用。1.0%酪素溶液稱取酪素1.0000g，先用少量（3ml-4ml）濃乳酸濕潤后，（若中性蛋白酶為少量0.5 mol/L氫氧化鈉溶液），再加入相應pH緩

31、沖液約80ml,在沸水浴中邊加熱邊攪拌直至完全溶解。冷卻后轉入100ml容量瓶中，用相應緩沖液定容至刻度。此溶液在4oC冰箱貯存，有效期為3天。0.4 mol/L三氯乙酸(CCl3-COOH)溶液(沉淀試劑)稱取三氯乙酸65.4g，用蒸餾水溶解并定容至1000ml。儀器和設備 除普通實驗室儀器外，還應有：恒溫水浴鍋(400.2) oC。分光光度計酸度計精度0.01pH 。分析天平感量0.1mg。秒表或定時鐘。測定步驟標準曲線繪制按表A.1，分別吸取標準酪氨酸標準使用溶液、0.4mol/L碳酸鈉溶液和稀Folin試劑于各管中（每管號平行作3個樣），混勻。將標準管同時置于40oC水浴，反應20mi

32、n，取出，迅速冷卻至室溫，用10mm比色杯，以空白管（0號管）調(diào)儀器零點，在分光光度計波長660nm處測吸光度。以酪氨酸量為橫座標，以吸光度為縱座標，繪制標準曲線，獲得線性回歸方程。當吸光度為1時的酪氨酸量（g）即為比色常數(shù)K值。線性回歸系數(shù)（r）應在0.9990以上時方可使用（否則須重做）。對每個新配制的Folin試劑制作新的標準曲線。表A.1酪氨酸標準曲線管號標準酪氨酸使用溶液0.4mol/L碳酸鈉溶液(ml)稀Folin試劑(ml)濃度（g/ml）吸取量（ml）001.05.01.01101.05.01.02201.05.01.03301.05.01.04401.05.01.05501.

33、05.0 1.06601.05.0 1.0樣品的測定待測酶液的制備固體酶：根據(jù)樣品酶活大小，稱取2g10g固體酶樣，精確至0.1mg，加入40200ml蒸餾水，溶解后置40oC水浴浸提30min，用濾紙過濾，再根據(jù)樣品酶活性大小，二次稀釋至適宜濃度（使供試樣液與空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之間，下同）。液體酶：精確量取液體酶若干ml，根據(jù)樣品酶活力大小，直接用蒸餾水稀釋至適宜濃度，待測。測定程序取三支15150mm試管（一支空白管，二支樣品管）。分別向三支試管中準確加入稀釋好的待測酶液1.0ml 。將三支試管放入（400.2）oC水浴中預熱5min，同時將測定底物（1%酪素溶液）置同一

34、溫度水浴中預熱5min。分別向二支樣品管中加入1.0ml 1%酪素溶液，準確計時，反應10min，取出。迅速、準確向三支試管中加入2ml TCL（沉淀試劑），于空白管中加入1.0ml1%酪氨酸溶液，搖勻。將三支試管繼續(xù)置（400.2）oC水浴中放置10min，取出，迅速冷卻至室溫。三支試管中反應液用濾紙（Whatman1號濾紙或新華1號濾紙）過濾。另取三支18180mm的試管（一支空白，二支樣品管）分別吸取上述相應的濾出液1.0ml，0.4mol/L碳酸鈉溶液5.0ml，稀Foiln試劑1.0ml，搖勻，置（400.2）oC水浴中放置20min，取出，迅速冷卻至室溫。以空白管（對照）調(diào)儀器零點

35、，在分光光度計波長660nm下，用10mm比色杯，分別測二支樣品管中樣液的吸光度，取平均值。通過查標準曲線或用線性回歸方程求出生成的酪氨酸的含量。酶活力計算按照下式(A.1)計算樣品蛋白酶活力：AKV4NX1 (A.1) 1W10 式中：X1蛋白酶活力，u/g；A樣品與空白的的吸光度差K比色常數(shù)；V樣品提取時加入水的量（ml）；4酶反應體系總體積（ml）；N樣品二次稀釋時的稀釋倍數(shù)；1參與反應的酶量（ml）；W樣品重量（g/ml）；10反應時間（min）。 精密度同一試樣兩次測試結果的絕對差值，不得超過算術平均值的10%。（規(guī)性附錄）木聚糖酶活力的測定方法原理木聚糖酶在一定的溫度和pH條件下，

36、催化木聚糖水解生成二糖、木糖等還原糖。在堿性、煮沸條件下，能將3,5-二硝基水酸中硝基還原成橙黃色的氨基化合物，其顏色的深淺與還原糖（以木糖計）含量成正比。通過其在550nm測其吸光度，可得到還原糖生成量，計算出木聚糖酶的酶活力。以此代表木聚糖酶的總酶活力。酶活單位定義在（400.2）、pH 5.0條件下，在1min水解木聚糖底物，產(chǎn)生相當于1微克木糖的還原糖的酶量，為1個酶活單位，以u/g(u/ml)表示。試劑和溶液除非另有規(guī)定，試驗中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。1%（W/V）木聚糖底物 精確稱取燕麥木聚糖(xylan from Oat spelts, 美國Sigma公司)

37、1.0000 g，溶于80ml蒸餾水中，水浴加熱至溶解，冷卻后轉入100 ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。此溶液在4oC冰箱貯存，有效期為3天。磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液: 甲液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4.2H2O ）35.61 g, 用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。 乙液：稱取檸檬酸（C6H8O7.H2O）21.01 g，用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。. 使用溶液：取甲液515ml，加乙液485ml混合均勻，用pH計校正至pH為（5.0 0.05）,備用。3,5二硝基水酸（DNS）試劑: 取酒石酸鉀鈉182g，溶于500ml蒸餾水中，加熱。于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水酸

38、6.3g， 氫氧化鈉 10g，苯酚5g，無水亞硫酸鈉5g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，混勻，過濾，貯于棕色試劑瓶中，于暗處放置1周后使用。 :注：在黑色或棕色瓶中于室溫下貯存，該試劑最多穩(wěn)定6個月。1%(W/V)木糖標準貯備溶液稱取預先于（1032）下干燥至恒重的木糖1.0000 g，用蒸餾水溶解后定容至100 ml，即為1%濃度的木糖標準溶液。木糖標準使用溶液分別吸取1%木糖標準貯備溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml置50ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，制成每ml分別含木糖200g、400g、600g、800g、1000g 、120

39、0 g的標準使用溶液。儀器和設備 除普通實驗室儀器外，還應有：恒溫水浴鍋(400.2) oC。分光光度計酸度計精度0.01pH 。分析天平感量0.1mg。秒表或定時鐘。測定步驟標準曲線的制作按表B.1，分別吸取標準木糖使用溶液、緩沖液和DNS試劑于各管中（每管號平平行3個樣），混勻。將標準管同時置于沸水浴中，反應7min，取出，迅速冷卻至室溫，準確加入蒸餾水10ml，混勻。用10mm比色杯，以空白管（0號管）調(diào)儀器零點，在分光光度計波長550nm處測吸光度。以木糖量為橫座標，以吸光度為縱座標，繪制標準曲線，獲得線性回歸方程。線性回歸系數(shù)（r）應在0.9990以上時方可使用（否則須重做）。對每個

40、新配制的DNS溶液制作新的標準曲線。表B.1木糖標準曲線管號標準木糖使用溶液磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(ml)DNS試劑吸取量(ml)濃度（g/ml）吸取量（ml）000.501.53.012000.501.53.024000.501.53.036000.501.53.048000.501.53.0510000.501.5 3.0612000.501.53.0樣品的測定待測酶液的制備固體酶：根據(jù)樣品酶活大小，稱取2g10g固體酶樣，精確至0.1mg，加入40200ml蒸餾水，溶解后置40oC水浴浸提30min，用濾紙過濾，再根據(jù)樣品酶活性大小，二次稀釋至適宜濃度（使供試樣液與空白液的吸光度之差落

41、在0.2-0.4之間，下同）。液體酶：精確量取液體酶若干ml，根據(jù)樣品酶活力大小，直接用蒸餾水稀釋至適宜濃度，待測。操作程序取三支18180mm試管（一支空白管。二支樣品管）。分別向三支試管中準確加入稀釋好的待測酶液0.50ml 。分別向三支試管中準確加入pH 5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（B.2.2）1.0ml。將三支試管放入（400.2）oC水浴中預熱5min，同時將測定底物（1%木聚糖溶液）置同一溫度水浴中預熱5min。分別向二支樣品管中加入0.5ml1%木聚糖溶液，向空白管中加入3ml DNS試劑，準確計時，反應10min，取出。迅速、準確向二支樣品管中加入3ml DNS試劑，于空白

42、管中加入0.5ml1%木聚糖溶液，搖勻。將三支試管同時放入沸水浴中，待水浴中水重新沸騰時開始準確計時，反應7min，取出，迅速冷卻至室溫。向三支試管中各加入10ml蒸餾水，混勻。以空白管（對照液）調(diào)儀器零點，在分光光度計波長550nm下，用10mm比色杯，分別測二支樣品管中樣液的吸光度，取平均值。通過查標準曲線或用線性回歸方程求出還原糖的含量。酶活力計算按照下式（B.1）計算樣品的木聚糖酶的活力：AVNX1 (B.1) 0.5W10 式中：X1木聚糖酶活力，u/g；A根據(jù)吸光度在標準曲線上查得（或從回歸方程計算出）的還原糖生成量，g；V樣品提取時加入水的量（ml）；N樣品二次稀釋時的稀釋倍數(shù)；

43、0.5參與反應的酶量（ml）；W樣品重量（g）；10反應時間（min）。精密度同一試樣兩次測試結果的絕對差值，不得超過算術平均值的10%。（規(guī)性附錄）-葡聚糖酶活力的測定方法原理葡聚糖酶在一定的溫度和pH條件下，催化葡聚糖水解生成分子量較小的低聚糖、葡萄糖等還原糖。在堿性、煮沸條件下，能將3,5-二硝基水酸中硝基還原成橙黃色的氨基化合物，其顏色的深淺與還原糖（以葡萄糖計）含量成正比。通過其在550nm測其吸光度，可得到還原糖生成量，計算出葡聚糖酶的酶活力。以此代表葡聚糖酶的酶活力。酶活單位定義在（400.2）、pH 5.0條件下，在1min水解-葡聚糖底物，產(chǎn)生相當于1微克葡萄糖的還原糖的酶量

44、，為1個酶活單位，以u/g (u/ml)表示。試劑和溶液除非另有規(guī)定，試驗中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。1%（W/V）葡聚糖底物精確稱取葡聚糖(-glucan,from barley,Sigma 公司產(chǎn))1.0000 g，溶于80ml蒸餾水中，水浴加熱至溶解，冷卻后轉入100 ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。此溶液在4oC冰箱貯存，有效期為3天。磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液: 甲液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4.2H2O ）35.61 g, 用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。 乙液：稱取檸檬酸（C6H8O7.H2O）21.01 g，用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。. 使

45、用溶液：取甲液515ml，加乙液485ml混合均勻，用pH計校正至pH為（5.0 0.05）,備用。3,5二硝基水酸（DNS）試劑: 取酒石酸鉀鈉182g，溶于500ml蒸餾水中，加熱。于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水酸6.3g， 氫氧化鈉 10g，苯酚5g，無水亞硫酸鈉5g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，混勻，過濾，貯于棕色試劑瓶中，于暗處放置1周后使用。 :注：在黑色或棕色瓶中于室溫下貯存，該試劑最多穩(wěn)定6個月。1%(W/V)葡萄糖標準貯備溶液稱取預先于（1032）下干燥至恒重的葡萄糖1.0000 g，用蒸餾水溶解后定容至100 ml，即為1%濃度的葡萄糖標準溶液。葡萄糖標

46、準使用溶液分別吸取1%葡萄糖標準貯備溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml置50ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，制成每ml分別含葡萄糖200g、400g、600g、800g、1000g 、1200 g的標準使用溶液。儀器和設備 除普通實驗室儀器外，還應有：恒溫水浴鍋(400.2) oC。分光光度計酸度計精度0.01pH 。分析天平感量0.1mg。秒表或定時鐘。測定步驟標準曲線的制作按表C.1，分別吸取標準葡萄糖使用溶液、緩沖液和DNS試劑于各管中（每管號平平行3個樣），混勻。將標準管同時置于沸水浴中，反應7min，取出，迅速冷卻至室溫，準確加入蒸餾水10

47、ml，混勻。用10mm比色杯，以空白管（對照液）調(diào)儀器零點，在分光光度計波長550nm處測吸光度。以葡萄糖量為橫座標，以吸光度為縱座標，繪制標準曲線，獲得線性回歸方程。線性回歸系數(shù)（r）應在0.9990以上時方可使用（否則須重做）。對每個新配制的DNS溶液制作新的標準曲線。表C.1葡萄糖標準曲線管號標準葡萄糖使用溶液磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(ml)DNS試劑吸取量(ml)濃度（g/ml）吸取量（ml）000.501.53.012000.501.53.024000.501.53.036000.501.53.048000.501.53.0510000.501.5 3.0612000.501.53.

48、0樣品的測定待測酶液的制備固體酶：根據(jù)樣品酶活大小，稱取2g10g固體酶樣，精確至0.1mg，加入40200ml蒸餾水，溶解后置40oC水浴浸提30min，用濾紙過濾，再根據(jù)樣品酶活性大小，二次稀釋至適宜濃度（使供試樣液與空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之間，下同）。液體酶：精確量取液體酶若干ml，根據(jù)樣品酶活力大小，直接用蒸餾水稀釋至適宜濃度，待測。操作程序取三支18180mm試管（一支空白管。二支樣品管）。分別向三支試管中準確加入稀釋好的待測酶液0.50ml 。分別向三支試管中準確加入pH 5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（B.2.2）1.0ml。將三支試管放入（400.2）oC水浴中預

49、熱5min，同時將測定底物（1%葡聚糖溶液）置同一溫度水浴中預熱5min。分別向二支樣品管中加入0.5ml1%葡聚糖溶液，向空白管中加入3ml DNS試劑，準確計時，反應10min，取出。迅速、準確向二支樣品管中加入3ml DNS試劑，于空白管中加入0.5ml1%木聚糖溶液，搖勻。將三支試管同時放入沸水浴中，待水浴中水重新沸騰時開始準確計時，反應7min，取出，迅速冷卻至室溫。向三支試管中各加入10ml蒸餾水，混勻。以空白管（對照液）調(diào)儀器零點，在分光光度計波長550nm下，用10mm比色杯，分別測二支樣品管中樣液的吸光度，取平均值。通過查標準曲線或用線性回歸方程求出還原糖的含量。酶活力計算按

50、照下式（C.1）計算樣品的葡聚糖酶的活力：AVNX1 (C.1) 0.5W10 式中：X1葡聚糖酶活力，u/g；A根據(jù)吸光度在標準曲線上查得（或從回歸方程計算出）的還原糖生成量，g；V樣品提取時加入水的量（ml）；N樣品二次稀釋時的稀釋倍數(shù)；0.5參與反應的酶量（ml）；W樣品重量（g）；10反應時間（min）。精密度同一試樣兩次測試結果的絕對差值，不得超過算術平均值的10%。（規(guī)性附錄）纖維素（CMC）酶活力的測定方法原理纖維素酶在一定的溫度和pH條件下，將纖維素底物（CMC，羧甲基纖維素鈉）水解，釋放出還原糖。在堿性、煮沸條件下，能將3,5-二硝基水酸中硝基還原成橙黃色的氨基化合物，其顏色

51、的深淺與還原糖（以葡萄糖計）含量成正比。通過其在550nm測其吸光度，可得到還原糖生成量，計算出葡聚糖酶的酶活力。以此代表纖維素（CMC）酶的總酶活力。酶活單位定義在（400.2）、pH 4.2條件下，在1min水解羧甲基纖維素鈉底物，產(chǎn)生相當于1微克葡萄糖的還原糖的酶量，為1個酶活單位，以u/g(u/ml)表示。試劑和溶液除非另有規(guī)定，試驗中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。羧甲基纖維素鈉（CMCNa）中國醫(yī)藥公司化學試劑公司產(chǎn)，分析純，在25,2%水溶液粘度300800厘泊爾。磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液: 甲液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4.2H2O ）35.61 g, 用蒸餾

52、水溶解，并定容至1000ml。 乙液：稱取檸檬酸（C6H8O7.H2O）21.01 g，用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。. 使用溶液：取甲液414ml，加乙液586ml混合均勻，用pH計校正至pH為（4.2 0.05）,備用。1%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）溶液稱取1g羧甲基纖維素鈉，精確至1mg，緩緩加入pH為4.2 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液80ml，水浴加熱至全部溶解。冷卻后用2MHCL或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH到（4.2 0.05），攪拌均勻，定容至100ml，再用二層紗布過濾。此溶液在4oC冰箱貯存，有效期為3天。3,5二硝基水酸（DNS）試劑: 取酒石酸鉀鈉182g，溶于500m

53、l蒸餾水中，加熱。于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水酸6.3g， 氫氧化鈉 10g，苯酚5g，無水亞硫酸鈉5g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，混勻，過濾，貯于棕色試劑瓶中，于暗處放置1周后使用。 :注：在黑色或棕色瓶中于室溫下貯存，該試劑最多穩(wěn)定6個月。1%(W/V)葡萄糖標準貯備溶液稱取預先于（1032）下干燥至恒重的葡萄糖1.0000 g，用蒸餾水溶解后定容至100 ml，即為1%濃度的葡萄糖標準溶液。D.2.5 葡萄糖標準使用溶液分別吸取1%葡萄糖標準貯備溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml置50ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，制成

54、每ml分別含葡萄糖200g、400g、600g、800g、1000g 、1200 g的標準使用溶液。儀器和設備 除普通實驗室儀器外，還應有：恒溫水浴鍋(400.2) oC。D.3.2 分光光度計酸度計精度0.01pH 。分析天平感量0.1mg。秒表或定時鐘。測定步驟標準曲線的制作按表D.1，分別吸取標準葡萄糖使用溶液、緩沖液和DNS試劑于各管中（每管號平平行3個樣），混勻。將標準管同時置于沸水浴中，反應7min，取出，迅速冷卻至室溫，準確加入蒸餾水10ml，混勻。用10mm比色杯，以空白管（對照液）調(diào)儀器零點，在分光光度計波長550nm處測吸光度。以葡萄糖量為橫座標，以吸光度為縱座標，繪制標準

55、曲線，獲得線性回歸方程。線性回歸系數(shù)（r）應在0.9990以上時方可使用（否則須重做）。對每個新配制的DNS溶液制作新的標準曲線。表D.1葡萄糖標準曲線管號標準葡萄糖使用溶液磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(ml)DNS試劑吸取量(ml)濃度（g/ml）吸取量（ml）000.501.53.012000.501.53.024000.501.53.036000.501.53.048000.501.53.0510000.501.5 3.0612000.501.53.0樣品的測定待測酶液的制備固體酶：根據(jù)樣品酶活大小，稱取2g10g固體酶樣，精確至0.1mg，加入40200ml蒸餾水，溶解后置40oC水浴浸提30min，用濾紙過濾，再根據(jù)樣品酶活性大小，二次稀釋至適宜濃度（使供試樣液與空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之間，下同）。液體酶：精確量取液體酶若干ml，根據(jù)樣品酶活力大小，直接用蒸餾水